Artículo de método

Evaluación de la localización del núcleo de la lente de pez zebrafish y integridad sutural

DOI:

10.3791/59528

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6 de mayo de 2019

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1Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine, 2Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

En este artículo

Resumen

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Estos protocolos se desarrollaron para analizar la morfología de las lentes corticales, la integridad estructural de las lentes de pez cebra en lentes fijas y vivas y para medir la posición del núcleo de la lente de pez cebra a lo largo del eje anterior-posterior.

Resumen

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El pez cebra es especialmente adecuado para la manipulación genética y la imagen in vivo , convirtiéndolo en un modelo cada vez más popular para estudios genéticos inversos y para la generación de transgénicos para imágenes in vivo . Estas capacidades únicas hacen que el pez cebra sea una plataforma ideal para estudiar el desarrollo de lentes oculares y la fisiología. Nuestros hallazgos recientes que un Aquaporin-0, Aqp0a, es necesario para la estabilidad de la sutura de la lente anterior, así como para el cambio del núcleo de la lente al centro de la lente con la edad nos llevó a desarrollar herramientas especialmente adecuadas para el análisis de las propiedades de las lentes de pez cebra. Aquí describimos métodos detallados para la disección de lentes que se pueden aplicar tanto a las lentes larvaria como a las adultas, para prepararlas para el análisis histológico, la inmunohistoquímica y las imágenes. Nos centramos en el análisis de la integridad de la sutura de la lente y la morfología de las células corticales y comparamos los datos generados a partir de lentes diseccionadas con datos obtenidos de imágenes in vivo de morfología de lentes hechas posibles por una novela línea de pez cebra transgénica con un marcador fluorescente codificado. El análisis de las lentes diseccionadas perpendiculares a su eje óptico permite cuantificar la posición relativa del núcleo del objetivo a lo largo del eje anterior-posterior. Se requiere el movimiento del núcleo de la lente desde una posición anterior inicial hasta el centro para la óptica de lente normal en el pez cebra adulto. Por lo tanto, una medida cuantitativa de la posición nuclear de la lente se correlaciona directamente con sus propiedades ópticas.

Introducción

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El pez cebra es un excelente modelo para el estudio del desarrollo de lentes y la fisiología debido a las similitudes anatómicas con las lentes de mamíferos, la relativa facilidad de manipulación genética y farmacológica, la velocidad del desarrollo embrionario de los ojos, el tamaño pequeño y la transparencia en etapas tempranas que permiten la creación de imágenes in vivo . Los métodos descritos aquí se desarrollaron para analizar la morfología de las lentes de pez cebra en etapas embrionarias y adultas con un enfoque en la integridad sutural, la morfología de la membrana cortical in vitro e in vivo, y la ubicación de la posición nuclear de la lente a lo largo del eje anterior-posterior ex vivo. Estos métodos sirven como punto de partida para estudios funcionales de desarrollo de lentes y fisiología, así como pantallas genéticas inversas para fenotipos de lentes en pez cebra.

Morfología de lente de pez cebra de imagen

Aquaporin 0 (AQP0) es la proteína de membrana de lente más abundante y es fundamental para el desarrollo de lentes y la claridad, debido a múltiples funciones esenciales en los mamíferos. El pez cebra tiene dos Aqp0s (Aqp0a y Aqp0b) y hemos desarrollado métodos para analizar la pérdida de sus funciones tanto en lentes embrionarias como adultas. Nuestros estudios revelan que aqp0a-/-los mutantes desarrollan opacidad polar anterior debido a la inestabilidad de la sutura anterior, y los mutantes dobles aqp0a/b desarrollan opacidad nuclear1. Se ha demostrado que AQP0 juega papeles en el transporte de agua2, la adherencia3,4, el anclaje citoesquelético5 y la generación del índice de refracción gradiente6, pero estos estudios se han realizado en gran parte en Vitro. El pez cebra proporciona una oportunidad única para estudiar cómo la pérdida de la función, o la función perturbada de Aqp0a o Aqp0b afectaría la morfología y la función en un lente vivo. Para evaluar la morfología de las células de los lentes y la integridad sutural durante el desarrollo, modificamos los métodos inmunohistoquímicos in vitro existentes7 para su uso en lentes embrionarias y adultas, y generamos transgénicos para monitorear este proceso in vivo .

El análisis inmunohistoquímico de la estructura de la membrana plasmática y la integridad sutural se realizó en embriones fijos enteros y lentes para adultos. Las lentes de pez cebra son extremadamente pequeñas (el diámetro de la lente es de ~ 100 μm en embriones y hasta 1 mm en adultos) en comparación con sus homólogos de mamíferos y tienen suturas puntuales8, que se capturan con poca frecuencia en las criáreas. Por lo tanto, las lentes enteras son esenciales para analizar la integridad sutural. Para el análisis in vivo de la formación de sutura anterior, y la creación de imágenes de la arquitectura precisa de células de lentes, generamos transgénicos expresando Mapple específicamente las membranas de los lentes.

Las ventajas de la imagen en vivo de transgénicos de membrana de lente incluyen: 1) evitar artefactos de fijación, 2) estudiar cambios morfológicos dinámicos en películas de lapso de tiempo, y 3) permitir estudios longitudinales en los que los eventos anteriores pueden correlacionarse con más adelante Fenotipos. La pigmentación del iris normalmente previene imágenes claras de la periferia de la lente. La adición de 1-fenil 2-tiourea (PTU) antes de la fase9 de primordia-5 (Prim-5) previene la melanogénesis y la pigmentación ocular hasta alrededor de 4 días de postfertilización (DPF). Sin embargo, después de 4 DPF, la periferia de la lente está oscurecida in vivo, particularmente en las etapas más antiguas. Además, la densidad de la lente en sí oscurece la imagen de su polo posterior. Por lo tanto, para estudiar la morfología de la periferia de la lente, o la sutura posterior, después de 4 DPF, las lentes deben ser extirpado y fijas.

Se han utilizado líneas de pez pez cebra transgénicos para analizar la estructura de la membrana de la lente embrionaria in vivo10. El Q01 transgénico expresa una proteína fluorescente cian fusionada a una secuencia de objetivo de membrana, Gap43, impulsada por el promotor EF1α y un hexámero del elemento DF4 PAX6 Enhancer ubiadamente en las células de fibra de lente11. El Q01 tiene una expresión extra-lenticular, incluyendo células amacrinas en la retina, que añade señal de fondo si el interés principal es la lente. Desarrollamos una novedosa línea transgénica que expresa un mApple de membrana atada específicamente en la lente, con el objetivo de evitar cualquier señal extra-lenticular.

Localización del núcleo de la lente

Descubrimos que el núcleo de la lente se mueve desde una ubicación anterior inicial en el pez cebra de la larval hasta una ubicación central en el eje anterior-posterior en lentes adultas. Este cambio en la posición del núcleo del objetivo de alto índice de refracción se cree que es un requisito para el desarrollo normal de la óptica de la lente de pez cebra1. Nuestros métodos permiten la cuantificación de la centralización nuclear de la lente en relación con el radio de la lente. Usando este método, mostramos que Aqp0a es necesario para la centralización nuclear de la lente1, y este método simple se puede aplicar a otros estudios del desarrollo y la fisiología de la lente y sus propiedades ópticas en el modelo de pez cebra.

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Protocolo

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Los protocolos animales utilizados en este estudio se adhieren a la declaración ARVO para el uso de animales en Oftalmología y la investigación de la visión y han sido aprobados por el Comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC) de la Universidad de California, Irvine.

1. la cría de peces de cebra y la eutanasia

  1. Levante y mantenga el pez cebra (cepa AB) en condiciones de laboratorio estándar12. Criar embriones en medio embrionario (EM)12. Añadir 0,003% PTU a EM de 20-24 h postfertilización (antes de la etapa Prim-5) para prevenir la formación de pigmentos en embriones12 utilizados para la toma de imágenes en etapas embrionarias9. Elevar las larvas de 6-30 días de postfertilización (DPF) en una dieta de rotíferos vivos hasta 14 DPF, y vivas Artemia después de 14 DPF12.
    PRECAUCIÓN: La PTU es muy tóxica
  2. Anestesiar el pescado usando tricaína hasta que no responda al tacto.
    1. Preparar el caldo de Tricaine combinando 400 mg de acidethylester 3-amino benzoico, con 2,1 mL de Tris de 1 M (pH 9), en 100 mL de ddH2O. ajustar a pH 7,0 y almacenar a-20 ° c.
      PRECAUCIÓN: La Tricaine es tóxica.
    2. Diluir 4,2 mL de caldo de Tricaine en 100 mL de agua del tanque para anestesiar larvas/adultos o en EM para anestesiar embriones (concentración final de tricaína en 0,0165% p/v).

2. fijación de embriones y larvas

Nota: Los protocolos inmunohistoquímicos fueron adaptados de los materiales publicados anteriormente7.

  1. Fijar embriones o larvas dechorionated hasta 2 semanas de postfertilización en 4% (v/v) paraformaldehído (PFA) en solución salina tamponada de fosfato (PBS) durante la noche a 4 ° c en un Rocker.
    PRECAUCIÓN: La PFA es combustible y es cancerígeno.
  2. Lavar los embriones tres veces durante 10 min en PBS, y permeabilizar en PBS con 10% Tritón y 1% DMSO (PBS-T) durante la noche a 4 ° c.
    PRECAUCIÓN: La DMSO es tóxica, es perjudicial por ingestión o absorción de la piel, transporta materiales peligrosos a través de la piel y es combustible. Tritón es tóxico, corrosivo y es peligroso para los ambientes acuáticos.

3. disección de lentillas de larval y de pez cebra adulta

  1. Anestesiar el pez de 6 larvas de DPF hasta la adultez con tricaína hasta que no responda al tacto, pero que aún muestre un latido cardíaco fuerte. Mida la longitud estándar del pez según Schilling (2002) para la puesta en escena13.
  2. Inmediatamente los ojos se usan con tijeras de microdisección y se colocan en un plato de disección en PBS (figura 2 para ojos adultos).
    1. Haga un plato personalizado de 35 mm lleno de silicona para disecciones de lentes. Una vez que la silicona se ha fijado, el consumo de un divot alrededor de 2-3 mm de diámetro y 0,5 mm de profundidad para ininmovilizar ojos/lentes adultos durante la disección.
  3. Disección de lentes de pez cebra adultos
    1. Coloque un ojo de adulto en el plato divot posterior lado arriba lleno de PBS. Inmovilizar el ojo insertando fórceps a < ángulo de 45 ° a través del disco óptico. Tenga cuidado de no rasguño ni comprimir la lente. Realice dos o tres incisiones radiales a través de la retina y la esclerótica desde el disco óptico hasta la zona ciliaria con las tijeras de disección.
    2. Pela la retina y la esclerótica como pétalos de flores e invierte el ojo, con el lado corneal hacia arriba. Inmovilizar la lente indirectamente a través de la manipulación de la esclerótica y la córnea con el lado plano de las tijeras, mientras que la extracción de la retina y los tejidos Unidos con fórceps. Recorte cuidadosamente el exceso de tejido de la lente.
      Nota: Es vital diseccionar cuidadosamente para obtener lentes saludables consistentemente.
  4. Disección de las lentes de pez cebra de larval
    1. Coloque un lado posterior del ojo larval hacia arriba en la parte plana del plato de silicona lleno de PBS y utilice una aguja de tungsteno afilada para hacer cortes radiales a través de la retina y la esclerótica mientras inmovilizar el ojo con otra aguja de tungsteno o fórceps.
      Nota: Tenga cuidado de no dañar la lente.
      1. Afilar la punta de una longitud de 2 cm de 0,1 mm de alambre de tungsteno electrolíticamente suspendiendo la punta del alambre en un 10% (w/v) NaOH y aplicando una corriente alterna de baja tensión14. Fije la aguja en una Piera Pasteur fundiendo el extremo de cristal con un quemador Bunsen.
        Nota: También se pueden utilizar herramientas de disección fina alternativa.
        PRECAUCIÓN: NaOH es corrosivo.
    2. Saque suavemente la lente del ojo disociado con un lado Romo de la aguja, y tire cuidadosamente del tejido adjunto.

4. fijación de las lentes diseccionadas

  1. Fije inmediatamente las lentes diseccionadas en 1,5% (v/v) PFA en PBS durante 24 h a temperatura ambiente (RT). Lave las lentes tres veces en PBS durante 10 min cada una.
  2. Permeabilizar las lentes para el análisis de montaje completo o criproteía para criseccionamiento (ver sección 8).
    1. Permeabilizar las lentes en PBS-T durante la noche a 4 ° c.

5. inmunohistoquímica de lentes

  1. Las membranas de la etiqueta de embriones fijos/larvas o lentes adultas por incubación en Phalloidin-Alexa Fluor 546 (1:200 ) y núcleos celulares con DAPI (1:1000 de 5 mg/ml de stock) en PBS-T durante la noche a 4 ° c.
    PRECAUCIÓN: DAPI es un irritante de la piel y los ojos.
  2. Lavar tres veces con PBS-T durante 10 min cada uno. Tejido transparente por incubación en 30%, 50% y 70% glicerol en PBS-T (v/v) durante al menos 1 h en RT cada uno, o durante la noche a 4 ° c.
  3. Monte el pescado en el 70% de glicerol en PBS-T (v/v) sobre los platos de micropozo de fondo de vidrio de 35 mm con los ojos como planos y rectos contra el resguardo de la cubierta como sea posible. Para los peces más jóvenes, una ligera inclinación lateral anterior puede ayudar a orientar la sutura del objetivo para que sea paralela a la cobertura.

6. Análisis de las suturas de la lente anterior del pez cebra utilizando una línea transgénica en vivo

  1. Genere líneas TG (βB1cry: mAppleCAAX) utilizando el kit Tol215. El sistema de elementos transponibles Tol215 permite una integración estable de la construcción donde Mapple es impulsado por 300 BP del promotor de βb1-crystallin humano16 atado a la membrana por la secuencia caax que resulta en la expresión específicamente en membranas celulares de fibra óptica.
    Nota: Esta construcción (ID: 122451) está disponible para su compra.
    1. En la mañana de la inyección, prepare la mezcla de inyección y manténgase en hielo. Para alcanzar un volumen final de 10 μL que contenga RNasa-y sin DNase-H2O, añadir: 1,5 μl de Huβb1cry: construcción de ADN mAppleCAAX a 50 ng/μl-[0.375-0.75 PG/inyección final], 1,5 ΜL de Tol2 ARNm transposasa a 300 ng/μl (Tol2 kit)15 [15-30 PG/ inyección final], y 1 μL de indicador rojo de fenol al 1% p/v [1 x10-5% (p/v)/inyección final].
    2. Inyectar 50-100 pL de mezcla de inyección en embriones de fase de 1 célula12.
  2. Mida la eficiencia de la transgénesis en los embriones inyectados F0 midiendo la frecuencia de los embriones con lentes positivos mApple a 3 DPF.
    Nota: Espere tener > 80% de eficiencia de transgénesis utilizando este método. Los mosaicos F0 permiten un análisis detallado de las morfologías de membrana de las células individuales. Los diferentes niveles de mosaicismo permiten a uno la imagen de las morfologías de grupos simples o pequeños de células, mientras que la expresión de lente más global permite el análisis de estructuras multicelulares como las suturas de lentes in vivo.
  3. Outcross F0 peces mosaico para generar líneas estables, que etiquetan todas las membranas de las células de fibra. Los fundadores de F0 con el transgénico integrado en la línea germinal generarán crías con integraciones estables que se pueden mantener como líneas transgénicas.

7. Análisis de las suturas de la lente anterior del pez cebra utilizando una línea transgénica en vivo

  1. Anestesiar 3 DPF o un mosaico adulto o pescado transgénico estable y montar en un 1% de agarosa de baja fusión (LMA) con tricaína con el ojo plano contra el resguardo de la tapa de los platos de micropozo de fondo de vidrio.
    1. Disolver 1 g de LMA en 100 mL de EM (sin azul de metileno) para hacer un 1% de LMA. Almacene a largo plazo como 15 mL de stocks a 4 ° c. Microondas para disolver el caldo y almacenarlo a 42 ° c hasta que se utilice cada tubo.
  2. Cubra los pescados hasta 6 DPF con EM con tricaína, o con agua de tanque con Tricaine para adultos cuando se establece LMA.
    1. Mezclar 5 mL de EM sin el azul de metileno o el agua del tanque con 250 μL de caldo de Tricaine y 7 μL de PTU si la toma de imágenes de peces tratados con PTU.

8. Criseccionadores de lentes e inmunohistoquímica

  1. Cryoprotect fija embriones o lentes adultos colocando en un 10% de sacarosa en PBS (w/v), 20% de sacarosa durante 1 h en RT cada uno (o durante la noche a 4 ° c) y durante la noche en un 30% de sacarosa a 4 ° c.
  2. Inserte el tejido en OCT en moldes de base, y luego congele sobre mandriles con OCT. Cryosection a 12-14 μm y recoger en un microscopio Superfrost/Plus diapositivas. Secciones cálidas en la diapositiva durante 10 min en un calentador de diapositivas precalentado a ~ 35 ° c.
  3. Lave las secciones tres veces con PBS durante 10 min cada una. Secciones de etiqueta con Phalloidin-Alexa Flour 546 (1:200) con DAPI (1:1000) o WGA-Alexa Flour 594 (1:200), seguida de tres lavados PBS. Monte con medio de montaje anti-desvanecimiento y cierre de sellado con esmalte de uñas.

9. imágenes

  1. Adquiera imágenes con un microscopio confocal. Adquiera pilas z o cortes ópticos utilizando un objetivo de inmersión en agua de 60x N/A 1,2, o similar, en regiones específicas desde el poste de la lente anterior al posterior. Utilice los siguientes ajustes de adquisición: 1,2 disco ventilado con el láser 561 nm, filtro rojo de Texas para la harina de Phalloidin-Alexa 546 o mApple, o el láser 405 con el filtro UV para DAPI.
  2. Corrija la potencia del láser de intensidad z para contrarrestar la pérdida de señal con profundidad en la lente. Esto permite una señal fuerte en el polo posterior de embriones fijos y vivos de 3 DPF, y una fuerte señal en rodajas ópticas ecuatoriales en lentes de peces adultos.
  3. Compile y visualice imágenes utilizando software de procesamiento de imagen.

10. medición de la localización del núcleo de la lente en el eje anterior-posterior

  1. Orientar las lentes recién excizadas axialmente en PBS en un plato de 35 mm con fondo de cristal, con polos y suturas orientados paralelamente al plano de enfoque. Busque una diferencia en el índice de refracción, que suele producirse en la interfaz de la corteza del objetivo y el núcleo del objetivo para identificar el núcleo de la lente.
    Nota: Los lentes adultos sanos de tipo salvaje son extremadamente transparentes, lo que dificulta ver las suturas y el núcleo del objetivo, o determinar la orientación del objetivo. En este caso, un leve rasguño con fórceps a la cápsula de la lente causa daños leves, lo que hace que las suturas y el núcleo del objetivo sean evidentes en aproximadamente 10 minutos ayudando a orientar la lente para esta medición. Sin embargo, las lentes se vuelven inutilizables para las aplicaciones descendentes, ya que ahora están dañadas.
  2. Tome imágenes de lentes con el núcleo de la lente en foco bajo iluminación de campo brillante con o sin óptica de DIC usando un microscopio de disección con una cámara adjunta. Imagen de un micrómetro bajo el mismo aumento para la calibración.
    1. Haga clic en el botón de vista en vivo, ajuste la configuración de exposición para visualizar el núcleo de la lente y la periferia de la lente, y tome una imagen haciendo clic en el botón de disparo a presión. Guardar como un archivo TIF.
    2. Utilice el software de procesamiento de imagen para calibrar las imágenes de lentes adquiridas. Seleccione la herramienta de línea recta y dibuje una línea de longitud conocida en la imagen del micrómetro, haga clic en analizar | escala establecida. Ingrese la distancia conocida, las unidades y seleccione la calibración "global", y haga clic la autorización.
  3. Mida la distancia del centro del núcleo del objetivo al polo anterior (a-r).
    1. Utilice la herramienta de línea recta en el software de procesamiento de imágenes para dibujar una línea a través del centro imágenes del núcleo de la lente en una orientación axial. Tome el centro de esta línea como el centro del núcleo del objetivo.
    2. Dibuja otra línea desde este punto hasta el polo anterior de la lente y selecciona ' medir ' en el menú ' analizar ' para medir la distancia (a-r), donde a es el radio de la lente y r es la distancia desde el centro de la lente hasta el centro de la Núcleo.
    3. Dibuje otra línea desde la anterior hasta los polos posteriores y mida esta distancia como el diámetro de la lente (2A). Copie estas longitudes desde la ventana "resultados" y transfiera a una hoja de cálculo o programa de estadísticas.
      Nota: Es más fácil medir con precisión desde el centro del núcleo hasta el polo anterior, que la medición desde el centro del núcleo del objetivo hasta el centro de la lente. Esta medida se convierte por la fórmula en el paso 10.3.5 para informar de la distancia del centro del núcleo del objetivo al centro de la lente. Utilice siempre el núcleo adulto para las mediciones, incluso si el núcleo embrionario es evidente.
    4. Divida el diámetro por 2, para calcular el radio de la lente, a.
    5. Calcule r/a, como figure-protocol-1 , que es la localización normalizada del núcleo de la lente con respecto al radio de la lente.
      Nota: para un núcleo colocado más cerca del polo anterior, r/a será > 0.0, mientras que un núcleo localizado centralmente tendrá un r/a de 0,0.
  4. Graficar el tronco de la medición normalizada del núcleo axial como una función de la longitud estándar para determinar los cambios en la localización del núcleo de la lente durante el desarrollo del pez cebra.

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Resultados

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La anatomía del ojo de pez cebra adulta se asemeja mucho a la de los mamíferos (figura 1A). A pesar de algunas diferencias entre el pez cebra y los ojos de los mamíferos, como tener una zona ciliaria en lugar de un cuerpo ciliario17, diferencias en las propiedades ópticas18, y diferencias en la morfogénesis durante el desarrollo embrionario19, el el ojo de pez de zebraes un excelente mode...

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Discusión

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El análisis de la morfología de las lentes de pez cebra es el paso inicial en la comprensión de los fenotipos en los mutantes, o los efectos de las intervenciones farmacológicas destinadas a estudiar la biología de la lente ocular. Describimos métodos para analizar suturas de lentes, morfología de células de fibra cortical y aspectos del núcleo de la lente. Estos enfoques son una combinación de in vitro e in vivo (comparado en el cuadro 1). Los métodos in vitro permiten un mayo...

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Divulgaciones

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No tenemos divulgaciones.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos gustaría reconocer nuestra fuente de financiación: NIH r01 EY05661 a j. e. h., Inés Gehring para ayudar con la generación de los aqp0a/b dobles mutantes y la cría de pez cebra, el Dr. Daniel Dranow para las discusiones que conducen a la generación de la transgénica, Dr. Bruce Los laboratorios de Blumberg y Ken cho para el uso de sus microscopios de disección, y la Dra. Megan Smith para obtener ayuda con el análisis estadístico.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1-fenil-2-tiourea (PTU)SigmaP7629PRECAUCIÓN – solución
acuosa de paraformaldehído al 4%Ciencias de la Microscopía ElectrónicaRT 157-4PRECAUCIÓN – peligro para la salud, combustible
Microscopio confocalNikonEclipse Ti-E
CryostatLeicaCM3050STemperatura del objetivo y de la cámara ajustada a -21 & Grados; C
DAPIInvitrogenD1306PRECAUCIÓN – irritante para los ojos y la piel
Dimethyl Sulfóxido (DMSO)Fisher ScientificD128PRECAUCIÓN – combustible, penetra en la piel 
Molde base desechableVWR Scientific15154-631
Pipetas de vidrio desechables PasteurFisherbrand13-678-20A
Pinzas Dumont #5Dumont & FilsMantenga las pinzas
Sal de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato (Tricaína)Sigma-AldrichA5040PRECAUCIÓN - tóxico
Placa de micropocillos con fondo de vidrio (placa de Petri de 35 mm, micropocillo de 14 mm, cubreobjetos # 1.5)MatTek CorporationP35G-1.5-14-C
GlicerolSigmaG2025
huβ B1cry:mAppleCAAX Construcción de ADNAddgeneID:122451
ImageJWayne Rasband, NIHv1.51n
Low Melt Agarose (LMA)Apex902-36-6
NIS-ElementsNikonV 4.5
NIS-Elements software ARNikon
Olympus  con un modelo 2.1.1.183 controladorOlympus CorpMicroscopio DP70
Olympus Olympus CorpSZX12
Phalloidin-Alexa Flour 546Thermo FisherA22283
Indicador de rojo fenol (1% p/v)Ricca Chemical Company5725-16
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Fisher ScientificBP399
PhotoshopAdobeCS5 v12.0
Software de PhotoshopAdobeCS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD objetivoNikon
Fuente de alimentaciónWild HeerbruggMTr 22O fuente de alimentación equivalente 
Calentador de portaobjetos modelo No. 26020FSFisher Scientific12-594
Perlas de hidróxido de sodioFisher ScientificS612-3PRECAUCIÓN - corrosivo/irritante para los ojos y la piel, órgano diana - sistema respiratorio, corrosivo para los metales
portaobjetos de microscopio Superfrost/PlusFisher Scientific12-550-15
Sylgard 184 silicona Dow CorningWorld Prevision Instruments
Tissue-Tek O.C.T. CompuestoSakura Finetek4583
Triton X-100 BioXtraSigmaT9284PRECAUCIÓN – Tóxico, peligroso para el medio ambiente acuático, corrosivo
Tijeras de microdisección VannasTed Pella Inc1346Puntas rectas afiladas/afiladas
Medio de montaje antidecoloración VectashieldLaboratorios vectorialesH-1000
Aglutinina de germen de trigo (WGA)-Alexa Flour-594Life TechnologiesW11262
muy tóxico afiladasSYLG184

Referencias

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