Visualización de la proteína quinasa Una actividad en ratones de trabajo fijos en la cabeza utilizando la microscopía de imágenes de por vida con fluorescencia de dos fotones in Vivo

La neuromodulación, también conocida como transmisión sináptica lenta, impone un fuerte control sobre la función cerebral durante diferentes estados conductuales, como el estrés, la excitación, la atención y la locomoción^{1,2,3, 4}. A pesar de su importancia, el estudio de cuándo y dónde tienen lugar los eventos neuromoduladores todavía está en su infancia. Neuromoduladores, incluyendo acetilcolina, dopamina, noradrenalina, serotonina, y muchos neuropéptidos, activar los receptores acoplados a la proteína G (GPCRs), que a su vez desencadenan las segundas vías mensajeras intracelulares con una amplia ventana de escalas de tiempo que van de segundos a horas. Mientras que cada neuromodulador desencadena un conjunto distinto de eventos de señalización, la vía de la quinasa de campo/proteína A (PKA) es una vía descendente común para muchos neuromoduladores^1,5. La vía del campo/PKA regula la excitabilidad neuronal, latransmisión sináptica y la plasticidad 6,^7,8,9y, por lo tanto, ajusta la dinámica de la red neuronal. Debido a que diferentes neuronas o tipos neuronales expresan diferentes tipos o niveles de receptores neuromoduladores¹⁰, los efectos intracelulares del mismo neuromodulador extracelular pueden ser heterogéneos a través de diferentes neuronas, y por lo tanto, tienen que ser estudiado con resolución celular. Hasta la fecha, sigue siendo difícil monitorear eventos neuromoduladores en neuronas individuales in vivo durante el comportamiento.

Para estudiar la dinámica espaciotemporal de la neuromodulación, se requiere una modalidad de grabación adecuada. La microdiálisis y la voltammetría cíclica de exploración rápida se utilizan con frecuencia para estudiar la liberación de neuromoduladores, pero carecen de la resolución espacial para monitorear los eventos celulares^11,12. Análoga a la dinámica de calcio que se utiliza como un proxy para la actividad eléctrica neuronal en la población por imágenes¹³, la imagen PKA se puede utilizar para leer eventos neuromoduladores a través de una población neuronal a resolución celular. El presente protocolo describe el uso de un reportero mejorado de actividad A-quinasa (AKAR) para monitorear las actividades de PKA in vivo durante el comportamiento animal. El método descrito aquí permite la toma simultánea de imágenes de poblaciones neuronales a resolución subcelular con una resolución temporal que realiza un seguimiento de los eventos neuromoduladores fisiológicos.

Los AKARs están compuestos por un donante y un aceptador de proteínas fluorescentes vinculadas por un péptido de sustrato de fosforilación PKA y un dominio asociado a la cabeza de horquilla (FHA) que se une a la serina fosforilada o trionina del sustrato^14,15. Tras la activación de la vía PKA, el péptido de sustrato de AKAR se fosforila. Como resultado, el dominio FHA se une al péptido de sustrato fosforilado, lo que acerca a los dos fluoróforos, denominado salente el estado cerrado de AKAR. El estado cerrado de un AKAR fosforilado da lugar a un aumento de la transferencia de energía por resonancia de Farster (FRET) entre el donante y los fluoróforos del donante y del aceptador. Dado que la proporción de AKARs fosforilados está relacionada con el nivel de actividad de PKA¹⁶, la cantidad de FRET en una muestra biológica se puede utilizar para cuantificar el nivel de actividad de PKA^{16,17,18, 19,20}.

Las primeras versiones de los AKARs se diseñaron principalmente para imágenes de dos colores ratiométricas^14. Al obtener imágenes más profundas en el tejido cerebral, el método ratiométrico sufre de distorsión de la señal debido a la dispersión de luz dependiente de la longitud de onda^17,18,21. Como se explica a continuación, la microscopía por imágenes de por vida de fluorescencia (FLIM) elimina este problema porque FLIM solo mide los fotones emitidos por el fluoróforo^18,21. Como resultado, la cuantificación FLIM de FRET no se ve afectada por la profundidad tisular¹⁷. Además, se puede utilizar una variante "oscura" (es decir, bajo rendimiento cuántico [QY]) del fluoróforo del aceptador. Esto libera un canal de color para facilitar la medición multiplexada de propiedades neuronales ortogonales a través de imágenes simultáneas de un segundo sensor o un marcador morfológico^17,19,20.

Las imágenes FLIM cuantifican el tiempo que un fluoróforo pasa en el estado excitado, es decir, la vida útil de la fluorescencia¹⁸. El regreso de un fluoróforo al estado de tierra, por lo tanto el final del estado excitado, a menudo conconcomita con la emisión de un fotón. Aunque la emisión de un fotón para una molécula excitada individual es estocástica, en una población la vida media de fluorescencia es una característica de ese fluoróforo en particular. Cuando una población pura de fluoróforos se excita simultáneamente, la fluorescencia resultante seguirá una sola decadencia exponencial. La constante de tiempo de esta decaimiento exponencial corresponde a la vida útil media de la fluorescencia, que normalmente oscila entre uno y cuatro nanosegundos para las proteínas fluorescentes. El regreso de un fluoróforo de donante excitado al estado de tierra también puede ocurrir por FRET. En presencia de FRET, se reduce la vida útil de fluorescencia del fluoróforo del donante. Los AKARs sin fosforilar exhiben una vida útil de fluorescencia de donante relativamente más larga. Tras la fosforilación por PKA, el sensor exhibe una vida útil más corta porque los fluoróforos del donante y del aceptador se acercan entre sí y se incrementa el FRET. Por lo tanto, la cuantificación de la vida útil de la fluorescencia en una población de AKARs representa el nivel de actividad de PKA.

Las primeras versiones de los AKARs no se han utilizado con éxito para imágenes in vivo con resolución de una sola célula. Esto se debe principalmente a la baja amplitud de la señal de los sensores AKAR a las activaciones fisiológicas¹⁷. Recientemente, al comparar sistemáticamente los sensores AKAR disponibles para la microscopía de imágenes de por vida de fluorescencia de dos fotones (2pFLIM), se descubrió que un sensor llamado FLIM-AKAR supera a los sensores alternativos. Además, se desarrollaron una serie de variantes FLIM-AKAR llamadas AKARs (tAKARs) específicas para visualizar la actividad de PKA en ubicaciones subcelulares específicas: microtúbulos (tAKAR), citosol (tAKAR), actina (tAKAR), actina filamentosa (tAKAR), membrana (tAKAR), y la densidad postsináptica (tAKAR). Entre los tAKAR, el tAKAR aumentó la amplitud de la señal provocada por la noradrenalina en 2,7 veces. Esto es consistente con el conocimiento de que la mayoría de PKA en las neuronas están ancladas a microtúbulos en el estado de reposo^22,23. tAKAR fue el mejor intérprete entre los AKAR existentes para 2pFLIM. Además, el tAKAR detectó actividad de PKA fisiológicamente relevante provocada por múltiples neuromoduladores, y la expresión de tAKAR no alteró las funciones neuronales¹⁷.

Recientemente, tAKAR se utilizó con éxito para visualizar las actividades de PKA en ratones de afeitar fijos^17. Se demostró que la locomoción forzada desencadenó la actividad de PKA en el soma de las neuronas de capa superficial (capa 1 a 3, hasta una profundidad de 300 m de pia) en el motor, barril y cortices visuales. La actividad de PKA desencadenada por la locomoción dependía en parte de la señalización a través de receptores adrenérgicos y receptores de dopamina D1, pero no fue afectada por un antagonista del receptor de dopamina D2. Este trabajo ilustra la capacidad de los tAKARs para rastrear eventos de neuromodulación in vivo usando 2pFLIM.

En el protocolo actual, todo el método para la creación de imágenes de actividad PKA en ratones despiertos fijos durante un paradigma de locomoción forzado se describe en seis pasos. En primer lugar, la adición de capacidades 2pFLIM a un microscopio convencional de dos fotones (Figura1). En segundo lugar, la construcción de una cinta de correr motorizada (Figura2). En tercer lugar, la expresión del sensor tAKAR en la corteza del ratón por la electroporación utero (IUE) de los plásmidos de ADN, o la inyección estereotaxcócica del virus asociado al adeno (AAV). Se han publicado previamente excelentes protocolos para cirugías para IUE^24,25 e inyección estereotaxia de partículas virales^26. Los parámetros clave que utilizamos se describen a continuación. En adelante, la instalación de una ventana craneal. Excelentes protocolos han sido publicados previamente para la cirugía de ventana craneal^27,28. Se describen varios pasos que se han modificado desde los protocolos estándar. Quinto, actuando in vivo 2pFLIM. En sexto lugar, los análisis de imágenes 2pFLIM (Figura3 y Figura 4). Este enfoque debe ser fácilmente aplicable a muchos otros paradigmas de comportamiento fijos en la cabeza y áreas cerebrales.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Salud y Ciencia de Oregón.

1. Configuración del microscopio 2pFLIM

1. Instale un módulo de recuento de tiempo sordos (PTCM, Tabla de materiales)y conéctese al ordenador (Figura1) de acuerdo con el manual del fabricante.
   NOTA: El PTCM es típicamente una placa de computadora que recibe una entrada de "sincronización" para la sincronización del pulso láser y una entrada de fotones del tubo fotomultiplicador (PMT). También recibe la sincronización del reloj para píxeles, líneas y marcos, desde el software de control de imágenes de dos fotónes. El PTCM utiliza las señales de reloj para separar fotones individuales en diferentes píxeles y marcos.
2. Agregue un fotodiodo con >200 MHz de ancho de banda para medir la sincronización del láser. Coloque un cubrecristales estándar en la trayectoria de la luz para reflejar una pequeña fracción de la luz láser en el fotodiodo colocado perpendicularmente a la trayectoria de luz (Figura1). Conecte la salida del fotodiodo a la entrada de "sincronización" del PTCM.
   NOTA: Muchos láseres modernos también emiten la sincronización del láser. Para estos láseres, el fotodiodo no es necesario, y se puede conectar directamente la salida de sincronización láser a la entrada de sincronización del PTCM.
3. Intercambie el PMT, en el caso del tAKAR, el canal verde PMT, conun GAAsP PMT rápido y de bajo ruido (Figura 1). Conecte la salida PMT a la entrada de señal del PTCM.
   1. Añada un divisor de señal opcional (Figura1) si se desea la adquisición simultánea de intensidad a través del canal de imágenes convencional de dos fotones. Conecte la salida PMT al divisor de señal y conecte la salida del divisor al PTCM y al módulo de imágenes convencional de dos fotones.
      NOTA: Los PMP GaAsP proporcionan señales de un solo fotón más rápidas que las PMP bialcalinos convencionales y permiten una determinación más precisa de la sincronización del fotón. Ciertos modelos de PMT gaAsP se pueden enfriar a 10 o 35 oC por debajo de la temperatura ambiente, lo que permite la supresión de los recuentos oscuros a un nivel inferior a unos pocos cientos por segundo (normalmente 200 recuentos/s). Este bajo nivel de ruido es importante para la medición precisa de la vida útil de la fluorescencia porque los recuentos de fotones de ruido no se pueden distinguir o restar fácilmente de la curva de vida de la fluorescencia.
4. Agregue un filtro de emisión de fluorescencia de paso de banda que minimice la contaminación espectral, si la hay, del fluoróforo del aceptador. Por ejemplo, para tAKAR, se utiliza un filtro de barrera de 500 nm a 20 nm para el canal verde para reducir la contaminación del sREACh del aceptador, que es una proteína fluorescente amarilla (YFP)^29,30. Conecte señales de sincronización, como los relojes para píxeles de imagen individuales, líneas y fotogramas, según corresponda al software de control y descritos en el manual de usuario de PTCM. Instale el software de control y adquisición de datos adecuado.
   NOTA: Algunos fabricantes de PTCM (Tablade materiales)proporcionan su software para imágenes 2pFLIM. Aquí, se utiliza un software personalizado llamado FLIMimage, que fue desarrollado por el Yasuda Lab (Max Planck Florida, a través de la comunicación personal). Este software funciona como una función de usuario add-on para cierto software de adquisición de dos fotones (Tabla de materiales). Controla y comunica con el PTCM en el momento adecuado durante la toma de imágenes de dos fotones para adquirir imágenes 2pFLIM.

2. Construcción de una cinta de correr motorizada

NOTA: El diseño de la cinta de correr motorizada a medida se muestra en la Figura2.

1. Corte un rodillo de espuma (200 mm) a 150 mm de longitud con una sierra fina. Alternativamente, pegue las dos mitades de una bola de espuma juntas y coloque la cinta sobre la costura. Opcionalmente, pegue una estera de goma con perfil en el rodillo para aumentar la tracción en el rodillo.
2. Taladre un agujero de 1/4 de pulgada de diámetro a través del centro del rodillo en el lado plano del rodillo o taladre un agujero de 1/4 de pulgada de diámetro a través de la mitad de cada mitad de la bola si se utiliza la bola de espuma.
3. Instale un eje de acero de 1/4 de pulgada de diámetro a través del orificio. Pegue el rodillo/bola de espuma al eje con pegamento compatible con espuma. Opcionalmente, modifique dos acoplamientos de eje flexibles (diámetro interior de 1/4 pulgadas) para reforzar el acoplamiento del eje al rodillo/bola de espuma.
   NOTA: Tenga en cuenta que muchos pegamentos comunes pueden disolver la espuma.
   1. Para cada acoplamiento de eje, coloque el acoplamiento del eje en su lado plano y en el centro de la placa metálica rectangular (0,7 mm x 15 mm x 76 mm). Suelde la placa al acoplamiento del eje. Taladre un orificio de 1/4 de pulgada en el centro de la placa para permitir la instalación del acoplamiento de eje modificado en el eje y dos orificios de tornillo en el lateral de la placa de metal desde el centro.
   2. Instale el acoplamiento del eje en el eje contra el rodillo/bola de espuma. Si utiliza este último, doble ligeramente la placa para ajustarla a la curvatura de la bola. Coloque los tornillos en los orificios laterales para fijar el rodillo/bola en el eje.
4. Taladre y toque una rosca 3/8-32 en el centro de una placa de jaula e instale el codificador giratorio. Taladre un orificio de tornillo en la base del soporte del motor del ángulo recto para permitir la fijación del motor al soporte del poste. Fije tanto el encoder giratorio como el motor al extremo del eje utilizando un acoplamiento de eje flexible.
5. Instale la cinta de correr montada en una placa de pan de aluminio utilizando postes para el motor y el codificador giratorio (Figura2). Conecte las entradas del motor al controlador de velocidad y la salida del codificador giratorio a una entrada analógica de la placa de adquisición de datos de ordenador (DAQ).
   NOTA: La velocidad angular de rotación es codificada por el codificador rotativo como voltaje y se digitaliza utilizando un software personalizado llamado AnimalTracker escrito en MATLAB.
6. Instale el soporte compatible con la placa frontal en un soporte de ángulo recto. Instale un poste sólido en la placa de pan delante de la cinta de correr e instale el soporte de la placa de dirección montado con el soporte de ángulo recto en el poste (Figura2). Asegúrese de que las barras del soporte de la placa principal estén alineadas con el eje de modo que el ratón pueda adoptar una posición de caminar adecuada y cómoda en la cinta de correr (Figura2C).

3. Expresión del sensor tAKAR en la corteza del ratón

1. Electroporación en el útero
   1. Preparar una solución de ADN para IUE añadiendo una concentración final del 0,2% de tinte verde rápido (para su visualización durante la inyección) a un ADN plásmido (3 x 4 g/ l; las construcciones del sensor que contienen un promotor CAG, una secuencia de sensores y un virus de la hepatitis de leña (3 x 4 g / L; las construcciones del sensor que contienen un promotor CAG, una secuencia de sensores y un virus de la hepatitis de leñada elemento de respuesta post-transcripción [WPRE] potenciador traslacional) disuelto/diluido en agua o Tris-EDTA.
   2. Prepare un ratón hembra embarazada cronometrada (p. ej., C57BL/6) para IUE en E16²⁴. Anestetizar el ratón con isoflurano (4% para inducción y 1,5% para mantenimiento, en 95% de O2 con 5% CO₂) y aplicar inyección subcutánea de analgésicos perioperatorios que contengan 5 mg/kg de Meloxicam y 4 mg/kg de bupivacaína. Abre la cavidad abdominal con un bisturí y un par de tijeras y expone cuidadosamente los cuernos uterinos.
   3. Inyectar 1 l de solución de ADN por embrión en el ventrículo lateral de un hemisferio, como se describió anteriormente²⁴.
   4. Realizar IUE²⁴ regular para las neuronas corticales colocando el pie final del electrodo positivo en la corteza y usando cinco pulsos cuadrados de 100 ms (38 V) a 1 Hz con un electroporator.
      NOTA: Se pueden seleccionar diferentes regiones corticales para la electroporación cambiando la colocación del pie final del electrodo en relación con el ventrículo lateral.
2. Inyección estereotaxia
   1. Preparar un ratón en el día postnatal 30 para la cirugía estereotaxia^26. Anestetizar el ratón como se describe en el paso 3.1.2., y aplicar la inyección subcutánea de analgésicos perioperatorios que contengan 5 mg/kg de carprofeno.
   2. Diluir el serotipo AAV 2/1 (AAV2/1) expresando hSyn-tAKAR-WPRE a un títer de determinación empírica (1 x 10^{9 x}1x^{10 10} genomas/L) en la jeringa filtrada (membrana de acetato de celulosa de 0,2 m) solución salina tamponada con fosfato.
   3. Taladre un orificio de 500 m de diámetro utilizando un taladro de mano bajo un estereomicroscopio con las siguientes coordenadas para la corteza motora: 0,5 mm antes de bregma, 1,2 mm de línea lateral a media.
   4. Monte un inyector (por ejemplo, manipulador hidráulico de aceite, con portapipes/pipetas de vidrio hecho a medida) en un manipulador motorizado. Coloque la aguja de inyección en un ángulo de 15o en relación con el plano bregma-lambda. Programe un movimiento diagonal a través de los ejes x y z equivalente a una progresión de 700 y 200 m a lo largo de los ejes anterior-posterior y dorsal-ventral, respectivamente.
      NOTA: Para evitar daños en el tejido directamente por encima del campo de imágenes previsto, las partículas AAV se inyectan en un ángulo relativo al plano bregma-lambda.
   5. Coloque la punta de la aguja de inyección en la pia en el centro del orificio de perforación y ejecute lentamente el movimiento diagonal (25 m/s) descrito anteriormente. Este procedimiento colocará el centro de la inyección en 1,2 mm antes de bregma, 1,2 mm de línea lateral a media, 0,2 mm por debajo de la pia.
   6. Inyectar 20 nL de partículas virales diluidas (10 nL/min). Espere al menos 10 minutos y retraiga lentamente la aguja de inyección (12,5 m/s).
   7. Terminar el procedimiento de inyección estereotaxica y pegar / suturar la piel²⁶.

4. Instalación de la Ventana Craneal

1. Realizar la colocación de la ventana craneal en ratones que expresan tAKAR a través de IUE (sección 3.1) o inyección estereotaxica de partículas virales (sección 3.2), entre los días postnatales 30 y 60. Para el ratón infectado con partículas virales, implemente la ventana craneal al menos dos semanas después de la inyección del virus. Instale la ventana craneal como se describió anteriormente^27,28, con los siguientes detalles. Anestetizar el ratón como se describe en el paso 3.1.2., y aplicar la inyección subcutánea de analgésicos perioperatorios 0,075 mg/kg Buprenex y el agente antiinflamatorio Dexametasona a 4 mg/kg.
2. Retire el periosteum y retraiga el músculo del cuello. Pegue el borde de la piel al cráneo con adhesivo tisular para evitar la exposición de la musculatura del cuello después de la cirugía.
3. Secar y eliminar cualquier periosteo del cráneo raspando suavemente con un bisturí. Coloque la placa de la imagen (8 mm de diámetro interior) para rodear el campo de imágenes previsto. Pegue la placa frontal al cráneo usando pegamento a base de cianoacrilato, seguido de cemento acrílico dental. Para una adherencia óptima, asegúrese de que la placa frontal se apoya sobre el cráneo expuesto y seco. El acelerador de pegamento se puede utilizar para acelerar el endurecimiento.
4. Dibuje un círculo de 5 mm de diámetro por encima del campo de imagen previsto (coordenadas como se especifica en el paso 3.2.3) utilizando un taladro dental y exponga el duro mater.
5. Aplicar una fina capa de polímero transparente, también llamado dura artificial, a la superficie dura para cubrir toda la ventana craneal. El polímero protegerá y estabilizará el dura mater. Coloque un cubreobjetos circular estéril (5 mm de diámetro) en la dura mater. Asegure el cubreobjetos con pegamento de cianoacrilato aplicado alrededor de los bordes de la ventana seguido de cemento acrílico dental.

5. En Vivo Microcélulas de Imagen de Por Vida de Fluorescencia de Dos Fotos

1. Iniciar imágenes de 2pFLIM en o más allá de 2 semanas después de la instalación de la ventana craneal (sección 4). Minimice la interferencia experimental debido al estrés por el manejo frecuente y el desalimiento del ratón antes del inicio del estudio de imágenes para habituar el ratón.
2. Establezca la longitud de onda láser de excitación de dos fotones en 960 nm utilizando el software que controla el láser de dos fotones.
3. Anestesia el ratón usando 4% de isoflurano. Confirme la anestesia adecuada por la cola-pinch y observando las tasas respiratorias. Es decir, no debe haber respuesta al pellizco de cola y la frecuencia respiratoria debe reducirse a 1 saliento por segundo. Para minimizar el tiempo de procedimiento innecesario y debido a que la anestesia dura sólo de dos a tres minutos, no se utilizan lubricantes para los ojos.
4. Transfiera el ratón anestesiado a la cinta de correr motorizada (figura2C)y monte la placa frontal del ratón al soporte de la placa principal de la configuración de la cinta de correr (consulte la figura 2 para obtener más información). Limpie la superficie de la cubierta de la ventana craneal en el ratón con un 70% de etanol.
5. Coloque la cinta de correr motorizada con el ratón montado bajo el objetivo 2pFLIM. Aplicar una gota de agua destilada entre la tapa de la ventana craneal y el objetivo.
6. Deje que el ratón montado se despierte de la anestesia y se aclimate a la cinta de correr y al entorno del microscopio durante al menos 10 minutos.
7. Navegue hasta el lugar de inyección bajo epi-iluminación. Documentar características fiduciales (es decir, vasos sanguíneos) bajo campo brillante para ayudar a la toma de imágenes de la misma región de interés (ROI) durante las sesiones de diagnóstico por imágenes posteriores.
8. Elimine cualquier luz entrante que no sea la luz emitida del tejido cerebral. Apague la fuente de luz epi-iluminación y cierre la carcasa de la plataforma 2pFLIM. Active el 2pFLIM PMT activando el control de voltaje de comando de hardware.
9. Adquiera una imagen de 2pFLIM de pila z utilizando el software de adquisición 2pFLIM FLIMimage con los siguientes ajustes recomendados para la imagen de somata sópositivo tAKAR en ratones despiertos. Establezca el promedio de fotogramas en 3 fotogramas, la velocidad de escaneado a 2 ms/línea, el tamaño de la imagen en 128 x 128 píxeles y el campo de visión en 90 x 100 m. Ajuste la configuración de imágenes en función de la preparación y la configuración del hardware.
10. Inspeccione la imagen adquirida en FLIMview (software personalizado desarrollado internamente; ver sección 6). Ajuste la configuración de imágenes después del paso 5.9 para optimizar el recuento de fotones y minimizar el blanqueo de fotofonos.
    NOTA: Un recuento de fotones integrado sin trabajo en un ROI para la toma de imágenes de por vida de un soma in vivo positivo de tAKAR es de 1.000 a 10.000 fotones dependiendo de la amplitud de la señal que resulta de un estímulo en particular (ver Discusión).
    1. Cuando sea necesario, utilice un campo de visión reducido, menor velocidad de escaneo, mayor potencia láser y mayor número de fotogramas que se promediarán para aumentar el recuento de fotones integrados y reducir el error de estimación de la vida útil. Al mismo tiempo, asegúrese de utilizar la potencia láser esencial mínima, el promedio de fotogramas y la velocidad de escaneo para minimizar el fotoblanqueo.
11. Imagen en un intervalo de tiempo regular (por ejemplo, cada 30 a 60 s) repitiendo la adquisición de la pila z utilizando la configuración determinada en el paso 5.10. Adquiera imágenes 2pFLIM de línea base durante al menos 15 minutos a velocidad de cinta de correr cero.
12. Establezca la velocidad de rotación de la cinta de correr en 15 cm/s durante 15 minutos mientras adquiere imágenes de 2pFLIM. Continúe la toma de imágenes durante 20 minutos después de apagar la rotación de la cinta de correr, para evaluar la duración de la actividad de PKA después de la interrupción de la locomoción forzada.

6. Análisis de imágenes 2pFLIM

1. Abra las imágenes adquiridas en FLIMview y establezca los siguientes parámetros en FLIMview.
   NOTA: Los detalles de los parámetros se describen en DISCUSSION.
   1. Haga clic en los campos de rango mínimo y máximo de recuento de fotones individuales (SPC) en FLIMview. Ingrese el valor de rango mínimo y máximo apropiado del SPC, que normalmente oscila entre 1.2-2 y 10-12 ns, respectivamente.
   2. Haga clic en el campo de valor t₀ en FLIMview e introduzca el valor t₀ (normalmente 2 ns). Haga clic en el campo de valor de umbral mínimo de luminancia de por vida en FLIMview e introduzca el valor de umbral deseado en 5 x 30 fotones.
2. Haga clic en el nuevo botón de grupo (N) y asigne un nombre de grupo de experimentos. Esto generará un grupo que combina datos de cada imagen FLIM agregada.
3. Haga clic en el botón ROI en el módulo Roi Controls de FLIMview y dibuje un ROI alrededor de un soma positivo de tAKAR. Reduzca el rango de la pila z, moviendo el límite z inferior y superior en los controles deslizantes de control de la pila z en FLIMview, para minimizar la contaminación de la señal originada por fotones de fondo en otras profundidades z.
4. Haga clic en el botón + para agregar la imagen FLIM al grupo (paso 6.2). Haga clic en el botón Calc para calcular la vida útil media (LT, también llamado tiempo medio de emisión de fotones [MPET]), para el ROI y el error de estimación de la vida útil.
5. Abra el siguiente archivo de la serie de imágenes crónicas 2pFLIM. Repita el paso 6.4. Asegúrese de ajustar la posición del ROI y el rango de la pila z para medir el mismo soma positivo de tAKAR con el tiempo, porque puede haber deriva de tejido con el tiempo.
6. Seleccione el deltaMPET/MPET₀ en el menú desplegable del módulo Controles de grupo. Haga clic en el campo de línea base e introduzca los índices (por ejemplo, 1 2 3 4 5 para las primeras cinco imágenes en el grupo creado en el paso 6.3). Esto definirá las imágenes utilizadas para calcular la duración de la línea base (LT₀).
7. Haga clic en Trazar para generar un gráfico que contenga la respuesta FLIM (LT/LT₀₎de tAKAR durante el experimento en los ROI definidos. Los cambios normalizados en la vida útil (LT) de los ROC individuales según la vida útil de línea de base correspondiente (LT₀) permiten comparar la actividad de PKA durante la locomoción en diferentes ROI.

Los sensores FRET-FLIM permiten la visualización de muchas vías de señalización diferentes, incluida la vía de campo/PKA implicada en la neuromodulación. El protocolo actual utiliza el sensor tAKAR recientemente desarrollado en combinación con 2pFLIM para visualizar las actividades de PKA en ratones que se comportan con cabeza fija. La mayoría de los microscopios de dos fotones existentes se pueden actualizar con capacidades 2pFLIM añadiendo tres a cuatro componentes, como se ilustra en la Figura 1 (ver también sección 1). Para visualizar EL FRET en imágenes adquiridas en 2pFLIM, la cuantificación dela vida útil media se realizó en las gráficas de histograma de la sincronización de fotones recopiladas por píxel (Figura 3A,B). La vida útil media se visualizó utilizando una imagen pseudocolor, en la que las vidas medias de alto (color frío) y bajo (color cálido) representan actividades pkA bajas y altas, respectivamente, ya que la activación de PKA conduce a la disminución de la vida útil. Se debe tener cuidado de ajustar el rango de SPC correctamente; este rango debe ajustarse dentro del intervalo de pulsos láser (por ejemplo, 12,5 ns de una frecuencia de pulso de 80 MHz) con artefactos de borde de hardware minimizados (ver también sección 6 y DISCUSSION). El cálculo de la actividad de PKA dentro de los ROI se realizó combinando el LT de todos los píxeles dentro de un ROI determinado (Figura3C,D). En ratones despiertos fijos, la vida basal oscilaba entre 1,3 y 1,8 ns (Figura3E). Las imágenes de tAKAR en la corteza motora en ratones despiertos fijados para la cabeza permitieron la cuantificación en tiempo real de la actividad de PKA con resolución celular durante la locomoción basal y forzada (Figura4). El experimento se puede repetir durante días y meses. La locomoción forzada desencadena la actividad de PKA en una población de neuronas dentro de las capas superficiales de la corteza motora del ratón17. Esta actividad de PKA depende de la neuromodulación a través de la activación de los receptores -adrenérgicos y D117.

Figura 1: Esquema de un sistema 2pFLIM. 2pFLIM se puede implementar en un microscopio convencional de dos fotones mediante la adición de los componentes de hardware resaltados en amarillo: un módulo de recuento de tiempo de fotones, un tubo fotomultiplicador rápido de bajo ruido (PMT), un fotodiodo (sólo es necesario si el láser no tiene un señalización de salida para la sincronización láser), y un divisor de señal opcional. Esta cifra ha sido modificada de Ma et al.17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Diseño de una cinta de correr motorizada hecha a medida. (A) Esquema del diseño de la cinta de correr desde las vistas frontal (arriba izquierda), lateral (arriba a la derecha) y superior (abajo a la izquierda). El eje de la cinta de correr (bola de espuma) está conectado a un codificador giratorio y un motor que se montan colectivamente en dos postes en una placa de pan de aluminio sólido. El soporte compatible con la placa principal en el soporte del ángulo recto se fija a un poste sólido y se coloca por encima de la cinta de correr. Los dibujos esquemáticos no se pueden escalar. Delante (B) y lateral (C) ver fotografías de la cinta de correr. El posicionamiento adecuado del ratón en la cinta de correr se muestra en el panel C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: La cuantificación de los datos 2pFLIM. (A) Una imagen FLIM con cada píxel pseudocolor para representar la vida media (LT), en relación con la sincronización láser, de todos los fotones de ese píxel. (B) Los tiempos de llegada del fotón dentro de un solo píxel (cuadrado púrpura en el panel A)se trazaron en un histograma (panel izquierdo). Los límites de integración se establecieron para determinar el rango de recuento de fotones único (SPC, gris). Dentro del rango SPC, la integral de la sincronización de fotones se dividió por el número total de fotones y luego se restó por el t0 (1,65 ns, línea discontinua), lo que dio como resultado una vida útil media (LT, distancia entre líneas discontinuas y punteadas) de 1,74 ns. La cuantificación de la vida media de todo el campo de visión (cuadrado azul claro en el panel A) implicó la integración de la temporización de fotones recopilada en todos los píxeles (panel derecho), lo que dio como resultado una vida útil media de 1,7 ns. Los recuadros muestran los mismos datos en escala de semiregistro. (C y D) Cuantificación de la vida útil media por región de interés (ROI). (C) Ejemplo representativo de una imagen 2pFLIM. Se dibujaron dos ROI alrededor de dos somata sólais en la capa 2/3 de la corteza motora. (D) Distribuciones de temporización de fotones integradas en todos los píxeles de cada ROI (panel izquierdo). Los ROI de celda estaban codificados por colores (como se muestra en el panel C) rojo, celda 1; azul, celda 2. Los recuentos de fotones normalizados permiten la comparación de distribuciones de temporización de fotones entre los dos ROI (panel derecho, vida útil media; celda 1, 1.33 ns; celda 2, 1.73 ns). Los recuadros muestran los mismos datos en escala de semiregistro. (E) Gráfica de distribución de la vida basal media de 254 células imágenes en las capas superficiales de la corteza motora. Células L1 (n a 186 células/11 animales, panel izquierdo), que residen dentro de 100 m por debajo de la pia, expresadas tAKAR, expresadas por un tAKAR, expresadas después de una inyección estereotaxia de AAV2/1-hSyn-tAKAR-WPRE, y células piramidales L2/3 (n a 68 celdas/4 animales, panel derecho), que residen al menos 150 ám por debajo de la pia, expresó tAKAR después de IUE de una construcción de ADN CAG-tAKAR-WPRE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: tAKAR tm rastrea las actividades de PKA inducidas por locomoción forzada en la corteza motora. (A) Intensidad representativa (panel izquierdo) y vida útil (paneles medios y derecho) imágenes de tres células L1 en la corteza motora. Los ROI de celda estaban codificados por colores: naranja, celda 1; azul, celda 2; amarillo, celda 3. (B) Distribuciones de temporización de fotones medidas en la celda 1 (panel superior) durante la condición basal (traza naranja, medida en el panel medio )y locomoción forzada (loco., traza de naranja claro, medida en el panel derecho A). Los recuentos de fotones normalizados permiten la comparación directa de la distribución de la sincronización de fotones (panel inferior, vida útil media: basal, 1,72 ns; locomoción, 1,42 ns). Los recuadros muestran los mismos datos en escala de semiregistro. (C) - vida útil/vida útil0 (LT/LT0) trazas de las celdas correspondientes (panel superior, ver panel A) con velocidad de locomoción forzada (panel inferior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.