Grabación de electroretinograma en larvas de pez cebra con electrodo de punta de esponja en forma de un cono de novela

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo que simplifica la medición de respuestas de luz electroretinograma evocados de pez cebra larval. Un electrodo de punta de esponja novela en forma de cono puede ayudar a hacer el estudio de desarrollo visual en el pez cebra larvas usando el electrorretinograma ERG más fácil de lograr con resultados confiables y de menor costo.

Resumen

El pez cebra (Danio rerio) es comúnmente usado como un modelo vertebrado en estudios del desarrollo y es particularmente conveniente para Neurociencia visual. Para la medición funcional de rendimiento visual, electroretinografía (ERG) es un método no invasivo ideal, que se ha establecido en especies de vertebrados superiores. Este enfoque se está utilizando cada vez más para examinar la función visual en el pez cebra, incluso durante las primeras etapas del desarrollo larvarias. Sin embargo, el electrodo de la grabación más comúnmente utilizado para larval pez cebra ERG hasta la fecha es el electrodo de la micropipeta de vidrio, que requiere equipo especializado para su fabricación, que presenta un desafío para los laboratorios con limitados recursos. Aquí, presentamos un protocolo ERG de larvas de pez cebra con un electrodo de punta de esponja en forma de cono. El nuevo electrodo es más fácil de fabricación y la manija, más económica y menos propensas a dañar el ojo larval de la micropipeta de vidrio. Como métodos previamente publicados de ERG, el protocolo actual puede evaluar la función retiniana externa a través de fotorreceptores y células bipolares respuestas, el a - y b-agita, respectivamente. El protocolo puede ilustrar claramente el perfeccionamiento de la función visual durante el desarrollo temprano de las larvas de pez cebra, apoyando la utilidad, sensibilidad y fiabilidad del electrodo nuevo. El electrodo simplificado es particularmente útil al establecer un nuevo sistema ERG o modificar aparatos ERG pequeño animal existentes para la medida del pez cebra, ayudando a los investigadores de la neurociencia visual con el pez cebra modelo de organismo.

Introducción

El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un modelo ampliamente utilizado vertebrado genético, incluidos los estudios de la neurociencia visual. La creciente popularidad de esta especie puede ser atribuida a ventajas como la facilidad de manipulación genética, el sistema visual vertebrado altamente conservado (tipos de neurona anatomía morfología y organización y genética subyacente), la alta fecundidad y un menor coste de explotación en comparación con modelos mamíferos¹. El no invasiva electroretinograma (ERGIO) ha sido utilizado clínicamente para evaluar la función visual humana y en el entorno de laboratorio para cuantificar la visión en una gama de grandes y pequeñas especies como roedores y larvas de pez cebra^{2,3 , 4 , 5}. los componentes ERG más comúnmente analizados son la b-onda, originarios de fotorreceptores sensibles a la luz los interneurons bipolares, respectivamente y una onda. En el pez cebra larval, se establecen distintas capas en la retina por la fertilización después de 3 días (PD) y la morfología del cono fotorreceptores terminal sinapsis madura antes 4 PD^6,7. Función retiniana externa del pez cebra larval es establecida antes PD 4, lo que significa que el ERG es medible desde esta temprana edad a partir. Debido al corto ciclo experimental y las propiedades de alto rendimiento del modelo, el ERG se ha aplicado a larvas peces cebra para evaluación funcional de modelos de la enfermedad, análisis de desarrollo de visión y retina de color, estudio de ritmos circadianos visuales y las pruebas de drogas^8,9,10,11,12.

Sin embargo, enfoques actuales de pez cebra larvas ERG tiene algunas complejidades que pueden hacer más difícil de adoptar. Pez cebra larvas publicado ERG protocolos suelen utilizan una micropipeta de vidrio llenada de líquido conductor como la grabación de electrodo^3,4,5,13, que requiere de una micropipeta de alta calidad Consejo³. Equipo especializado, como un tirador de la micropipeta y en algunos casos a microforge, se requieren para su fabricación. Esto puede ser un desafío para los laboratorios con limitados recursos y conduce a costos adicionales incluso cuando la adaptación de los sistemas ERG animales pequeños disponibles para la medición de la función visual de larvas de pez cebra. Incluso cuando alisó, la punta de la micropipeta fuerte puede dañar la superficie de las larvas. Además, los titulares comercial micropipeta para electrofisiología se construyen con un alambre de plata fijado. Estos fijos los cables a ser apaciguados después de uso repetitivo, que requiere la compra de nuevos titulares a los costos de mantenimiento mayor.

Aquí describimos un método ERG usando un electrodo de la grabación de punta de esponja en forma de cono, que es particularmente útil para la adaptación establecidos pequeños animales ERG configuraciones para larvas de pez cebra ERG medidas. El electrodo se hace fácilmente usando esponja de acetato de polivinilo (PVA) común y fino hilo de plata sin necesidad de otros equipos especializado. Nuestros datos muestran que este nuevo electrodo es sensible y lo suficientemente confiable para demostrar el desarrollo funcional de circuitos neuronales retinianos en el pez cebra de larvas entre 4 y 7 PD. Este electrodo de punta de esponja económico y práctico puede ser útil a los investigadores establecer nuevos sistemas ERG o modificación de sistemas existentes de pequeños animales, estudios de pez cebra.

Protocolo

Electroretinograma (ERGIO) todos los procedimientos fueron realizados según las disposiciones del código nacional australiano de salud y Consejo de investigación médica de la práctica para el cuidado y uso de animales y fueron aprobados por el Comité institucional de ética animal en los Universidad de Melbourne.

1. preparación de buffer

1. Preparar 10 x buffer de goldfish Ringer (1.25 M de NaCl, KCl de 26 mM, 25 mm CaCl₂, 10 mM MgCl₂, 100 mM de glucosa, 100 mM HEPES) con agua de ósmosis inversa (RO). Ajustar el tampón de pH 7,8 y esterilizar el búfer de 0.22 μm filtro. Almacenar el buffer 10 x a 4 ° C como la solución stock³.
   Nota: 10 x buffer de Ringer puede usarse dentro de 3 meses.
2. En el día del experimento, hacer 1 x buffer de goldfish Ringer diluyendo 10 x buffer de goldfish Ringer con agua de ósmosis inversa.
   Nota: 1 x buffer de goldfish Ringer se utiliza para saturar la esponja PVA, incluyendo la esponja usada para la colocación de larvas peces cebra y la esponja en la punta del electrodo de registro.

2. preparación del electrodo

1. Prepare el electrodo de la grabación de esponja en forma de cono.
   1. Corte el extremo macho de la extensión del cable de electrodo de platino y retire el extremo 10 mm de la capa de aislamiento de politetrafluoroetileno externo utilizando una hoja de bisturí. Tenga cuidado de no para dañar el cable interior del plomo del electrodo.
   2. Corte una longitud de 40 mm de alambre de plata (0,3 mm de diámetro) y fije esto a la punta del electrodo por entrelazar el alambre de plata con el alambre interior expuesto. Fije el empalme con cinta aislante, dejando una longitud de ~ 15 m m de alambre de plata expuesto (figura 1A).
   3. Electrochape el alambre de plata expuesto con cloro usando una fuente de Vcc 9 de 60 s para mejorar la conducción de la señal. Sumerja la punta de plata expuesta en solución salina normal y conecte el otro extremo al terminal positivo de la batería. Conectar otro cable al terminal negativo de la batería y sumerja el otro extremo del hilo en la salina².
      Nota: Cloro, el alambre de plata remojando durante 1 hora en una solución de blanqueador (hipoclorito de sodio de 42 g/L de ingrediente activo).
   4. Corte un cuadrado 20 x 20 mm de PVA esponja con unas tijeras para hacer un cono (figura 1A). Saturar la esponja con 1 x buffer de Ringer. Bajo un microscopio con una barra de escala en el ocular, utilice una hoja de bisturí para forma el ápice del cono a 40 μm de diámetro. Secar la esponja en forma de cono en papel absorbente hasta que esté sólido.
      Nota: La esponja PVA se expande considerablemente cuando se satura, por lo tanto es importante que la esponja se satura primero con solución salina antes de formar el ápice del cono.
   5. Después de chloriding, secar el alambre de plata sobre un tejido absorbente para 5 minutos insertar el alambre de plata en la esponja PVA seco, sólido, en forma de cono a través de la base del cono. Aísle cualquier exceso del metal expuesto con cinta de la máscara para reducir artefactos fotovoltaicos (Figura 1B-C).
      Nota: Después de cada sesión experimental, quite la esponja de alambre de plata. Lave la esponja con aire seco y agua de ósmosis inversa para su reutilización. Para asegurar la colección óptima de la señal, se recomienda utilizar solo de alambre de plata. Esponjas PVA no deben utilizarse más de 5 veces.
   6. En el día del experimento, sumerja la esponja-punta de los electrodos de la grabación en 1 x buffer de Ringer durante al menos 15 min saturar completamente la esponja.
2. Preparar electrodos de referencia como se describe arriba, pero sin colocar la punta de la esponja.
3. Obtener comercialmente el electrodo de tierra.

3. pez cebra preparación

1. Dark adaptar las larvas de pez cebra durante la noche (> 8 h) antes de las grabaciones mediante la colocación de pez cebra en un tubo de 15 mL (< 20 larvas por tubo) envuelto en papel de aluminio en una incubadora de oscuro. Retire la tapa para garantizar un suministro adecuado de oxígeno.
2. En el día de grabación, apriete la tapa al tubo falcon envueltas en papel aluminio conteniendo larvas y asegurarse de que el tubo es resistente a la luz. Transporte de larvas en el laboratorio ERG.
3. Verter el pescado en platos de Petri en la oscuridad con la ayuda de iluminación rojo tenue de un diodo emisor de luz (LED; 17,4 cd.m^-2, λ_max 600 nm). Cubrir los platos de Petri utilizando toallas resistente a la luz para minimizar la exposición a la luz.

4. preparación de la plataforma de la esponja

1. Cortar un rectángulo de esponja PVA seco para caber cómodamente en una caja de Petri de 35 mm. Asegúrese de que el espesor de la esponja debe ser aproximadamente igual a la profundidad de la caja Petri.
2. Hacer un pequeño corte vertical por un extremo de la esponja para acomodar el alambre de plata del electrodo de referencia.
3. Sumerja la esponja PVA en 1 x buffer de goldfish Ringer hasta saturado. Luego, coloque la esponja en un plato de petri limpia 35 mm. Use una toalla de papel para absorber líquido adicional hasta que no hay solución emana de la esponja en respuesta a una pulsación de luz dedo.

5. animales y colocación del electrodo

1. Anestesiar las larvas con Metanosulfonato de 0.02% diluido en 1 x buffer de goldfish Ringer.
2. Utilizar una pipeta Pasteur de 3 mL para transferir una larva anestesia en un cuadrado de papel de cocina (~ 3 cm²).
3. Coloque la toalla de papel que contiene la larva en la plataforma de esponja húmeda con unas pinzas. Utilizar un pincel fino embebido en buffer de Ringer para ajustar la posición de la larva. Asegúrese de que un ojo esté orientada hacia arriba, aislado de cualquier líquido cerca de la Plaza de toalla de papel debajo de la larva.
4. El cuerpo larval, excluyendo la cabeza, con hidratante gel de ojos para mantener húmedas a lo largo de la grabación de ERG la larva del esmalte.
5. Coloque el plato Petri con la plataforma de esponja sobre una pequeña plataforma agua caliente ante el estímulo de luz de tazón de fuente de Ganzfeld situado dentro de una jaula de Faraday (figura 1).
   Nota: Mantenimiento de la temperatura de la esponja y el cuerpo larval asegura estables señales ERG.
6. Insertar el electrodo de referencia en el corte en la esponja de la plataforma (figura 1).
7. Conectar el electrodo de tierra obtenidos comercialmente a la jaula de Faraday.
8. Conectar el electrodo de la grabación a un portaelectrodo y asegure el soporte al brazo estereotáctica de un micromanipulador (figura 1). Utilice una pipeta Pasteur de 3 mL a goteo una gota de solución de Ringer en la punta de la esponja del electrodo para la saturación a 1 x.
9. Coloque el microscopio en la jaula de Faraday sobre la plataforma ERG para la colocación del electrodo.
   Nota: Iluminación debe ser proporcionada por un LED rojo tenue (17,4 cd.m^-2, λ_max 600 nm) para permitir una observación de la larva y la colocación del electrodo activo, manteniendo dark-adaptation.
10. Ajustar la posición de la plataforma de esponja para permitir una observación de la larva al microscopio. A continuación, utilice tejido absorbente para quitar exceso de líquido de la punta del electrodo esponja.
11. Colocar el electrodo activo toca suavemente la superficie corneal central de las larvas de pez cebra (Figura 1E).
12. Mover el recipiente de Ganzfeld hacia la plataforma de esponja y asegúrese de que la larva está cubierta por el tazón de fuente.
13. Cerca de la jaula de Faraday para reducir los ruidos electromagnéticos extraños.

6. Electrorretinograma registro

1. Utilizar el software de la computadora del sistema particular de ERG (para detalles, véase tabla de materiales) provocar el estímulo y adquisición de datos basado en la configuración recomendada a continuación².
   1. Establecer la frecuencia de muestreo del sistema a 4 KHz en un ms 650 grabación ventana (2.560 puntos) en el software de adquisición.
   2. Ajuste la ganancia del sistema × 1.000.
   3. Configurar el filtrado de paso de banda del sistema 1 – 300 Hz.
   4. Utilice un filtro para reducir 60 Hz (o 50 Hz, dependiendo de la frecuencia de utilidad local) ruido.
      Nota: El nivel de ruido ideal no debe ser más de ± 10 μV.
2. Iniciar la recolección de datos usando el procedimiento descrito a continuación.
   1. Utilice un solo destello de prueba (0,06 log cd.s/m²) para medir una respuesta de la prueba del ojo para evaluar el posicionamiento de los electrodos.
      Nota: Esta intensidad de destello de prueba debe resultar en una b-agita amplitud mayor que 25 μV en larvas de 4 PD. Si no se puede medir una respuesta robusta, entonces vuelva a colocar los electrodos y hacer otra prueba flash para confirmar que los electrodos están bien posicionados.
   2. Después del destello de prueba, permitir el animal oscuro adaptarse por 3 min en oscuridad completa antes de las grabaciones.
   3. Presentan destellos de atenuador a intensidades de luz más brillantes.
   4. Promedio de las señales a través de repeticiones según el nivel de señal a ruido.
      Nota: En general, promedio de señales más en los niveles de luz dimmer (no menos de 3 repeticiones) y menos en los niveles de luz más brillantes (generalmente 1 repetición). Poco a poco alargar el intervalo inter-estímulo de 10 a 60 s del nivel de luz más tenue a más brillante. Un protocolo de ejemplo se muestra en la tabla 1.
   5. Después de las grabaciones, humanamente matar larvas usando Metanosulfonato de 0.1%.

7. Análisis

1. Medir la amplitud de una onda de línea de base para el negativo a través de una onda y la amplitud de la onda b desde el negativo a través de una onda hasta el pico de la onda b positiva.
2. Medir los tiempos implícitos de onda a y b desde Inicio estímulo al a través de la onda a y el pico de la onda b, respectivamente.

Resultados

Esta sección proporciona resultados representativos para ERG las mediciones diariamente de 4 a 7 PD. De PD 4, ERG respuestas muestran robustos componentes de la onda a y b, que surgen de fotorreceptores y células bipolares, respectivamente. A cada edad de prueba, la amplitud de la onda b aumentó con la intensidad de la luz (figura 2; Figura 3). En particular, la sensibilidad de la retina de pez cebra larvas a flashes dimmer aumentado con la e...

Discusión

Lecturas funcionales como el ERG se han vuelto cada vez más importantes en la suite de herramientas que se utilizan para el estudio de larvas de pez cebra^8,9,12,14. Debido al pequeño tamaño del ojo de larvas de pez cebra, Micropipetas de vidrio se han adaptado como electrodos de grabación en más publicados protocolos^3,4,

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,22 y micro; m filter	Millex GP SLGP033RS		Filtra el 10× tampón de timbre de pez dorado para sterilizatio
jeringa de 1 mL	Terumo	DVR-5175	Con un 30G × ½ " aguja para añadir gotas de solución salina a la punta de la esponja del electrodo para evitar la sequedad y el aumento del ruido en las señales ERG.
30 G y veces; ½ " aguja	Terumo	NN * 3013R	Para agregar electrodo de punta de solución salina toteh sopnge.
Instrumentos de	bioamplificador	ML135	Para amplificar señales ERG
Solución de lejía	King White	9333441000973	Para un método alternativo de cloración con electrodos de astilla. Principio activo: 42 g/L de hipoclorito de sodio.
Baño de agua de circulación	Lauda-Ko?nigshoffen	MGW Lauda	Se utiliza para hacer la plataforma calentada por agua.
Cable de electrodo	Grass Telefactor	F-E2-30 Cables de	platino para conectar electrodos de alambre de plata al amplificador.
jaula de Faraday	Internacional		Para mantener la adaptación a la oscuridad y encerrar la configuración de Ganzfeld para mejorar la relación señal-ruido.
de cuenco Ganzfeld	Internacional		Estimulador de luz diseñado a medida: 36 mm de diámetro, tamaño de apertura de 13 cm.
LED Luxeon	Phillips Light Co.		Para la estimulación lumínica veinte LEDs de 5W y uno de 1W.
Micromanipulador	Harvard Apparatus	BS4 50-2625	Sostiene el electrodo de registro durante los experimentos.
Microsoft Office Excel	Microsoft	versión 2010	Software de hoja de cálculo para el análisis de datos.
Gel hidratante para ojos	GenTeal Gel	9319099315560	Se utiliza para cubrir las larvas de pez cebra durante las grabaciones para evitar la deshidratación. Principio activo: 0,3 % Hipromelosa y 0,22 % carbómero 980.
Pipeta Pasteur	Copán	200C	Se utiliza para transferir cuidadosamente larvas de pez cebra.
Sistema de adquisición de datos	Powerlab ADInstruments	ML785	Controla los LEDs para generar estímulos.
Esponja de PVA	MeiCheLe	R-1675	Para la colocación de larvas de pez cebra y la fabricación del electrodo en forma de cono ti
Solución salina	Aaxis Pacific 13317002		Para galvanoplastia electrodo de alambre de plata.
Alcance Software	ADInstrumentos	versión 3.7.6	Simultáneamente activa el estímulo a través del sistema Powerlab y recopila datos
Plata (alambre redondo fino)	A& E metal	0,3 mm	Se utiliza para hacer electrodos ERG de registro y referencia.
Microscopio estereoscópico	Leica	M80	Se utiliza para dar forma y medir el ápice de esponja en forma de cono (con barra de escala en el ocular). Colocado en la jaula de Faraday para la colocación de electrodos.
Tricaína	Sigma-aldrich	E10521-50G	Para anestesiizar larvas de pez cebra.
Plataforma calentada por agua	hecha		para mantener la temperatura de la plataforma de esponja y el cuerpo de la larva durante los registros de ERG