Artículo de método

Generación de hidrogeles a base de colágeno 3D para analizar el crecimiento y el comportamiento axonal durante el desarrollo del sistema nervioso

DOI:

10.3791/59481

⸱

25 de junio de 2019

 , 
1Molecular and Cellular Neurobiotechnology, Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), The Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), Parc Científic de Barcelona, 2Department of Cell Biology, Physiology, and Immunology, Universitat de Barcelona, 3Center for Networked Biomedical Research on Neurodegenerative Diseases (CIBERNED), 4Institute of Neuroscience, University of Barcelona

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, proporcionamos un método para analizar el comportamiento del crecimiento de axons en matrices 3D, imitando su desarrollo natural.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo utiliza colágeno natural tipo I para generar hidrogel tridimensional (3-D) para monitorear y analizar el crecimiento axonal. El protocolo se centra en el cultivo de pequeños trozos de cerebros de roedores embrionarios o postnatales tempranos dentro de un hidrogel 3D formado por el colágeno tipo I derivado del tendón de la cola de rata con porosidad específica. Las piezas de tejido se cultivan dentro del hidrogel y se enfrentan a fragmentos cerebrales específicos o agregados celulares modificados genéticamente para producir y secretar moléculas adecuadas para crear un gradiente dentro de la matriz porosa. Los pasos de este protocolo son simples y reproducibles, pero incluyen pasos críticos a considerar cuidadosamente durante su desarrollo. Además, el comportamiento de los axons en crecimiento se puede monitorear y analizar directamente utilizando un microscopio de contraste de fase o un microscopio de fluorescencia mono/multifoto después de la fijación mediante métodos inmunocitoquímicos.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los axónicos neuronales, que terminan en conos de crecimiento axonal, migran largas distancias a través de la matriz extracelular (ECM) del embrión sobre vías específicas para alcanzar sus objetivos apropiados. El cono de crecimiento es la porción distal del axón y estáespecializado para detectar el entorno físico y molecular de la célula 1,2. Desde un punto de vista molecular, los conos de crecimiento se guían por al menos cuatro mecanismos moleculares diferentes: atracción de contacto, quimioatracción, repulsión de contacto y quemorepulsión desencadenada por diferentes señales de orientación axonal3,4 , 5 , 6.Los procesos mediados por contacto pueden monitorizarse parcialmente en cultivos bidimensionales (2D) en sustratos micropatrones (por ejemplo, con rayas 7,8 o manchas9 que contengan las moléculas). Sin embargo, los axons pueden navegar a su objetivo de una manera no difusa mediante la sensación de varias moléculas atractivas y repulsivas de las células de la guía en el medio ambiente4,5,10. Aquí, describimos un método fácil de cultivo 3D para comprobar si una molécula secretada induce efectos chemorepulsivas o quimioatractivos en el desarrollo de axones.

Los primeros estudios tenían como objetivo determinar los efectos de las señales de orientación de axón utilizadas en cultivos explantados en matrices tridimensionales (3-D) para generar gradientes que simulaban en condiciones vivas11,12. Este enfoque, junto con los experimentos in vivo, permitió la identificación de cuatro familias principales de señales de orientación: Netrins, Slits, Semaphorins, y Ephrins4,5,6. Estas señales moleculares y otros factores13 están integradas por los axons en crecimiento, desencadenando la dinámica de los complejos de adhesión y transduciendo las fuerzas mecánicas a través del citoesqueleto14,15,16. Para generar gradientes moleculares en cultivos tridimensionales para la navegación axonal, investigadores pioneros utilizaron sustratos de coágulos plasmáticos17,que también se utilizaron para preparaciones de rodajas organotípicas18. Sin embargo, en 1958, se informó de un nuevo protocolo para generar hidrogeles de colágeno 3D para estudiar con los dispositivos de Maximow19,una plataforma de cultivo, utilizada en varios estudios adecuados para observaciones microscópicas20. Otro estudio pionero informó el gel de colágeno como una herramienta para incrustar fibroblastos humanos para estudiar la diferenciación de fibroblastos en miofibroblastos en procesos de cicatrización de heridas21. Paralelamente, Lumsden y Davies aplicaron colágeno de la dermis bovina para analizar el efecto putativo del factor de crecimiento nervioso (NGF) en la orientación de las fibras nerviosas sensoriales22. Con el desarrollo de nuevas plataformas de cultivo (por ejemplo, placas multipozos) pordiferentes empresas y laboratorios, los cultivos de colágeno se adaptaron a estos nuevos dispositivos 6,23,24,25 ,26. Paralelamente, un extracto de material ECM derivado de la línea de células tumorales Engelbreth-Holm-Swarm se puso a disposición comercialmente para ampliar estos estudios27.

Recientemente, se han desarrollado varios protocolos para generar gradientes moleculares con funciones putativas en la orientación de axón utilizando hidrogeles 3D (por ejemplo, colágeno, fibrina, etc.) 28. Alternativamente, la molécula candidata puede ser inmovilizada a diferente concentración en una matriz porosa (por ejemplo, NGF29) o generada por el cultivo en una pequeña región de los agregados de células hidrogel 3D que segregan la molécula para generar una gradiente4,23,24,25,26. La última posibilidad se explicará en este protocolo.

El procedimiento presentado aquí es un método fácil, rápido y altamente reproducible basado en el análisis del crecimiento axonal en cultivos de hidrogel 3D del cerebro de ratón embrionario. En comparación con otros métodos, el protocolo es adecuado para investigadores no entrenados y se puede desarrollar completamente después de un breve entrenamiento (1-2 semanas). En este protocolo, primero aislamos el colágeno de las colas de rata adultas para generar matrices tridimensionales en las que los agregados celulares modificados genéticamente se cultivan frente al tejido neuronal embrionario. Estos agregados celulares forman gradientes químicos radiales de una molécula candidata que provoca una respuesta para los axones en crecimiento. Por último, la evaluación de los efectos de la molécula en los axónicos en crecimiento se puede realizar fácilmente mediante una microscopía de contraste de fase o, alternativamente, métodos inmunocitoquímicos.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los experimentos con animales se realizaron bajo las directrices y protocolos del Comité Ético de Experimentación Animal (CEEA) de la Universidad de Barcelona, y el protocolo para el uso de roedores en este estudio fue revisado y aprobado por el CEEA de la CEEA de la Universidad de Barcelona (aprobación de la CEEA #276/16 y 141/15).

1. Purificación del colágeno de la cola de rata

  1. Recoger colas de rata Sprague-Dawley adultas (8-9 semanas de edad) después de sacrificar al animal siguiendo las pautas éticas y enjuagar en 95% etanol. Colocar 2-4 colas sobre hielo (4oC) y mantenerlas cubiertas de hielo durante el proceso.
  2. Para obtener tendones de cola, fijar la cola en las vértebras más caudales de la cola usando un hemostat y comprimir la cola con un segundo hemostat situado alrededor de 5-7 mm desde el primero. Rompe la cola torciéndola bruscamente con ambos hemostats. Para ello, doble/desdoble las vértebras varias veces hasta que se rompa.
  3. Tire de las vértebras lentamente con el hemostat para separar los tendones de su vaina a medida que sale. En este momento, cortar tendones con tijeras pequeñas. Mantenga estas piezas de tendón en un plato estéril de 100 mm Petri sobre hielo.
  4. Repita la sujeción y deslizamiento durante el resto de la cola hasta que los tendones estén totalmente extraídos.
  5. Repita los pasos 1.2-1.4 para todas las colas obtenidas.
  6. Observe los tendones bajo un microscopio. Deseche los vasos sanguíneos cortando con tijeras pequeñas y sosteniendo con fórceps finos rectos para mejorar la pureza del tendón y enjuague los tendones 3 veces con agua ultrapura.
  7. Recoger 3-4 g de tendones húmedos. Disolver los tendones en 150 ml de ácido acético glacial al 3% a 4 oC en un matraz cónico de vidrio de 200-250 ml durante 24-36 h, bajo agitación suave.
  8. Centrífuga a 20.000 x g durante 1 h. En paralelo, prepare la membrana de tubos de diálisis cortando una pieza de alrededor de 10-15 cm de longitud y hervirla en agua ultrapura que contenga 1 mM de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) durante 15 minutos. A continuación, enjuague suavemente la membrana de diálisis con agua ultrapura.
  9. Después de la centrifugación, recoja el sobrenadante en la membrana de tubos de diálisis por decantación. El pellet contiene material insoluble ácido (proteínas no colágenos) y el sobrenadante contiene proteínas de colágeno solubles.
  10. Dialyze el sobrenadante contra 2 L de águila media esencial mínima de 0,1x estéril (MEM), pH 4.0 en un vaso de vidrio de 2-5 L. Dialyze durante 3 días. Cambie la solución MEM 0,1x al menos dos veces al día comprobando el pH en cada cambio antes de usar. Si el pH se ha vuelto básico, modifíquelo con unas gotas de ácido acético de 0,1 M hasta que el pH sea 4,0.
  11. Después de la diálisis, agregue antibióticos (1,5 ml de penicilina/estreptomicina (Pen-Strep)) a la solución de colágeno dializado. Hacer alícuotas de 5 ml de la solución de callos y almacenar a 4 oC.
    NOTA: A partir de este punto, todos los procedimientos de manipulación deben realizarse en condiciones estériles en una campana de flujo laminar.
  12. Proceda con la prueba de gelificación de la solución de colágeno preparada siguiendo los siguientes pasos.
    1. Dado que el colágeno en stock suele estar demasiado concentrado, preparar 3 diluciones de trabajo (75%, 50% y 25% solución de colágeno) diluyendo el stock en 0.1x MEM, pH 4.0. El volumen final recomendado para cada dilución de trabajo es de 5 ml. En cada condición, compruebe la concentración de proteínas utilizando un ensayo colorimétrico de proteínas.
    2. Colocar varios tubos centrífugos cónicos vacíos de 1,5 ml (uno para cada dilución de trabajo), 10 tubos MEM, 7,5% de solución de bicarbonato sódico y diferentes diluciones de trabajo de colágeno sobre hielo. Espere hasta que se enfríen.
    3. Añadir 40-50 l de 10 MEM a un tubo centrífugo frío (4 oC). A continuación, mezcle suavemente con 7-8 ml de solución de bicarbonato sódico.
    4. Añadir 310-330 l de una de las diferentes diluciones de colágeno a este tubo y mezclarsuavemente con la pipeta evitando cualquier formación de burbujas. Mantenga la mezcla de bicarbonato de colágeno-MEM-sodio sobre hielo (4 oC) durante al menos 5 minutos.
    5. Pipetear 10-25 l de la mezcla en una placa Petri de 35 mm.
    6. Colocar la placa Petri en la incubadora de CO2 a 37oC hasta que se observe la gelifación del hidrogel (a 15-20 min).
    7. Repita los pasos 1.12.3-1.12.6 para las diluciones de colágeno restantes en diferentes platos de Petri.
    8. Seleccione la dilución de trabajo de colágeno que represente los mejores resultados.
      NOTA: El mejor hidrogel gelizado debe tener una textura translúcida uniforme, color gris y no debe ser abultado o frito. En nuestra experiencia, una dilución de 3:1 (Colágeno: 0,1x MEM) genera los mejores resultados experimentales.

2. Preparación de células (COS1) Agregados genéticamente modificados para secretar una molécula candidata en hidrogeles de colágeno 3-D

  1. Placa 2 x 106 COS1 células en un 35 mm platos Deli e incubar con medio de cultivo completo compuesto por 100 ml de D-MEM que contiene 10% (vol/vol) suero bovino fetal inactivado por calor, 0,5% (wt/vol) glutamina y 1% (wt/vol) Pen/Strep en un cultivo celular incubadora, con el fin de alcanzar el 70-80% de confluencia durante la noche. Prepare un plato de Petri para cada procedimiento de transfección.
  2. Al día siguiente, las células COS1 transfectos con el ADN codifican la molécula candidata (Netrin-1 o Sema3E) utilizando el método de transfección basado en liposomas siguiendo las instrucciones del fabricante.
    1. Para ello, mezcle 250 ml de medio libre de suero y ADN (1-2 g por condición) en un tubo centrífugo de 1,5 ml (tubo de ADN) y mezcle. Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 5 min. Preparar un segundo tubo (tubo liposomal) añadiendo 240 ml del medio libre de suero y 10 ml del reactivo de transfección liposomal. Incubar a RT durante 5 min.
    2. Después de la incubación, agregue el contenido del tubo de ADN al tubo liposomal y mezcle suavemente. Ahora incubar a RT durante 15 minutos. Reemplace el medio en las células cultivadas con 1,5 ml del medio libre de suero y agregue la mezcla de liposomas de ADN a la placa Petri lentamente en gota. Incubar durante 3 h en la incubadora de cultivo celular CO 2.
  3. Después de 3 h de incubación de transfección, sustituya el medio por el medio de cultivo completo e incubadurante durante la noche en la incubadora.
  4. Al día siguiente, enjuague las células con 0,1 M de solución salina tamponada de fosfato de Dulbecco (D-PBS), trate los cultivos con trippsina-EDTA (800 ml por cada plato durante 5-15 minutos en la incubadora de CO 2) y recoja las células separadas con 15 ml de medio de cultivo completo.
  5. Centrifugar las células a 4oC a 130 x g durante 5 min. Después de la centrifugación, retire los medios y conserve el pellet que contiene células COS1 en hielo.
  6. Repita los pasos 1.12.3-1.12.6 para preparar la mezcla de trabajo de colágeno.
  7. Añadir 100-150 l de la mezcla de colágeno al pellet de las células transsemicadas y mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo y esparcir 45-50 l de esta mezcla en una placa Petri (35 mm de diámetro) para formar una banda uniforme de células de colágeno de alrededor de 1-1,5 cm de longitud. Colocar el plato en la incubadora a 37oC (5% CO2) hasta que se observe la gelidación (a 15-20 min).
  8. Preparar una segunda tira que contenga células de control (transfección simulada) en un segundo plato de cultivo y placarla en la incubadora (15-20 min) y cuando se complete la gelidación añadir 3-4 ml de COS1 COS1 caliente medio de cultivo completo a cada plato que contenga el gelizado las tiras de células de colágeno y mantenerlas en la incubadora de cultivo celular de CO 2. A partir de entonces, corte las tiras de células de colágeno para generar pequeñas piezas cuadradas (400 a 500 m de longitud) usando un bisturí fino o un helicóptero de tejido.
  9. Transfiera todas las secciones de la misma condición de transfección a una placa Petri que contenga 3-3,5 ml de medios de cultivo neuronal (NCM) y compruebe bajo un microscopio de disección la calidad de las piezas. Una vez más, manténgalos en la incubadora de cultivo celular de CO 2.
    NOTA: El medio de cultivo neuronal consiste en medio neurobasal que contiene 1-5% (vol/vol) suero de caballo inactivado por calor, 2 mM de glutamina, 0,5% (wt/vol) glucosa, 1% (wt/vol) Pen-Strep solución y 0.044% (wt/vol) NaHCO3. Asegúrese de que el pH esté entre 7,2-7,3.

3. Generación de Explant embrionario para el cultivo

  1. Esterilice las herramientas quirúrgicas (tijeras, mango de la cuchilla del bisturí, fórceps rectos y curvos) autoclavendo siguiendo las pautas de esterilización rutinarias. En paralelo preparar 500 ml del tampón equilibrado de solución de sal-glucosa de Hank y 4-5 platos de Petri (100 mm de diámetro) que contienen 10 ml de HBSS-G. Coloque estas placas sobre hielo (4oC).
  2. Sacrificar a la rata embarazada (día embrionario 16.5) fuera de la zona estéril, siguiendo los procedimientos éticos aprobados. Corta los cuernos embrionarios con tijeras de la cavidad abdominal y colócalos en un plato grande de Petri que contenga HBSS-G frío.
  3. Coloque el plato en la campana de flujo laminar y extraiga los embriones con fórceps rectos. Colóquelos en un plato nuevo que contenga HBSS-G frío. A continuación, retire la piel del embrión usando pequeños fórceps y diseccione cuidadosamente el cerebro usando los fórceps curvos y rectos. Colóquelos en un plato que contenga HBSS-G frío.
  4. Bajo un microscopio de disección, corta el cerebro por la mitad a lo largo de la línea media para separar ambos hemisferios con el bisturí o tijeras finas y eliminar el diencéfalo, las meninges y los vasos sanguíneos de las piezas cerebrales con fórceps finos.
  5. Repita los pasos 3.3-3.4 con el resto de los embriones. No retrase la disección durante más de 2 h para preservar la calidad del tejido.
  6. Limpie todas las partes del helicóptero de tejido con 100% de etanol (especialmente la placa de corte de politetrafluoroetileno (PTFE) y la cuchilla de afeitar). Mantenga el helicóptero de tejido en la campana de flujo laminar bajo iluminación UV durante 15 minutos.
  7. Transfiera cada pieza de tejido (por ejemplo, corteza con hipocampo) a la placa de corte del helicóptero de tejido. Para el hipocampo, colóquelo perpendicular a la cuchilla de afeitar y obtenga secciones de tejido de 450-500 m de espesor.
  8. Preparar varios platos Petri de 35 mm con 3-4 ml de NCM completo y transferir piezas de tejido de la placa de chopper de tejido a los platos Petri. Muchos platos pueden ser necesarios ya que las regiones de interés se diseccionan.
  9. Terminar la disección de tejido en el MNC completo usando agujas finas de tungsteno. Compruebe la calidad de las rodajas obtenidas bajo el microscopio de disección. Asegúrese de que las capas son claramente identificables en la óptica de campo oscuro y diseccionar la región de interés (por ejemplo, la región de CA del hipocampo) con agujas de tungsteno. Deseche las rodajas dañadas. Mantenga los explantes hipocampales en medio NCM completo en la incubadora de CO 2.

4. Preparación de cocultivos 3D en hidrogeles de colágeno

  1. Coloque varias placas de cultivo estériles de 4 pocillos en la campana de flujo laminar y prepare una mezcla de trabajo de colágeno como se indicó anteriormente en los pasos 1.12.2-1.12.6.
  2. Colocar 15-20 l de la mezcla de hidrogel en la parte inferior de un pozo para producir una base circular de colágeno. Repita este paso para el resto de los pozos. No prepare más de cinco placas al mismo tiempo para evitar la evaporación excesiva de líquidode la base de hidrogel.
  3. Conservar los platos en la incubadora hasta que se observe la gelación completa (15-20 min) y sacar las placas de la incubadora sólo cuando se complete la gelidación. Compruebe la calidad del colágeno gelizado.
  4. Transfiera una pequeña pieza de agregado de células COS1 con una pipeta. Colóquelo en la base del hidrogel y coloque una pieza de tejido en la misma base con una pipeta cerca de la pieza de las células agregadas en un tamaño explanta.
  5. Preparar una nueva mezcla de colágeno de trabajo sobre hielo como en los pasos 1.12.2-1.12.6.
  6. Pipetear suavemente 15-20 l de esta nueva mezcla y cubrir el explant y el agregado celular. Se observará un cultivo de hidrogel similar a un sándwich. En este momento, reorientar la explantación con una aguja de tungsteno fino (¡no toque el agregado de celda COS1!), por lo que se enfrenta al agregado de celda a 500-600 m.
  7. Devolver la placa a la incubadora hasta que se observe la gelidación (10-15 min), y 0,5 ml de NCM completo complementado con suplemento de 2% B27y mantener los cultivos durante 36 a 48 h en la incubadora (37 oC, 5% CO 2).

5. Fijación de cocultivos agregados de células explantas y procedimiento inmunocitoquímico

  1. Después de 36-48 h de incubación, retire el medio y enjuague con 0.1 M de fosfato salina tamponada (PBS), pH 7.3. A partir de entonces, fijar los cultivos durante 1 h con 4% de paraformaldehído en tampón de fosfato de 0,1 M (PB), pH 7,3, a 4 oC.
  2. Retire el fijador y enjuague suavemente los cultivos 3-4 veces (10-15 min cada uno) en 0,1 M PB, pH 7,3.
  3. Separe el sándwich de hidrogel de la parte inferior del pozo con espátula o fórceps. Transfiera el bloque de colágeno con un pincel fino a una placa de cultivo de 6 pocillos que contenga 0,1 M PBS con un detergente no iónico al 0,5%.
  4. Incubar hidrogeles flotantes en la solución de bloqueo (10% suero, 0,5% tensioactivo no iónico y 0,2% de gelatina en 0,1 M PBS) durante 2-3 h a RT con agitación suave.
  5. Enjuague 3 veces (10-15 min cada uno) con 0,1 M PBS que contenga un tensioactivo no iónico al 0,5%.
  6. Incubar con anticuerpo primario diluido en PBS que contenga un 5% de suero, un tensioactivo no iónico al 0,5%, una gelatina al 0,2% y un 0,02% de azida sódica. Incubar con el anticuerpo primario durante 36-48 h a 4oC en una coctelera.
    NOTA: Por lo general, se utiliza un anticuerpo contra la clase III de la tubulina (-TUJ-1) (diluido 1:2.000) para definir el crecimiento axonal en cultivos de hidrogel 3-D.
  7. Después de la incubación, enjuague como en el paso 5.5.
  8. Incubar con anticuerpo secundario durante 4 h a RT (o 6-7 h a 4oC) sobre una coctelera diluida en suero del 5%, un tensioactivo no iónico al 0,5% y una gelatina al 0,2%. En este experimento se utiliza un anticuerpo biotinilado antiratón de caballo (diluido 1:200).
  9. Enjuague los cultivos como en 5.5.
  10. Incubar los cultivos durante 2 días a 4 oC con solución compleja de avidina-biotina (ABC) 1:100 diluida en PBS que contiene un 5% de suero, un tensioactivo no iónico al 0,5% y una gelatina al 0,2%. Alternativamente, utilice la peroxidasa de rábano picante (HRP) con la etiqueta streptavidina (diluida 1:300-400) en el mismo búfer.
  11. Enjuague los cultivos como se describe en 5.5.
  12. Enjuague los cultivos varias veces con un tampón Tris-HCl de 0,1 M, pH 7,6 durante 1 h.
  13. Incubar los cultivos con 0,03% de solución de tetrahidrocloruro de diaminobenzidina (DAB) al 0,3 o-diaminobenzidina en 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6.
  14. Añadir 5-8 l de 1% H2O2 y esperar 10-15 min. Monitorear el desarrollo de DAB bajo un microscopio usando un objetivo de 4-10x.
  15. Detenga la reacción eliminando la solución DAB con un tampón Tris-HCl de 0,1 M, pH 7.6.
  16. Enjuague los cultivos en PBS durante 30 min (varios cambios).
  17. Monte los hidrogeles en portaobjetos de vidrio utilizando medios de montaje acuosos.
  18. Analice la longitud y distribución de los axones dentro del hidrogel utilizando el plug-in de análisis Sholl o con el plug-in NeuriteJ para el software ImageJ30.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos una metodología ampliamente accesible para estudiar el crecimiento axonal en cultivos de colágeno de hidrogel 3-D del sistema nervioso de ratón embrionario. Con este fin, aislamos el colágeno de las colas de rata adultas para generar matrices tridimensionales en las que cultivamos agregados celulares modificados genéticamente expresando Netrin-1 o Sema3E confrontados con tejido neuronal embrionario (por ejemplo, región CA del hipocampo). Estos agregados celulares formaron un gradiente distribuido radial...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El crecimiento de los axons en desarrollo es principalmente invasivo e incluye la degradación y remodelación de ECM. Utilizando el procedimiento presentado aquí, los investigadores pueden obtener una matriz 3D homogénea formada por el colágeno natural tipo I en el que los axons (o células) pueden responder a un gradiente químico secretado por células modificadas genéticamente como lo hacen in vivo. Diferentes respuestas axonales a gradientes de señales atractivas o inhibitorias (proteínas, lípidos, etc.) se pueden compar...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen a Tom Yohannan por el asesoramiento editorial y a M. Segura-Feliu por la asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por el Programa CERCA y por la Comisión de Universidades e Investigación del Departamento de Innovación, Universidades y Empresa de la Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Investigación, Innovación y Universidad de España (MEICO) a través de BFU2015-67777-R y RTI2018-099773-B-100, la Red Española de Morones (Prionet España AGL2017-90665-REDT), y el Instituto Carlos III, CIBERNED ( PRY-2018-2).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Material
3,3′-Diaminobencidina tetraclorhidrato 10 mg comprimidos (DAB)SigmaD5905
Ratas Sprague-Dawley adultas (8 a 9 semanas de edad) Criffa-Credo, Lyon, Francia
Complejo avidina-biotina-peroxidasa (ABC)Vector LabsPK-4000
B27 suplemento sin suero 50x Invitrogen17504-044
Kit de ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (BCA)Pierce23225
vectores de plásmidos de ADNc líneas celulares
COS1ATTCCRL-1570
D-(+)-glucosaSigma16325
D-(+)-glucosa (solución al 45% en agua) para medio neurobasal completoSigmaG8769
D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) para el medio de cultivo COS1Invitrogen41966-029
Dulbecco' s solución salina tamponada con fosfato 10x (sin Ca2+ y Mg2++) (D-PBS) para cultivosInvitrogen14200
Ethanol merck108543
Sal disódica disolutática de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)SigmaE5134
Medios de montaje de fluorescencia (p. ej., Fluoromount-G o similar)Ciencias de la microscopía electrónica (EMS)17984-25
Gelatina en polvo SigmaG1890
Ácido acético glacial (Panreac, n.º de cat. 211008)Panreac211008
Hank' s solución salina equilibrada  Invitrogen24020083
Suero fetal bovino inactivado por calor Invitrogen10108-165
Suero de caballo inactivado por calor Invitrogen26050-088
Peróxido de hidrógeno (H2O2, 32 a 33% en agua)Sigma316989
L-glutamina 200 mM solución (100x) para medio completo Neurobasal y COS1Invitrogen25030-024
Lipofectamine 2000 ReactivoInvitrogen11668-019
Ratones hembras preñadas (día embrionario 12,5 a 16,5; E12.5-16.5) Criffa-Credo, Lyon, Francia
Medio Esencial Mínimo Modificado Eagle (MEM)Invitrogen11012-044
Anticuerpo monoclonal contra clase III β-tubulina (clon TUJ-1)Biolegend801201
N-2 suplemento 100x Invitrogen17502-048
Medio neurobasal Invitrogen21103049
Paraformaldehído Merck1,040,051,000
Penicilina/estreptomicina solución 100x Invitrogen15140-22
Solución salina tamponada con fosfato 10x (PBS) para inmunocitoquímicaInvitrogenAM9624
Anticuerpo secundario: caballo biotinilado anti-ratón Vector LabsBA-2000
Medio sin suero (Opti-MEM)Invitrogen11058-021
Azida sódica Panreac162712
Solución de bicarbonato de sodio 7,5% Invitrogen25080-094
Cultivo estéril grado H2O SigmaW3500
TritonTM X-100 SigmaX100
Trizma base SigmaT1503
Trypsin-EDTA (Tripsina (0.05% (wt/vol) con EDTA (1x)Invitrogen25300-054
Equipment
tijeras curvas grandes y 1 pequeña para disección Herramientas finas Instrumentos o similares
Tubos de centrífuga cónicos de 1,5 mL Eppendorf o similares
15 mL Corning o similar
2 hemostáticos   Herramientas finas Instrumentos o similares
2 tijeras de disección rectas pequeñasHerramientas finas Instrumentos o similares
Tubos de centrífuga de 200 mL para centrifugaciónNalgene o similar
Matraces
Vaso de precipitados
Placas de cultivo de 4 y 6 pocillos Nunc176740 y 140675
Bombas automáticas de pipetas y pipetas de plástico estériles desechables de 10 mL y 25 mL que contienen filtro.Gilson, Brand, Eppendorf o similar 
Pipetas automáticas, puntas de filtro estériles y puntas estériles actuales Gilson, Eppendorf o similar
con rotor fijo en ángulo Eppendorf, Beckman Coulter o similar
Centrífuga refrigerada de sobremesa con rotor de cubo oscilante (con adaptadores de tubo de 1,5, 15 y 50 mL)Eppendorf, Beckman Coulter o similar
Incubadora de cultivo celular a 37 ° C, 5% CO2 y 95% aire
Tubo de diálisis membrana de celulosaSigmaD9402
Cierres de tubos de diálisis SigmaZ37101-7
vidrio desechables
Microscopio de disección con óptica de campo oscuro Olympus SZ51 o similar 
Centrífuga refrigerada de alta velocidad Beckman Coulter o similar con rotor
Campana
Grandes 100 mm, 60 mm y pequeñas 35 mm Ø placas de cultivo celular Nunc  150679 , 150288 y 150318, respectivamente
Agitador magnético y barras de centrifugación magnéticasPicadora
Mickle
par de pinzas rectas finas y un par de pinzas curvas Herramientas finas Instrumentos o similares
Hojas de afeitar para el picador
Bisturíes (números 15 y 11)
Dos pares de espátulas finas para transferir trozos de colágeno y tejidoHerramientas finas Instrumentos o similares
1 Tubos de centrífuga cónicos de cónicos de vidrio estéril de 200 mLde vidrio de 2 LMicrocentrífuga de sobremesa Pipetas defijo en ángulode flujo laminar de tejidos McIlwain o similar Ingeniería de laboratorio de Un de tejidos

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ramón y Cajal, S. Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l'homme et chez les vertébrés. , (1894).
  2. Ramón y Cajal, S. Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos. , (1893).
  3. Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834(2010).
  4. Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).
  5. Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
  6. Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727(2011).
  7. Rosentreter, S. M., et al. Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules. Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).
  8. Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).
  9. von Philipsborn, A. C., et al. Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients. Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).
  10. Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents. Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).
  11. Jessell, T. M., Sanes, J. R. Development. The decade of the developing brain. Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).
  12. Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
  13. Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).
  14. Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. Force transmission in migrating cells. Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).
  15. Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).
  16. Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
  17. Castellani, V. B. Protocols for Neuronal Cell Culture. , Humana Press Inc. (2001).
  18. Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  19. Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
  20. Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics. In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).
  21. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).
  22. Lumsden, A. G., Davies, A. M. Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor. Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).
  23. Chedotal, A., et al. Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors. Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).
  24. Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
  25. Klein, R. Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity. Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).
  26. Wang, K. H., et al. Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching. Cell. 96 (6), 771-784 (1999).
  27. Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro. Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).
  28. Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP. Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).
  29. Kapur, T. A., Shoichet, M. S. Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).
  30. Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures. Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).
  31. Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
  32. Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).
  33. Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).
  34. Garnotel, R., et al. Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95). Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).
  35. Montolio, M., et al. A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration. Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).
  36. Garcia-Gareta, E. Collagen gels and the 'Bornstein legacy': from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration. Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Hidrogel de col genomigraci n neuronalgu a axonalcultivo celular en 3Dtroceado de tejidoan lisis inmunocitoqu micomicroscop a de contraste de fasesmicroscop a de fluorescencia

Artículos relacionados