Artículo de método

Aislamiento de partículas de lipoproteínas de yema de huevo de pollo para el estudio de la incorporación de ácidos grasos patógenos bacterianos en fosfolípidos de membrana

DOI:

10.3791/59538

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15 de mayo de 2019

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1Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, 2Department of Physiology, Michigan State University

En este artículo

Resumen

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Este método proporciona un marco para el estudio de la incorporación de ácidos grasos exógenos de fuentes huésped complejas en membranas bacterianas, particularmente Staphylococcus aureus. Para lograrlo, se describen los protocolos para el enriquecimiento de partículas de lipoproteínas a partir de la yema de huevo de pollo y el posterior perfilado de ácidos grasos de fosfolípidos bacterianos utilizando espectrometría de masas.

Resumen

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Staphylococcus aureus y otros patógenos Gram-positivos incorporan ácidos grasos del medio ambiente en fosfolípidos de membrana. Durante la infección, la mayoría de los ácidos grasos exógenos están presentes dentro de las partículas de lipoproteínas del huésped. Sigue habiendo incertidumbre en cuanto a los reservorios de ácidos grasos huésped y los mecanismos por los cuales las bacterias extraen ácidos grasos de las partículas de lipoproteínas. En este trabajo, describimos protocolos para el enriquecimiento de partículas de lipoproteínas de baja densidad (LDL) a partir de yema de huevo de pollo y determinando si los LDL sirven como reservorios de ácidos grasos para S. aureus. Este método explota el análisis lipidémico imparcial y los LDL de pollo, un modelo eficaz y económico para la exploración de interacciones entre LDL y bacterias. El análisis de la integración de S. aureus de ácidos grasos exógenos de lDL se realiza utilizando espectrometría de masas de alta resolución/precisa y espectrometría de masas en tándem, permitiendo la caracterización de la composición de ácidos grasos de la bacteria identificación imparcial de nuevas combinaciones de ácidos grasos que surgen en los lípidos de la membrana bacteriana al exponerse a los LDL. Estas técnicas avanzadas de espectrometría de masas ofrecen una perspectiva sin igual de la incorporación de ácidos grasos al revelar los ácidos grasos exógenos específicos incorporados en los fosfolípidos. Los métodos descritos aquí son adaptables al estudio de otros patógenos bacterianos y fuentes alternativas de ácidos grasos complejos.

Introducción

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S. aureus resistente a la meticilina (MRSA) es la principal causa de infección asociada a la atención sanitaria y la resistencia a los antibióticos asociada es un desafío clínico considerable1,2,3. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas es una alta prioridad. Una estrategia de tratamiento prometedora para patógenos Gram-positivos está inhibiendo la síntesis de ácidos grasos, un requisito para la producción de fosfolípidos de membrana que, en S. aureus, incluye fosfatidilglicerol (PG), lisil-PG, y cardiolipina4.....

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Protocolo

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NOTA: El siguiente protocolo para el enriquecimiento de partículas LDL de yema de huevo de pollo se deriva de Moussa et al. 200233.

1. Preparación de yema de huevo de pollo para el enriquecimiento de partículas LDL

  1. Desinfecte dos huevos de pollo grandes lavando las cáscaras con una solución de etanol al 70% y deje secar al aire.
  2. Desinfecte el separador de huevos con una solución de etanol al 70% y deje secar al aire. Coloque el separador de huevos en el labio de un vaso de precipitados de tamaño mediano.
  3. Rompe cada huevo individualmente en el separador de huevos y deja que el albúmina fl....

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Resultados

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El protocolo para el enriquecimiento de LDL a partir de la yema de huevo de pollo se ilustra en la Figura1. Este proceso comienza diluyendo la yema de huevo entera con salina y separando los sólidos de yemade huevo conocidos como gránulos de la fracción soluble o plasmática que contiene los LDL (Figura 1)33. El contenido de LDL de la fracción plasmática se enriquece aún más con la

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Discusión

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S. aureus incorpora ácidos grasos exógenos en su membrana fosfolípidos27,32,43. La síntesis de fosfolípidos utilizando ácidos grasos exógenos evita la inhibición de faSII, pero también altera las propiedades biofísicas de la membrana27,32,44. Si bien la incorporación de ácidos grasos exógenos en fosfolípidos de patógenos Gram-p.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen revelaciones.

Agradecimientos

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Agradecemos a los miembros del laboratorio Hammer por su evaluación crítica del manuscrito y el apoyo de este trabajo. El Dr. Alex Horswill de la Escuela de Medicina de la Universidad de Colorado amablemente proporcionó AH1263. El laboratorio del Dr. Chris Waters de la Universidad Estatal de Michigan proporcionó reactivos. Este trabajo fue apoyado por la concesión 16SDG30170026 de la Asociación Americana del Corazón y los fondos de puesta en marcha de la Universidad Estatal de Michigan.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Sulfato de amonioFisherBP212R-1≥ 99,5% de pureza
Incubadora de cultivos celularesThermoMaxQ 6000
CentrafugeThermo75-217-420Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE
Placa de ensayo CostarCorning378896 pocillos
Papel de filtroSchleicher & Schuell597
Huevo de gallina grandeN/AN/AHuevo comprado en la tienda común
Espectrofotómetro de microplacasBioTekEpoch 2
NaClSigmaS9625
S. aureus cepa AH1263N/AN/AProporcionado por Alex Horswill de la Universidad de Colorado
Tubo de diálisisPierce687007,000 MWCO
TryptoneBecton, Dickison and Company211705
perlas de óxido de circonio de 0,5 mmSiguiente AdvanceZROB05
Bullet BlenderSiguiente AdvanceBBX24B
Metanol (grado LC-MS)FisherA4561
Cloroformo (grado reactivo)FisherMCX10559
Isopropanol (grado LC-MS)FisherA4611
DimiristoilfosfatidilcolinaAvanti Lípidos Polares850345C-25mg
Bicarbonato de amonioSigma9830≥ 99,5% de pureza
Formiato de amonioSigma70221-25G-F
Software XcaliburThermo ScientificOPTON-30801
LTQ-Orbitrap Espectrómetro de masas VelosThermo Scientificalta resolución/precisión
Agilent 1260 HPLC capilarAgilent
SpeedVac ThermoScientific
de MS

Referencias

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  1. Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
  2. Noskin, G. A., et al.

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Etiquetas

Aislamiento de LDLStaphylococcus aureusespectrometr a de masasan lisis lipid micoprecipitaci n con sulfato de amoniomembrana de di lisisinyecci n de flujo

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