Métodos para probar la interrupción endocrina en Drosophila melanogaster

Resumen

Los productos químicos disruptores endocrinos (EDC) representan un problema grave para los organismos y para los entornos naturales. Drosophila melanogaster representa un modelo ideal para estudiar los efectos de la EDC in vivo. Aquí, presentamos métodos para investigar la interrupción endocrina en Drosophila, abordando los efectos de la EDC sobre la fecundidad, fertilidad, tiempo de desarrollo, y la vida útil de la mosca.

Resumen

En los últimos años ha habido creciente evidencia de que todos los organismos y el medio ambiente están expuestos a productos químicos similares a las hormonas, conocidos como productos químicos disruptores endocrinos (EDC). Estos productos químicos pueden alterar el equilibrio normal de los sistemas endocrinos y conducir a efectos adversos, así como un número creciente de trastornos hormonales en la población humana o crecimiento perturbado y reproducción reducida en las especies de vida silvestre. Para algunas EDCs, hay efectos documentados para la salud y restricciones en su uso. Sin embargo, para la mayoría de ellos, todavía no hay evidencia científica en este sentido. Con el fin de verificar los posibles efectos endocrinos de un producto químico en todo el organismo, necesitamos probarlo en sistemas modelo adecuados, así como en la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster. Aquí informamos protocolos in vivo detallados para estudiar la interrupción endocrina en Drosophila, abordando los efectos de la EDC en la fecundidad/fertilidad, tiempo de desarrollo y vida útil de la mosca. En los últimos años, utilizamos estos rasgos de vida Drosophila para investigar los efectos de la exposición a 17-o-etinilestradiol (EE2), bisfenol A (BPA), y bisfenol AF (BPA F). En conjunto, estos ensayos cubrieron todas las etapas de la vida de Drosophila y hicieron posible evaluar la interrupción endocrina en todos los procesos mediados por hormonas. Los ensayos de fecundidad/fertilidad y tiempo de desarrollo fueron útiles para medir el impacto de la EDC en el rendimiento reproductivo de la mosca y en las etapas del desarrollo, respectivamente. Por último, el ensayo de vida útil implicó exposiciones crónicas de la EDC a adultos y midió su supervivencia. Sin embargo, estos rasgos de vida también pueden ser influenciados por varios factores experimentales que tuvieron que ser cuidadosamente controlados. Por lo tanto, en este trabajo, sugerimos una serie de procedimientos que hemos optimizado para el resultado correcto de estos ensayos. Estos métodos permiten a los científicos establecer la interrupción endocrina para cualquier EDC o para una mezcla de diferentes EDC en Drosophila, aunque para identificar el mecanismo endocrino responsable del efecto, podrían ser necesarios ensayos adicionales.

Introducción

Las actividades humanas han estado liberando al medio ambiente una enorme cantidad de productos químicos, que representan un grave problema para los organismos y para los ecosistemas naturales¹. De estos contaminantes, se estima que unos 1.000 productos químicos diferentes pueden alterar el equilibrio normal de los sistemas endocrinos; según esta propiedad, se clasifican como sustancias químicas disruptoras endocrinas (EDC). Específicamente, sobre la base de una definición reciente de la Sociedad Endocrina, las EDC son "un químico exógeno, o mezcla de productos químicos, que puede interferir con cualquier aspecto de la acción hormonal"

Protocolo

1. Preparación de alimentos

1. Para el mantenimiento de las poblaciones y para el crecimiento larvario, utilice un medio de harina de maíz que contenga un 3 % de levadura en polvo, un 10 % de sacarosa, un 9 % de harina de maíz precocida, un 0,4 % de agar, denominado a partir de entonces medio de harina de maíz (CM).
   1. Poner 30 g de levadura en 100 ml de agua del grifo, llevarla a ebullición y dejar hervir durante 15 minutos.
   2. Por separado, mezcle bien 90 g de harina de maíz precocida, 100 g de azúcar y 4 g de agar en 900 ml de agua del grifo.
   3. Pon a hervir la solución, baja el fuego y cocina durante 5 minutos revolv....

Resultados

En esta sección, los pasos clave de los protocolos anteriores se notifican en forma de esquemas simplificados. Dado que las moscas tienden a evitar compuestos desagradables, lo primero que hay que hacer es probar el sabor de la EDC seleccionada. Esto se puede hacer mezclando un colorante alimentario (por ejemplo, tinte de alimentos rojos no 40)³⁵ con el alimento complementado con la EDC seleccionada en varias dosis o solo con el disolvente. Las moscas alimentadas en estos medios se examinan bajo u.......

Discusión

La mosca de la fruta D. melanogaster ha sido ampliamente empleada como un sistema modelo in vivo para investigar los efectos potenciales de los EDC ambientales como DBP^28,BPA, 4-NP, 4-tert-OP²⁹, MP³⁰, EP^{31, 32}, DEHP³³y EE2³⁴. Varias razones han llevado a su uso como modelo en este campo de investigación. Aparte de sus ventajas indiscut.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
17α-Etinilestradiol	Sigma	E4876-1G
Agar para medio Drosophila	BIOSIGMA	789148
Bisfenol A	Sigma	239658-50G
Bisfenol AF	Sigma	90477-100MG
Harina de maíz	CA' BIANCA
Éter dietílico	Sigma
Drosophila Viales	BIOSIGMA 789008		25 mm x 95 mm
Drosophila Viales	BIOSIGMA		789009 29 mm x 95 mm
Drosophila Vials Kaltek		187	22 mm x 63 mm
Jaula de recolección de embriones	Artesanía		Cilindro de plexiglás (12,5 mm x7 cm) con un extremo abierto y el otro extremo cerrado por una base rectangular en la que una ranura permite la inserción de Bandejas especiales para la colocación
de etanol	FLUKA	2860
Etherizer	Crafts		Recipiente de vidrio cilíndrico con tapón de algodón
Botella			Botellas de 250 mL
Viales de vidrio	Microtech	ST 10024	Tubo de fondo plano 100 x 24
Batidora de mano Pimmy	Ariete		Robot de cocina
Instant Levadura de éxito	ESKA		Levadura en polvo
Bandeja de colocación	Bandejas		de plexiglás artesanales (11 cm x 2,6 cm) en las que verter medio para la colocación
Hidroxibenzoato de metilo	SIGMA	H5501
Placa de Petri	Falcon		351016 60x5
Tinte rojo n.º 40	SIGMA	16035
Microscopio estereoscópico con luces LED	Leica		S4E
Sacarosa	HIMEDIA	MB025
Salsa de tomate	Cirio

de vidrio