Cultivo y medición de huesos largos del feto y del recién nacido murino

Resumen

Aquí, presentamos un método para la cultura ex vivo de huesos largos de murino en las etapas del feto y del recién nacido, adecuado para analizar el desarrollo de hueso y cartílago y la la homeostasis en condiciones controladas, mientras que recapitular el proceso in vivo.

Resumen

Los huesos largos son estructuras complejas y dinámicas, que surgen de la osificación endocondral a través de un cartílago intermedio. El acceso limitado a huesos humanos sanos hace particularmente valioso el uso de modelos de mamíferos, como ratones y ratas, para buscar en diferentes aspectos del crecimiento óseo y la homeostasis. Además, el desarrollo de herramientas genéticas sofisticadas en ratones permite estudios más complejos de crecimiento óseo largo y pide una expansión de las técnicas utilizadas para estudiar el crecimiento óseo. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el cultivo de hueso murino ex vivo, que permite el estudio del hueso y el cartílago de una manera estrechamente controlada, mientras que la recapitulación de la mayor parte del proceso in vivo. El método descrito permite la cultura de una gama de huesos, incluyendo la tibia, el fémur y los huesos metatarsales, pero nos hemos centrado principalmente en la cultura tibial aquí. Además, se puede utilizar en combinación con otras técnicas, como el Time-lapse Live Imaging o tratamiento farmacológico.

Introducción

El crecimiento de órganos tiene que estar estrechamente afinado para prevenir la aparición de trastornos del crecimiento, e implica la regulación de múltiples tipos celulares, vías moleculares y diafonía entre diferentes partes del cuerpo. Las técnicas de imagen son esenciales para abordar los cambios que ocurren a lo largo del tiempo en un embrión en crecimiento, tanto en condiciones normales, como después de que se induce una perturbación en el sistema. Los embriones con desarrollo intrauterino, como los modelos de roedores ampliamente utilizados, presentan un desafío adicional para la imagen en vivo y el tratamiento farmacológico, que puede superarse parcialmente m....

Protocolo

Todos los experimentos deben llevarse a cabo siguiendo las pautas gubernamentales e institucionales locales de manejo ético de los animales de laboratorio.

1. preparaciones previas al día de la cultura ósea

1. Configurar los apareamientos del ratón cronometrados para obtener fetos y cachorros de día embrionario 14,5 (e 14.5) y en adelante.
   Nota: La cultura de los huesos largos se puede aplicar con éxito a diferentes cepas de ratón; en el presente Protocolo, se utilizan ratones salvajes de tipo salvaje de Swiss Webster.
2. Preparar el medio de disección (adaptado de Houston et al.¹⁵):....

Resultados

El cultivo óseo se puede realizar a partir de diferentes etapas. En la figura 1A-D, se muestra una comparación entre la tibia cultivada y los recién extraídos en etapas equivalentes. La primera observación es que hasta dos días de cultivo el tamaño logrado es comparable al crecimiento óseo in vivo tanto para el cartílago como para el hueso mineralizado (figura 1A, B, D). Periodos de cultivo más l.......

Discusión

Los métodos de cultivo de hueso ex vivo se han utilizado durante algún tiempo para evaluar la biología del crecimiento óseo²⁸, pero rara vez se han aplicado a los huesos largos murinos. Con el desarrollo de técnicas de imagen, el cultivo óseo ex vivo ofrece una forma atractiva de estudiar el crecimiento óseo en tiempo real en un entorno muy parecido a las condiciones in vivo. En este escenario, es importante definir las condiciones en las que el crecimiento de los huesos largos es comparable a su .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
5-Etinil-2'-desoxiuridina	Santa Cruz	CAS 61135-33-9
5-Bromo-2′-deoxyuridina	Sigma	B5002
50 mL Tubos de centrífuga cónicos	Falcon	352070
60 mm Plato de cultivo de órganos con pozo central tratado con TC, 20/Paquete, 500/Caja, Falcon estéril		353037
Adobe Photoshop	Adobe	CS4
Ácido ascórbico	Sigma	A92902
Unidad base para el visor	Zeiss	435425-9100-000
Betaglicerofosfato	Sigma	G9422
Visor binocular	Zeiss	STEMI-2000
Fracción de albúmina sérica bovina (BSA) v	Cámara Roche/Sigma	10735086001
DigiRetina 500	Aunet
	Cumper Robbins PFS00034
DMEM	Gibco	11960044
DMSO	Sigma	D8418
Tubos Eppendorf 2 mL	Eppendorf	0030120094
Etanol 96%	Merk	159010
Pinzas Dumont#5 Inox08	Fine Science Tools	T05811
Heracell 150 CO2	incubadora Thermo Fisher	51026282
Medio Esencial Mínimo Eagle	Sigma	M2279
Multipocillo 24 pocillos	Falcon	353047
Paraformaldehído Sigma	158127
Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Pipetas de plástico 1 mL Estéril Envasada individualmente Thermo		273
Filtro de jeringa 0,2 mmm	Ciencias de la Vida	PN4612
Jeringa Terumo 20 mL	Terumo	DVR-5174
Tretinoína (ácido retinoico)	Sigma	PHR1187-3X
Visor trinocular	Aunet AZS400T

Kit de disección