Monitoreo de la Colonización Y Mantenimiento Bacterial en Arabidopsis thaliana Roots en un Sistema Hidropónico Flotante

Resumen

Aquí describimos un ensayo de crecimiento de plantas hidropónicas para cuantificar la presencia de especies y visualizar la distribución espacial de bacterias durante la colonización inicial de las raíces vegetales y después de su transferencia a diferentes ambientes de crecimiento.

Resumen

Las bacterias forman microbiomas complejos de rizoesfera según los microbios que interactúan, los organismos más grandes y el entorno abiótico. En condiciones de laboratorio, la colonización de la rizosfera por bacterias promotoras del crecimiento de las plantas (PGPB) puede aumentar la salud o el desarrollo de plantas anfitrionas en relación con las plantas no colonizadas. Sin embargo, en entornos de campo, los tratamientos bacterianos con PGPB a menudo no proporcionan beneficios sustanciales a los cultivos. Una explicación es que esto puede deberse a la pérdida del PGPB durante las interacciones con microbios del suelo endógenos durante la vida útil de la planta. Esta posibilidad ha sido difícil de confirmar, ya que la mayoría de los estudios se centran en la colonización inicial en lugar del mantenimiento de pgPB dentro de las comunidades rizosferas. Se presume aquí que el montaje, la coexistencia y el mantenimiento de las comunidades bacterianas están moldeados por características deterministas del microambiente de la rizoesfera, y que estas interacciones pueden afectar la supervivencia de PGPB en entornos nativos. Para estudiar estos comportamientos, se optimiza un ensayo hidropónico de crecimiento vegetal utilizando Arabidopsis thaliana para cuantificar y visualizar la distribución espacial de bacterias durante la colonización inicial de las raíces vegetales y después de la transferencia a un crecimiento diferente Entornos. La reproducibilidad y utilidad de este sistema se validan con el bien estudiado PGPB Pseudomonas simiae. Para investigar cómo la presencia de múltiples especies bacterianas puede afectar a la dinámica de colonización y mantenimiento en la raíz de la planta, una comunidad modelo a partir de tres cepas bacterianas (una Arthrobacter, Curtobacteriumy Microbacterium especies) originalmente aisladas de la rizoesfera A. thaliana. Se ha demostrado que la presencia de estas diversas especies bacterianas se puede medir utilizando este ensayo hidropónico de mantenimiento de plantas, que proporciona una alternativa a los estudios comunitarios bacterianos basados en la secuenciación. Estudios futuros utilizando este sistema pueden mejorar la comprensión del comportamiento bacteriano en microbiomas de plantas multiespecie con el tiempo y en condiciones ambientales cambiantes.

Introducción

La destrucción de cultivos por enfermedades bacterianas y fúngicas da lugar a una menor producción de alimentos y puede perturbar gravemente la estabilidad mundial¹. Sobre la base del descubrimiento de que los microbios en suelos supresores son responsables de aumentar la salud vegetal², los científicos han preguntado si el microbioma vegetal puede ser aprovechado para apoyar el crecimiento de las plantas modificando la presencia y abundancia de particulares especies bacterianas³. Las bacterias que se encuentran para ayudar en el crecimiento o desarrollo de las plantas se denominan colectivamente ....

Protocolo

NOTA: La configuración experimental se describe para mayor claridad y se utiliza para generar los resultados representativos incluidos en este informe, pero las condiciones se pueden modificar según se desee. Todos los pasos deben realizarse utilizando EPI y siguiendo las recomendaciones institucionales y federales para la seguridad, de acuerdo con el estado BSL de las bacterias utilizadas.

1. Caracterización de bacterias

1. Determinar la morfología de las bacterias en la placa de agar medio de crecimiento. Resuspenda las células a una OD aproximada de₆₀₀ o 0,5 y placa un volumen de 1 l en el medio de agar de elección. Aña....

Resultados

El bien caracterizado PGPB P. simiae WCS417r es conocido por colonizar las raíces de A. thaliana en el cultivo hidropónico. Esta bacteria naturalmente fluorescente se puede visualizar fácilmente mediante microscopía en las raíces de las plántulas después de la colonización (Figura2). Aunque es posible imaginar toda la longitud de estas semilleras A. thaliana' (4-6 mm de longitud) raíces, hacerlo para muchas plantas tomaría una canti.......

Discusión

Las plantas en todos los ambientes interactúan con miles a millones de diferentes bacterias y hongos^5,7. Estas interacciones pueden afectar negativa y positivamente a la salud de las plantas, con efectos potenciales sobre el rendimiento de los cultivos y la producción de alimentos. Los trabajos recientes también sugieren que la colonización variable de cultivos por PGPB puede explicar el tamaño impredecible de la planta y el rendimiento de los cultivos en los ens.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Materiales requeridos
1,5 mL Tubos Eppendorf	cualquier	N/A
Placas de 24 pocillos	BD Falcon	1801343
Aeraseal	Excel Scientific	BE255A2
Autoclave	cualquier	N/A
Bacterias de interés	cualquier	N/A	Almacenado a - 80? C en glicerol al 40% preferido
BactoAgar	BD	2306428; REF 214010
blanquear	cualquier	N/A
Conviron	cualquier	N/A	Ciclos de luz-oscuridad de día corto: 460-600 y micro; Lunares/m²/s fijado a las 9/15 horas luz/oscuridad a las 18/21? C, con toma de corriente interna
Desecador Tarro: vidrio o plástico pesado	cualquier	N/A
Etanol	cualquier	N/A
Llama	cualquier	N/A
Incubadora	cualquier	N/A	A la temperatura óptima para el crecimiento de bacterias especificadas
Ácido clorhídrico	cualquier	N/A
Lennox LB Caldo	RPI	L24066-1000.0
Microcentrífuga	cualquier	N/A
Micropipetas	cualquier	N/A	Volúmenes 5 y micro; L a 1000 µ L
Microscopio (preferiblemente fluorescencia)	cualquiera	N/A	Podría ser ligero si la mejor definición no es importante
MS Sales + MES	RPI	M70300-50.0
Agitador de placa orbital	cualquiera	N/A	Capaz de funcionar a 220 rpm durante al menos 96 horas Placas de
Petri	cualquier	N/A	Volumen total de 50 mL
Reservorios	cualquier	N/A
Espectrofotómetro	cualquiera	N/A
Perforadora estándar	cualquier	N/A	Diámetro de punzón de aproximadamente 7 mm
Agua estéril	cualquiera	N/A
Cinta quirúrgica	3M	MMM1538-1
Malla de teflón	McMaster-Carr	1100t41
Ultrasonido	cualquiera	N/A
Mezclador de vórtice	cualquier	N/A
X-gal	GoldBio	x4281c	otros proveedores disponibles
Materiales sugeridos
24 Clavija Accesorio de ultrasonido	cualquier	N/A	Para sonicar varias muestras a la vez. Se puede hacer individualmente
Alumaseal II	Excel Scientific	FE124F
Perlas de vidrio	cualquier	N/A
Multipetter/Repetter	cualquier	N/A
Placas estériles de 96 pocillos	cualquier	N/A	Para diluciones en serie. Puede ser reemplazado por tubos eppendorf
Biological Materials Used
Arabidopsis thaliana semillas	cualquier	N/A	Recomendamos el Centro de Recursos Biológicos de Arabidopsis para las existencias de semillas
Arthrobacter nicotinovorans			Levy, et al. 2018
Curtobacterium oceanosedimentum			Levy, et al. 2018
Microbacterium oleivorans			Levy, et al. 2018
Pseudomonas simiae WCS417r			Publicado en un sistema similar en Haney, et al. 2015. La cepa utilizada se desarrolló en Cole, et al. 2017

Pinzas cualquier N/A