Aquí se presenta un protocolo para medir las células CD4+ T proliferantes en respuesta a proteínas antigénicas o péptidos mediante dilución de tinte. Este ensayo es particularmente sensible a las células T específicas del antígeno poco frecuente y se puede modificar para facilitar la clonación de células específicas del antígeno.
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Artículo de método
Cuantificación de células CD4+ T específicas de antígenos humanos que utilizan éster de succinidilo de carboxifluoresceína
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Resumen
Resumen
Descrito es un método simple, in vitro, basado en la dilución de tinte para medir la proliferación de células CD4+ T específicas de antígenos en células mononucleares de sangre periférica humana (PPC). El desarrollo de tintes fluorescentes estables, no tóxicos, como el éster de carboxifluoresceína succinimidyl (CFSE) permite distinguir las células T raras específicas del antígeno de los transeúntes por la disminución de la tinción fluorescente, detectada por la citometría de flujo. Este método tiene las siguientes ventajas sobre los enfoques alternativos: (i) es muy sensible a las células T de baja frecuencia, (ii) no se requiere conocimiento del antígeno o epítopo, (iii) se puede analizar el fenotipo de las células que responden, y (iv) ser viable, responder, respondiendo, respondiendo, respondiendo, respondiendo, respondiendo células se pueden ordenar y utilizar para análisis adicionales, como clonación de células T.
Introducción
La capacidad de detectar y estudiar células T específicas del antígeno es importante en estudios de inmunidad mediada por células. Sin embargo, hacerlo es particularmente difícil para las respuestas CD4+ Células T específicas de autoantígenos, que son muy débiles y difíciles de detectar. Un método común utilizado para la detección de la proliferación de linfocitos específicos de antígenos es [3H]-timidina, que es un nucleótido radiomarcado incorporado en el ADN de las células que proliferan. Aunque el ensayo [3H]-timidina puede detectar la síntesis de ADN, este método es una medida indirecta de la división celular, porque la síntesis de ADN puede iniciarse ....
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Protocolo
Todos los sujetos dieron su consentimiento informado antes de la recolección de sangre periférica. La aprobación ética para experimentos con PBMC fue dada por St. Vincent's Hosptial (HREC-A 135/08, y HREC-A 161/15).
1. Preparación de reactivos
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Medios de células T humanas
- Preparar medios RP-5 para el cultivo de PBMC, que consiste en RPMI 1640, 1x aminoácidos no esenciales, Dipéptido L-aanyl-L-glutamina (2 mM), penicilina (100 U/ml)/estreptomicina (0,1 mg/ml) y 5% suero humano agrupado (PHS).
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Soluciones bursátiles de CFSE
- Preparar un stock maestro disolvi....
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Resultados
Estimulación in vitro de PASTRO humanos con proteína toxoide del tétanos: los PBMU se mancharon con CFSE y se estimularon durante 7 días en presencia de toxoide de tétanos. Casi todos los donantes mostraron una fuerte respuesta de células T al toxoide del tétanos porque habían sido vacunados, lo que hace que el toxoide del tétanos sea un antígeno de control positivo útil. La Figura 2 demuestra en triplicado, que la proliferación CFSE de células CD4+
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Discusión
La proliferación basada en CFSE es un método simple y robusto para detectar y enumerar células CD4+ T humanas específicas del antígeno. Se ha demostrado previamente que el uso de la concentración óptima de CFSE es esencial para obtener resultados óptimos4. Demasiada CFSE abroga la proliferación, mientras que muy poco no permite distinguir las células divididas e indivisas. Por el contrario, se utilizan concentraciones relativamente altas (5,0 m)de CFSE para etiqu.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por: The Juvenile Diabetes Research Foundation [JDRF 5-CDA-2014-210-A-N] (S. M.). El Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (NHMRC GNT123586) (S. M.), Diabetes Australia Research Trust Millennium Award (Y17M1-MANS) (S. M.), Programa de Apoyo a la Infraestructura Operacional del Gobierno Victoriano (S. M., A. D., E. T., M. S.) y NHMRC Beca de posgrado APP1094337 y Beca JDRF Ph-up (M. S.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anti-humano CD4-AlexaFluor647 | Biolegend | 317422 | RRID:AB_2716180 |
| Carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) | ThermoFisher | C1157 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| Glutamax (1x) | Gibco | 35050 | |
| Influenza A H1N1 (PR8) Proteína de matriz 1 | Sino Biological | 40010- V07E | |
| Aminoácidos no esenciales (1x) | Gibco | 11140 | |
| Penicilina/Estreptomicina (1x) | Gibco | 15070063 | |
| solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Suero humano combinado | Cruz Roja Australiana | N/A | |
| Proinsulina C-péptido PI33-63 | Purar Chemicals | N/A | Personalizado Péptido sintético |
| hecho RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Proteína del toxoide tetánico | Statens Suero Intitut | N/A |
Referencias
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of BrdU and 3H-Thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position and fate. Journal of Neuroscience. 31, 15205-15217 (2011).
- Mannering, S. I., Zhong, J. I. E., Cheers, C.
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Reimpresiones y permisos
