Aquí, describimos el conjunto de complejos de alargamiento de ARN polimerasa II (Pol II) que requieren sólo ADN sintético corto y oligonucleótidos de ARN y Pol II purificado. Estos complejos son útiles para estudiar los mecanismos subyacentes al procesamiento co-transcripcional de transcripciones asociadas con el complejo de elongación Pol II.
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Artículo de método
Complejos de alargamiento de ARN polimerasa artificial II para disecar eventos de procesamiento de ARN co-transcripcional
En este artículo
Resumen
Resumen
La síntesis de ARNm eucariota es un proceso bioquímico complejo que requiere la transcripción de una plantilla de ADN en un ARN precursor por la enzima multi-subunit ARN polimerasa II y el taponamiento y empalme co-transcripcional del ARN precursor para formar el ARNm maduro. Durante la síntesis de ARNm, el complejo de alargamiento de ARN polimerasa II es un objetivo de regulación por una gran colección de factores de transcripción que controlan su actividad catalítica, así como el tapón, empalme y enzimas de procesamiento de 3'que crean el ARNm maduro. Debido a la complejidad inherente de la síntesis de ARNm, los sistemas experimentales más simples que permiten el aislamiento y la investigación de sus diversas etapas co-transcripcionales tienen gran utilidad.
En este artículo, describimos uno de estos sistemas experimentales simples adecuados para investigar el taponamiento de ARN co-transcripcional. Este sistema se basa en complejos de elongación de ARN polimerasa II definidos ensamblados a partir de burbujas de transcripción artificial y polimerasa purificada. Cuando se inmovilizan a través de ADN biotinilado, estos complejos de alargamiento de ARN polimerasa II proporcionan una herramienta fácilmente manipulable para disuado de taponamiento de ARN co-transcripcional y mecanismos por los cuales el complejo de alargamiento recluta y regula la enzima de tapado durante límite de ARN co-transcripcional. Anticipamos que este sistema podría adaptarse para estudiar el reclutamiento y/o el ensamblaje de proteínas o complejos proteicos con funciones en otras etapas de maduración del ARNm acopladas al complejo de alargamiento de ARN polimerasa II.
Introducción
La síntesis de ARN mensajero eucariota (ARNm) es un elaborado proceso bioquímico que implica la síntesis de un ARN precursor no procesado por ARN polimerasa II y el procesamiento del ARN precursor para producir el ARNm maduro. Los pasos de procesamiento de ARN de tapado, empalme y poliadenilación se llevan a cabo en gran medida de forma co-transcripción. El complejo de alargamiento Pol II sirve como un andamio que recluta y orquesta las actividades de muchas de las enzimas de procesamiento de ARN. En consecuencia, nuestra comprensión última de cómo se generan los ARNm eucariotas maduros dependerá en gran medida del desarrollo de sistemas experimentales que permitan la....
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Protocolo
1. Montaje de Complejos de Elongación Artificial y Caminar Pol II
- Inmovilizar 1 nmol de ADN no-plantilla oligo que contiene una molécula de biotina de 3' en cuentas magnéticas.
NOTA: Los siguientes pasos se pueden realizar con antelación para prepararse para futuros experimentos. Todas las secuencias de oligo utilizadas en este protocolo se proporcionan en la Tabla1. Los oligos de ARN se sintetizan con 5'-trifosfato modificaciones.- Añadir 200 l de perlas magnéticas (10 mg/ml) a un tubo de unión a proteínas baja de 1,5 ml, y luego colocar en un estante magnético durante 2 minutos.
- Mientras el tubo está e....
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Resultados
Las figuras 2 y 3 muestran reacciones representativas de resultados utilizadas para generar complejos de alargamiento artificial que contienen transcripciones de diferentes longitudes mediante la extensión o Pol II de diferentes fuentes. La Figura 4 muestra cómo estos complejos de alargamiento se pueden utilizar para analizar el taponamiento de ARN dependiente de la fosforilación CTD co-transcripcional.
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Discusión
Los estudios que buscan diseccionar eventos acoplados al complejo de elongación Pol II como el procesamiento de ARN y la regulación del alargamiento de la transcripción en sí pueden ser facilitados en gran medida mediante el uso de un sistema enzimático altamente purificado. La configuración de estos sistemas enzimáticos puede ser un desafío. La transcripción dependiente del promotor por parte de la Pol II requiere al menos cinco factores de transcripción generales. Preparar y almacenar estos factores puede llevar meses;.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a S. Shuman por proporcionar la enzima de tapado de mamíferos cDNA. Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención al Instituto Stowers para la Investigación Médica del Fondo de Investigación Médica Helen Nelson de la Greater Kansas City Community Foundation. Se puede acceder a los datos originales subyacentes a este manuscrito desde el repositorio de datos original de Stowers en http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | Para el radiomarcaje de ARN |
| 2x Tinte de carga de ARN | New England Biolabs | B0363S | Muy recomendable. Para la preparación de ARN durante la carga de gel |
| 40% Bis:Solución de acrilamida | Biorad | 1610144 | |
| Albúmina sérica bovina (20 mg/mL) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Ciclina H/MAT1 (complejo CAK) Proteína, activa, 10 y micro; g | Millipore Sigma | 14-476 | Se utiliza para fosforilar Pol II CTD |
| ADN oligonucleótidos | IDT | Consulte la Tabla 8 para conocer las especificaciones de pureza | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | También hemos utilizado Dynabeads M-280 estreptavidina sin problema, pero preferimos las perlas de MyOne Streptavidin porque sedimentan más lentamente |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Muy recomendable. Tintes de ácido nucleico pellet azul haciendo que las reacciones sean mucho más fáciles de manejar |
| Hoefer SE600 estándar sistema de electroforesis vertical de doble enfriamiento con espaciadores de 1 mm y peine de 15 pocillos | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract tubos de alta densidad (1.5 mL) | Qiagen | 129046 | Muy recomendable. Contiene un gel de alta densidad que forma una barrera estable entre las fases acuosa y orgánica; mejora el rendimiento de ARN durante las extracciones |
| La solución de proteinasa K (20 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| ARN oligonucleótidos | Trilink | Consulte la Tabla 8 para obtener más detalles | |
| Levadura Pirofosfatasa inorgánica (100 unidades/mL) | New England Biolabs | NEBM2403S | Solo se requiere durante las reacciones de taponado |
Referencias
- Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
- Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble du....
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Reimpresiones y permisos
