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Artículo de método

Estudio de toxicidad de nanopartículas de óxido de zinc en el cultivo celular y en Drosophila melanogaster

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DOI:

10.3791/59510

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19 de septiembre de 2019

 ,  ,  ,  , 
1NUS Environmental Research Institute & Department of Anatomy, National University of Singapore, 2NUS Environmental Research Institute & School of Public Health, National University of Singapore, 3Department of Civil and Environmental Engineering, National University of Singapore, 4Department of Anatomy, National University of Singapore

En este artículo

Resumen

Describimos un protocolo detallado para evaluar los perfiles toxicológicos de nanopartículas de óxido de zinc (ZnO NP) en particular, el tipo de muerte celular en fibroblastos pulmonares MRC5 humanos y la formación de ROS en la mosca de la fruta Drosophila.

Resumen

Las nanopartículas de óxido de zinc (ZnO NP) tienen una amplia gama de aplicaciones, pero el número de informes sobre la toxicidad asociada a ZnO NP ha crecido rápidamente en los últimos años. Sin embargo, los estudios que aclaran los mecanismos subyacentes para la toxicidad inducida por ZnO NP son escasos. Determinamos los perfiles de toxicidad de los NP de ZnO utilizando modelos experimentales in vitro e in vivo. Se observó una disminución significativa en la viabilidad celular en los fibroblastos pulmonares MRC5 expuestos a ZnO NP, lo que muestra que los NP de ZnO ejercen efectos citotóxicos. Del mismo modo, curiosamente, el intestino expuesto a los NP de ZnO exhibió un aumento dramático en los niveles reactivos de las especies de oxígeno (ROS) en la mosca de la fruta Drosophila. Se requieren estudios más detallados para establecer una evaluación del riesgo para el aumento del uso de LOS NP de ZnO por parte de los consumidores.

Introducción

La nanotecnología se refiere a la aplicación de materiales de tamaño nanométrico que se utilizan en todos los campos científicos, incluyendo la medicina, la ciencia de los materiales y la bioquímica. Por ejemplo, los NP ZnO que son conocidos por su dispersión ultravioleta, detección química y propiedades antimicrobianas, así como alta conductividad eléctrica, se utilizan en la producción de diversos productos de consumo como envases de alimentos, cosméticos, textiles, cauchos, baterías, catalizadores para el tratamiento de gas de cola de automóviles, y aplicaciones biomédicas1,2,3.

Sin embargo, las crecientes aplicaciones de los productos basados en ZnO NP, que conducen a una mayor exposición humana a los NP de ZnO, han suscitado preocupaciones sobre sus posibles efectos adversos sobre la salud humana. Varios estudios celulares in vitro han demostrado que los NP de ZnO pueden inducir estrés oxidativo, citotoxicidad relacionada con la autofagia, inflamación y genotoxicidad4,5,6,7,8 . En particular, se supone que la toxicidad de znO NP es causada por la disolución de Zn para liberar iones Zn2+, así como la reactividad superficial de ZnO, lo que resulta en los desequilibrios iónicos y metabólicos celulares que están relacionados con la homeostasis iónica deteriorada y una inhibición del transporte iónico4,7,9,10. Es importante destacar que los estudios han demostrado que la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) es uno de los principales mecanismos subyacentes a la toxicidad asociada a los NP de ZnO. Se ha demostrado que la insuficiente actividad antioxidante después del insulto ROS es responsable de provocar la citotoxicidad y el daño al ADN9. Los efectos tóxicos de znO NP también se han divulgado en modelos animales, incluyendo roedores1, pez cebra11,12, así como el invertebrado Drosophila13.

Drosophila sirve como un modelo animal alternativo bien establecido para el cribado de toxicidad de entidades químicas y nanomateriales (NMs)14,15. Es importante destacar que existen altos niveles de similitud genética y fisiológica entre el ser humano y Drosophila que justifican el uso de Drosophila como modelo in vivo para evaluar las respuestas biológicas a contaminantes ambientales como los NM 16. Además, hay muchas ventajas de usar Drosophila debido a su pequeño tamaño, corta vida útil, amenabilidad genética y mantenimiento fácil y rentable. Además, Drosophila ha sido ampliamente adoptada para el estudio de la genética, la biología molecular y del desarrollo, desde que su genoma completo fue completamente secuenciado hace años en 2000, por lo que es adecuado para una variedad de cribado de alto rendimiento y para abordar las cuestiones biológicas no resueltas17,18,19,20,21. En los últimos años, se han notificado varios estudios relacionados con la inmunotoxicidad utilizando diferentes tipos de NP en Drosophila 15,22,23,24. Este nuevo conocimiento fundamental obtenido de los estudios con Drosophila ha ayudado a proporcionar más información sobre nuestra comprensión de la nanotoxicología.

ROS es un conocido culpable de citotoxicidad y genotoxicidad causada por los NP, en particular, los NP a base de metal25. ROS son especies químicas que contienen oxígeno con propiedades reactivas más altas que el oxígeno molecular. Los radicales libres como el radical superóxido (O2-) e incluso, moléculas no radicales como el peróxido de hidrógeno (H2O2) pueden actuar como ROS. Bajo condición fisiológica normal, se requieren para mantener la homeostasis celular26,sin embargo, ROS excesiva debido a la sobreproducción o desregulación del sistema de defensa antioxidante puede causar estrés oxidativo, lo que conduce a daños a las proteínas, lípidos y ácido desoxirribonucleico (ADN)27. Por ejemplo, a medida que los niveles de ROS aumentan y el nivel de glutatión (GSH) disminuye de forma concomitante, se produce la interrupción de la síntesis de trifosfato de adenosina (ATP) y el nivel de lactato deshidrogenasa (LDH) aumenta en el medio, culminando en la muerte celular27.

Aquí, proporcionamos protocolos para realizar análisis celulares y genéticos utilizando células de mamíferos cultivadas y Drosophila para determinar los posibles efectos adversos de los NP de ZnO. En la Figura 1se muestra una descripción general del método utilizado para el estudio de toxicidad de los NP de ZnO.

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Protocolo

1. Análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) en células vivas/fijas

  1. Sonicate ZnO NP en suspensión durante 15 min.
  2. Preparar los NP de ZnO en varias concentraciones (por ejemplo, 0, 10, 25, 50,100 y 200 g/ml) utilizando 1 mg/ml de solución de stock ZnO NP para el tratamiento de células cultivadas.
  3. Semilla MRC5 fibroblastos pulmonares humanos (1 x 105 células/pozo) en una placa de cultivo de 6 pocillos con un día de antelación, y luego tratar las células con 2 ml de ZnO NP (en triplicados) durante 8 h, 16 h y 24 h.
  4. En cada punto de tiempo, recoger las células por centrifugación a 300 x g durante 5 min.
  5. Lave los gránulos celulares dos veces con solución salina tamponada de fosfato (PBS).
  6. Resuspender las células con 1x tampón de unión, que se compone de 0,1 M HEPES/hidróxido sódico (NaOH), cloruro de sodio de 1,4 M (NaCl) y 25 mM de cloruro de calcio (CaCl2), a una concentración de 1 x 105 células por 100 oL.
  7. Añadir 5 l de isotiocianato de fluoresceína (FITC) De la mancha V de la fluoresceína (FITC) y 5 l de mancha de ADN de yoduro de propidium (PI), e incubar las células durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT; 25 oC) en la oscuridad.
  8. Recargar las muestras con un búfer de unión adicional de 400 l de 1x antes de clasificar las celdas por citometría de flujo. Se analiza un mínimo de 10.000 celdas para cada muestra.
  9. Tabular el gráfico de barras utilizando la intensidad mediana obtenida.

2. Exposición de los NP de ZnO a Drosophila

  1. Añadir 1 ml de nanopartículas a diferentes concentraciones en viales, seguido de 9 ml de alimentos para moscas para realizar una concentración final de 0,1 mg/ml, 0,25 mg/ml o 0,5 MG/ml de ZnO NP.
  2. Mezcle bien las nanopartículas con los alimentos en los viales utilizando la pipeta.
  3. Deje que los alimentos con mosca que contengan ZnO NP se enfríen durante al menos 2-3 horas antes de su uso.
  4. Introducir moscas macho y hembra adultos en los viales durante 5 días, y les permiten aparearse y poner huevos (que aparecen como manchas blancas) en la superficie de la comida.
  5. Retire las moscas parentales, y permita que los óvulos se sometan a un desarrollo posterior, que consta de 4 etapas de desarrollo diferentes (fase embrionaria, larval, pupal y adulta).

3. Disección de la mosca

  1. Recoger larvas de estrella de finales de la3a de la pared de los viales para su análisis. Los huevos recién puestos normalmente se desarrollan en larvas de estrella de finales de 3a después de 72-120 h en RT.
  2. Limpie el plato de disección y llene el pozo con medio de disección/PBS.
  3. Disecciona las larvas (finales de la3a estrella) bajo el estereomicroscopio, usando un par de fórceps.
  4. Usa la punta de los fórceps para hacer un pequeño agujero y romper la capa de cutícula de las larvas. Tire con cuidado del intestino y colóquelo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga el medio Drosophila de Schneider, antes del paso de fijación utilizando 1 ml de 4% de paraformaldehído (PF).
  5. 3.5Fijar el intestino en PF durante 10 minutos a RT, para experimentos posteriores, como inmunomancha.

4. Detección ROS con tinción de dihidroetidio (DHE)

  1. Tratar las larvas con varias concentraciones de NP ZnO como se describe en el paso 2.1.
  2. Después de la disección del intestino de las larvas de3a estrella como se describe en la sección 3, incubar el intestino en el medio Drosophila de Schneider en RT antes de realizar la tinción de tejido. Disolver 1 l de tinte DHE (a partir de la concentración de 30 mM) en 1 ml del medio de Schneider, haciendo una concentración de trabajo final de 10-30 m de tinte DHE.
  3. Incubar el intestino durante 5 minutos a RT en la oscuridad, y luego lavar tres veces usando el medio de Schneider por cada 5 minutos.
  4. Fije el intestino con 4% PF (paso opcional) y monte el intestino en diapositivas de vidrio, con medio de montaje anti-fade que contiene 4o,6-diamidino-2-fenilindo (DAPI). Captura imágenes bajo un microscopio confocal.

5. Medición de la fluorescencia mediante el software ImageJ

  1. Importe las imágenes de fluorescencia capturadas adquiridas mediante microscopía de fluorescencia o microscopía de escaneo láser confocal en el software ImageJ.
  2. Haga clic en el menú Analizar y seleccione Establecer medidas.
  3. Seleccione la medida de salida, como la intensidad integrada del área y el valor gris medio.
  4. Haga clic en Medir.
  5. Seleccione una región sin fluorescencia para establecer el fondo.
  6. Exporte los datos a la hoja de cálculo de Excel y determine la fluorescencia total de celdas (CTCF) corregida, utilizando el cálculo como se muestra a continuación.
    CTCF - Densidad Integrada - (área de la celda seleccionada X Fluorescencia media de las lecturas de fondo)
  7. Construir un gráfico de barras y realizar análisis estadísticos.

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Resultados

Las células expuestas a NP se procesaron con el kit de reactivos de tinción de células, seguido de la clasificación de celdas mediante citometría de flujo. Las células tratadas con ZnO NP (panel inferior y derecho) exhiben un porcentaje más alto de células apoptoticas tempranas (R3)/tardías (R6) que las celdas de control (R5, inferior, panel izquierdo). La muerte de la célula necrótica se denota por R4 (panel superior, derecho)(Figura 2). Los resultados del e...

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Discusión

Con el fin de evaluar si ZnO NP puede inducir apoptosis en fibroblastos MRC5, utilizamos citometría de flujo para distinguir las células de la muerte de células necróticas o apoptoticas. En las células vivas normales, la fosfatidilserina (PS) se localiza en la membrana celular. Si se produce apoptosis, PS se traslada al prospecto extracelular de la membrana plasmática, lo que permite la unión de Annexin V etiquetado con fluoresceína (FITC Annexin V)29. Por otro lado, el yoduro de propidium rojo-fl...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

El estudio fue apoyado por el número de subvención R706-000-043-490. El estudio no representa la opinión del patrocinador de la subvención.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
15% 4-hidroxibenzoato de metiloSigma Aldrich
4% paraformaldehídoSigma AldrichP6148
Bacto AgarBD biosciences
cncCK6/TM3, Sbregalo del Dr. Kerppola T
Harina de maíz, glucosa, levadura cerveceraSigma Aldrich
CyAn ADP con Summit SoftwareDAKOhttps://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf
Dihidroetidio (Hidroetidina)Thermo Fisher ScientificD11347
FITC Annexin V Kit de detección de apoptosis IBD biosciences556547
Microscopio fluorescenteOlympus
GlucolinSupermercado
SoftwareImageJ NIH
MRC5 fibroblasto de pulmón humanoATCCCCL-171
Schneider' s Drosophilamedio de montaje antidecoloración Thermo Fisher Scientific21720-024
Vectashield con DAPIVector LaboratoriesH-1200
Wild-type Canton-S; Sod2N308 / CyO< / em>NIG-FLY
Nanopartículas de óxido de zincSigma Aldrich721077consulte la hoja 2
un

Referencias

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