Visualización de la proteína quinasa Una actividad en ratones de trabajo fijos en la cabeza utilizando la microscopía de imágenes de por vida con fluorescencia de dos fotones in Vivo

Bart  C. Jongbloets; Lei Ma; Tianyi Mao; Haining Zhong

doi:10.3791/59526

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Artículo de método

Visualización de la proteína quinasa Una actividad en ratones de trabajo fijos en la cabeza utilizando la microscopía de imágenes de por vida con fluorescencia de dos fotones in Vivo

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DOI:

10.3791/59526

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7 de junio de 2019

Bart C. Jongbloets^*¹ , Lei Ma^*¹ , Tianyi Mao¹ , Haining Zhong¹

¹Vollum Institute, Oregon Health & Science University

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Se presenta un procedimiento para visualizar las actividades de proteína quinasa A en ratones que se fijan en la cabeza y se comportan. Un reportero mejorado de actividad de A-quinasa, tAKAR, se expresa en las neuronas corticales y se hace accesible para la toma de imágenes a través de una ventana craneal. La microscopía por imágenes de por vida de fluorescencia de dos fotones se utiliza para visualizar las actividades de PKA in vivo durante la locomoción forzada.

Resumen

La neuromodulación ejerce un poderoso control sobre la función cerebral. La disfunción de los sistemas neuromoduladores da lugar a trastornos neurológicos y psiquiátricos. A pesar de su importancia, las tecnologías para rastrear eventos neuromoduladores con resolución celular están empezando a surgir. Los neuromoduladores, como la dopamina, la noradrenalina, la acetilcolina y la serotonina, desencadenan eventos de señalización intracelular a través de sus respectivos receptores acoplados a proteínas G para modular la excitabilidad neuronal, las comunicaciones sinápticas y otras regulando así el procesamiento de la información en la red neuronal. Los neuromoduladores mencionados anteriormente convergen en la vía adentro/proteína quinasa A (PKA). Por lo tanto, la imagen de PKA in vivo con resolución de una sola célula se desarrolló como una lectura para eventos neuromoduladores de una manera análoga a las imágenes de calcio para actividades eléctricas neuronales. En este documento, se presenta un método para visualizar la actividad de PKA a nivel de neuronas individuales en la corteza de ratones que se comportan por la cabeza fija. Para ello, se utiliza un reportero mejorado de actividad De la A-quinasa (AKAR), llamado tAKAR, que se basa en la transferencia de energía por resonancia de Farster (FRET). Este sensor PKA genéticamente codificado se introduce en la corteza motora a través de la electroporación utero (IUE) de plásmidos de ADN, o inyección estereotaxcócica de virus asociado a adeno (AAV). Los cambios de FRET se utilizan mediante la microscopía de imágenes de por vida de fluorescencia de dos fotones (2pFLIM), que ofrece ventajas sobre las mediciones ratiométricas de FRET para cuantificar la señal FRET en el tejido cerebral de dispersión de luz. Para estudiar las actividades de PKA durante la locomoción forzada, el tAKAR se imagea a través de una ventana craneal crónica por encima de la corteza de ratones despiertos fijos en la cabeza, que corren o descansan en una cinta de correr motorizada con control de velocidad. Este enfoque de diagnóstico por imágenes será aplicable a muchas otras regiones cerebrales para estudiar las actividades de PKA inducidas por el comportamiento correspondientes y a otros sensores basados en FLIM para imágenes in vivo.

Introducción

La neuromodulación, también conocida como transmisión sináptica lenta, impone un fuerte control sobre la función cerebral durante diferentes estados conductuales, como el estrés, la excitación, la atención y la locomoción¹^,²^,³^, ⁴. A pesar de su importancia, el estudio de cuándo y dónde tienen lugar los eventos neuromoduladores todavía está en su infancia. Neuromoduladores, incluyendo acetilcolina, dopamina, noradrenalina, serotonina, y muchos neuropéptidos, activar los receptores acoplados a la proteína G (GPCRs), que a su vez desencadenan l....