Grabación de electroretinograma en larvas de pez cebra con electrodo de punta de esponja en forma de un cono de novela

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo que simplifica la medición de respuestas de luz electroretinograma evocados de pez cebra larval. Un electrodo de punta de esponja novela en forma de cono puede ayudar a hacer el estudio de desarrollo visual en el pez cebra larvas usando el electrorretinograma ERG más fácil de lograr con resultados confiables y de menor costo.

Resumen

El pez cebra (Danio rerio) es comúnmente usado como un modelo vertebrado en estudios del desarrollo y es particularmente conveniente para Neurociencia visual. Para la medición funcional de rendimiento visual, electroretinografía (ERG) es un método no invasivo ideal, que se ha establecido en especies de vertebrados superiores. Este enfoque se está utilizando cada vez más para examinar la función visual en el pez cebra, incluso durante las primeras etapas del desarrollo larvarias. Sin embargo, el electrodo de la grabación más comúnmente utilizado para larval pez cebra ERG hasta la fecha es el electrodo de la micropipeta de vidrio, que requiere equipo especializado para su fabricación, que presenta un desafío para los laboratorios con limitados recursos. Aquí, presentamos un protocolo ERG de larvas de pez cebra con un electrodo de punta de esponja en forma de cono. El nuevo electrodo es más fácil de fabricación y la manija, más económica y menos propensas a dañar el ojo larval de la micropipeta de vidrio. Como métodos previamente publicados de ERG, el protocolo actual puede evaluar la función retiniana externa a través de fotorreceptores y células bipolares respuestas, el a - y b-agita, respectivamente. El protocolo puede ilustrar claramente el perfeccionamiento de la función visual durante el desarrollo temprano de las larvas de pez cebra, apoyando la utilidad, sensibilidad y fiabilidad del electrodo nuevo. El electrodo simplificado es particularmente útil al establecer un nuevo sistema ERG o modificar aparatos ERG pequeño animal existentes para la medida del pez cebra, ayudando a los investigadores de la neurociencia visual con el pez cebra modelo de organismo.

Introducción

El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un modelo ampliamente utilizado vertebrado genético, incluidos los estudios de la neurociencia visual. La creciente popularidad de esta especie puede ser atribuida a ventajas como la facilidad de manipulación genética, el sistema visual vertebrado altamente conservado (tipos de neurona anatomía morfología y organización y genética subyacente), la alta fecundidad y un menor coste de explotación en comparación con modelos mamíferos¹. El no invasiva electroretinograma (ERGIO) ha sido utilizado clínicamente para evaluar la función visual humana y en el entorno de laboratorio para cuantificar l....

Protocolo

Electroretinograma (ERGIO) todos los procedimientos fueron realizados según las disposiciones del código nacional australiano de salud y Consejo de investigación médica de la práctica para el cuidado y uso de animales y fueron aprobados por el Comité institucional de ética animal en los Universidad de Melbourne.

1. preparación de buffer

1. Preparar 10 x buffer de goldfish Ringer (1.25 M de NaCl, KCl de 26 mM, 25 mm CaCl₂, 10 mM MgCl₂, 100 mM de glucosa, 100 mM HEPES) con agua de ósmosis inversa (RO). Ajustar el tampón de pH 7,8 y esterilizar el búfer de 0.22 μm filtro. Almacenar el buffer 10 x a 4 ° C como la so....

Resultados

Esta sección proporciona resultados representativos para ERG las mediciones diariamente de 4 a 7 PD. De PD 4, ERG respuestas muestran robustos componentes de la onda a y b, que surgen de fotorreceptores y células bipolares, respectivamente. A cada edad de prueba, la amplitud de la onda b aumentó con la intensidad de la luz (figura 2; Figura 3). En particular, la sensibilidad de la retina de pez cebra larvas a flashes dimmer aumentado con la e.......

Discusión

Lecturas funcionales como el ERG se han vuelto cada vez más importantes en la suite de herramientas que se utilizan para el estudio de larvas de pez cebra^8,9,12,14. Debido al pequeño tamaño del ojo de larvas de pez cebra, Micropipetas de vidrio se han adaptado como electrodos de grabación en más publicados protocolos^3,4,

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,22 y micro; m filter	Millex GP SLGP033RS		Filtra el 10× tampón de timbre de pez dorado para sterilizatio
jeringa de 1 mL	Terumo	DVR-5175	Con un 30G × ½ " aguja para añadir gotas de solución salina a la punta de la esponja del electrodo para evitar la sequedad y el aumento del ruido en las señales ERG.
30 G y veces; ½ " aguja	Terumo	NN * 3013R	Para agregar electrodo de punta de solución salina toteh sopnge.
Instrumentos de	bioamplificador	ML135	Para amplificar señales ERG
Solución de lejía	King White	9333441000973	Para un método alternativo de cloración con electrodos de astilla. Principio activo: 42 g/L de hipoclorito de sodio.
Baño de agua de circulación	Lauda-Ko?nigshoffen	MGW Lauda	Se utiliza para hacer la plataforma calentada por agua.
Cable de electrodo	Grass Telefactor	F-E2-30 Cables de	platino para conectar electrodos de alambre de plata al amplificador.
jaula de Faraday	Internacional		Para mantener la adaptación a la oscuridad y encerrar la configuración de Ganzfeld para mejorar la relación señal-ruido.
de cuenco Ganzfeld	Internacional		Estimulador de luz diseñado a medida: 36 mm de diámetro, tamaño de apertura de 13 cm.
LED Luxeon	Phillips Light Co.		Para la estimulación lumínica veinte LEDs de 5W y uno de 1W.
Micromanipulador	Harvard Apparatus	BS4 50-2625	Sostiene el electrodo de registro durante los experimentos.
Microsoft Office Excel	Microsoft	versión 2010	Software de hoja de cálculo para el análisis de datos.
Gel hidratante para ojos	GenTeal Gel	9319099315560	Se utiliza para cubrir las larvas de pez cebra durante las grabaciones para evitar la deshidratación. Principio activo: 0,3 % Hipromelosa y 0,22 % carbómero 980.
Pipeta Pasteur	Copán	200C	Se utiliza para transferir cuidadosamente larvas de pez cebra.
Sistema de adquisición de datos	Powerlab ADInstruments	ML785	Controla los LEDs para generar estímulos.
Esponja de PVA	MeiCheLe	R-1675	Para la colocación de larvas de pez cebra y la fabricación del electrodo en forma de cono ti
Solución salina	Aaxis Pacific 13317002		Para galvanoplastia electrodo de alambre de plata.
Alcance Software	ADInstrumentos	versión 3.7.6	Simultáneamente activa el estímulo a través del sistema Powerlab y recopila datos
Plata (alambre redondo fino)	A& E metal	0,3 mm	Se utiliza para hacer electrodos ERG de registro y referencia.
Microscopio estereoscópico	Leica	M80	Se utiliza para dar forma y medir el ápice de esponja en forma de cono (con barra de escala en el ocular). Colocado en la jaula de Faraday para la colocación de electrodos.
Tricaína	Sigma-aldrich	E10521-50G	Para anestesiizar larvas de pez cebra.
Plataforma calentada por agua	hecha		para mantener la temperatura de la plataforma de esponja y el cuerpo de la larva durante los registros de ERG

.Solución fotométrica de Solución fotométrica a medida