Describimos un protocolo detallado para evaluar los perfiles toxicológicos de nanopartículas de óxido de zinc (ZnO NP) en particular, el tipo de muerte celular en fibroblastos pulmonares MRC5 humanos y la formación de ROS en la mosca de la fruta Drosophila.
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Artículo de método
Estudio de toxicidad de nanopartículas de óxido de zinc en el cultivo celular y en Drosophila melanogaster
En este artículo
Resumen
Resumen
Las nanopartículas de óxido de zinc (ZnO NP) tienen una amplia gama de aplicaciones, pero el número de informes sobre la toxicidad asociada a ZnO NP ha crecido rápidamente en los últimos años. Sin embargo, los estudios que aclaran los mecanismos subyacentes para la toxicidad inducida por ZnO NP son escasos. Determinamos los perfiles de toxicidad de los NP de ZnO utilizando modelos experimentales in vitro e in vivo. Se observó una disminución significativa en la viabilidad celular en los fibroblastos pulmonares MRC5 expuestos a ZnO NP, lo que muestra que los NP de ZnO ejercen efectos citotóxicos. Del mismo modo, curiosamente, el intestino expuesto a los NP de ZnO exhibió un aumento dramático en los niveles reactivos de las especies de oxígeno (ROS) en la mosca de la fruta Drosophila. Se requieren estudios más detallados para establecer una evaluación del riesgo para el aumento del uso de LOS NP de ZnO por parte de los consumidores.
Introducción
La nanotecnología se refiere a la aplicación de materiales de tamaño nanométrico que se utilizan en todos los campos científicos, incluyendo la medicina, la ciencia de los materiales y la bioquímica. Por ejemplo, los NP ZnO que son conocidos por su dispersión ultravioleta, detección química y propiedades antimicrobianas, así como alta conductividad eléctrica, se utilizan en la producción de diversos productos de consumo como envases de alimentos, cosméticos, textiles, cauchos, baterías, catalizadores para el tratamiento de gas de cola de automóviles, y aplicaciones biomédicas1,2,3<....
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Protocolo
1. Análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) en células vivas/fijas
- Sonicate ZnO NP en suspensión durante 15 min.
- Preparar los NP de ZnO en varias concentraciones (por ejemplo, 0, 10, 25, 50,100 y 200 g/ml) utilizando 1 mg/ml de solución de stock ZnO NP para el tratamiento de células cultivadas.
- Semilla MRC5 fibroblastos pulmonares humanos (1 x 105 células/pozo) en una placa de cultivo de 6 pocillos con un día de antelación, y luego tratar las células con 2 ml de ZnO NP (en triplicados) durante 8 h, 16 h y 24 h.
- En cada punto de tiempo, recoger las células por centrifugación a 300 x g
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Resultados
Las células expuestas a NP se procesaron con el kit de reactivos de tinción de células, seguido de la clasificación de celdas mediante citometría de flujo. Las células tratadas con ZnO NP (panel inferior y derecho) exhiben un porcentaje más alto de células apoptoticas tempranas (R3)/tardías (R6) que las celdas de control (R5, inferior, panel izquierdo). La muerte de la célula necrótica se denota por R4 (panel superior, derecho)(Figura 2). Los resultados del e.......
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Discusión
Con el fin de evaluar si ZnO NP puede inducir apoptosis en fibroblastos MRC5, utilizamos citometría de flujo para distinguir las células de la muerte de células necróticas o apoptoticas. En las células vivas normales, la fosfatidilserina (PS) se localiza en la membrana celular. Si se produce apoptosis, PS se traslada al prospecto extracelular de la membrana plasmática, lo que permite la unión de Annexin V etiquetado con fluoresceína (FITC Annexin V)29. Por otro lado, el yoduro de propidium rojo-fl.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
El estudio fue apoyado por el número de subvención R706-000-043-490. El estudio no representa la opinión del patrocinador de la subvención.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 15% 4-hidroxibenzoato de metilo | Sigma Aldrich | ||
| 4% paraformaldehído | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Bacto Agar | BD biosciences | ||
| cncCK6/TM3, Sb | regalo del Dr. Kerppola T | ||
| Harina de maíz, glucosa, levadura cervecera | Sigma Aldrich | ||
| CyAn ADP con Summit Software | DAKO | https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf | |
| Dihidroetidio (Hidroetidina) | Thermo Fisher Scientific | D11347 | |
| FITC Annexin V Kit de detección de apoptosis I | BD biosciences | 556547 | |
| Microscopio fluorescente | Olympus | ||
| Glucolin | Supermercado | ||
| Software | ImageJ NIH | ||
| MRC5 fibroblasto de pulmón humano | ATCC | CCL-171 | |
| Schneider' s Drosophila | medio de montaje antidecoloración Thermo Fisher Scientific | 21720-024 | |
| Vectashield con DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wild-type Canton-S; Sod2N308 / CyO< / em> | NIG-FLY | ||
| Nanopartículas de óxido de zinc | Sigma Aldrich | 721077 | consulte la hoja 2 |
Referencias
- Kim, Y. R., et al. Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats. International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).
- Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X.
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Reimpresiones y permisos
