La preparación de nanopartículas poliméricas con capacidad de pH, cargadas de neutralmente, para la entrega de siRNA citosólica

Resumen

Se presentan los métodos para preparar y caracterizar las propiedades fisicoquímicas y la bioactividad de las nanopartículas de siRNA con respuesta al pH, que son neutralmente cargadas. Se discuten los criterios para los nanomedicamentos siRNA exitosos, como el tamaño, la morfología, la carga superficial, la carga de siRNA y el silenciamiento del gen.

Resumen

El éxito de siRNA como medicina molecular dirigida depende de su eficiente entrega citosólica a las células dentro del tejido de la patología. Se ha logrado el éxito clínico para el tratamiento de los objetivos de enfermedad hepática previamente ' no druggable ' con siRNA. Sin embargo, la entrega eficiente de siRNA tumoral requiere consideraciones adicionales de diseño farmacocinético, incluyendo tiempo de circulación prolongado, evasión de órganos de aclaramiento (p. ej., hígado y riñones), y penetración y retención de tumores. Aquí describimos la preparación y la caracterización fisicoquímica/biológica in vitro de nanopartículas poliméricas diseñadas para el parto eficiente de siRNA, particularmente a los tejidos no hepáticos como los tumores. Las nanopartículas de siRNA se preparan mediante la compleción electrostática de siRNA y el copolímero de dibloque poli (etilenglicol-b-[2-(dimetilamino) etil metacrilato-Co-butilo metacrilato]) (PEG-dB) para formar complejos poliónicos ( poliplexos) donde siRNA es secuestrado dentro del núcleo de POLIPLEX y PEG forma una corona hidrófila, con carga neutra. Por otra parte, el bloque DB se convierte en membrana-lítica como vesículas de la vía endolisosomal acidificación (< pH 6,8), desencadenando la fuga endosómica y la entrega citosólica de siRNA. Se describen los métodos para caracterizar las características fisicoquímicas de las nanopartículas de siRNA, como el tamaño, la carga superficial, la morfología de las partículas y la carga de siRNA. La bioactividad de las nanopartículas de siRNA se mide utilizando luciferasa como un gen modelo en un ensayo de silenciamiento del gen rápido y de alto rendimiento. Los diseños que superan estas pruebas iniciales (como los poliplexos basados en PEG-DB) se consideran apropiados para la traducción a estudios en animales preclínicos que evalúan la entrega de siRNA a tumores u otros sitios de patología.

Introducción

Debido a que los siRNAs inhiben la traducción de las proteínas de las secuencias de mRNA, teóricamente pueden ser utilizados para drogas todas las patologías conocidas^1,2,3,4,5. Sin embargo, el uso de siRNA en medicina está limitado por el perfil farmacocinético de las moléculas de siRNA^6,7. Cuando se inyecta por vía intravenosa, los siRNAs se borran rápidamente a través de los riñones y/o se degradan mediante nucleasas^8,9. Debido a su gran tamaño y carga negativa, siRNA no puede entrar en las células o escapar de la vía endolisosomal para acceder al complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) que reside en el citosol^{10,11,12, 13}. Así, un extenso esfuerzo se ha centrado en el diseño e implementación de las estrategias de entrega de siRNA¹⁴. Este esfuerzo se ha centrado en gran medida en el desarrollo de nanopartículas a base de lípidos y polímeros que empaquetan siRNA, la protegen del aclaramiento y la degradación in vivo, e inician la captación celular y el escape endosómico a través de grupos de Amina catiónica ionizable. Se han notificado muchos éxitos preclínicos y, más recientemente, se ha notificado el primer éxito clínico de la entrega de siRNA hepática basada en nanopartículas para tratar la amiloidosis¹⁵mediada por transthyretin hereditaria (hattr).

Hay muchos genes causantes del cáncer que actualmente son "no druggable" por Farmacología convencional (es decir, fármacos de moléculas pequeñas), motivando el diseño de nanopartículas de siRNA poliméricas (si-NPs) para tratar el cáncer¹⁶. Sin embargo, hay un conjunto separado de parámetros de diseño que deben tenerse en cuenta para la entrega no hepática de siRNA. El sistema de entrega debe proteger la carga catiónica del Polyplex que causa la aglutinación dentro de la circulación sistémica^17,18,19. Para la entrega del tumor, específicamente, la estabilidad del si-NP es esencial para dotar de una larga circulación y así aumentar la acumulación dentro de los tumores a través del efecto de permeabilidad y retención mejorada (EPR)^20,21. Además, el control sobre el tamaño del si-NP es esencial ya que sólo las nanopartículas de aproximadamente 20 – 200 nm de diámetro en tamaño aprovechan EPR²², y el si-NPS más pequeño (~ 20 – 50 nm de diámetro) exhiben una mejor penetración tumoral sobre nanopartículas de mayor tamaño y micropartículas²³.

Para abordar estas limitaciones adicionales de diseño para la administración de tumores sistémicos de siRNA después de la administracion intravenosa, se han desarrollado los si-NPs con capacidad neutralmente, con pH-sensible (figura 1)²⁴. Estos si-NPs son PEGylated, o más recientemente, Zwitterionated²⁵, para la carga superficial neutral y la resistencia a la adsorción proteica y la opsonización en circulación. Dado que no pueden depender únicamente del carácter catiónico para impulsar el parto intracelular, es imprescindible un escape endosómico extremadamente eficiente para lograr un potente silenciamiento del gen. En consecuencia, el núcleo de estos si-NPs se compone de un núcleo altamente endosomolítico que es inerte al pH extracelular (7,4), pero que se desencadena de una manera de tipo interruptor en las condiciones acidificadas de la vía endolisosomal [pH 6,8 (endosomas tempranos) – 5,0 ( lisosomas)]. Por último, una mezcla de contenido catiónico e hidrófobo dentro del núcleo del si-NPs proporciona fuerzas de estabilización tanto electrostáticas como de van der Waals, mejorando la estabilidad del si-NPs en sangre en comparación con los sistemas meramente catiónicos.

La integración de muchas funciones en un diseño relativamente simple es posible utilizando la polimerización reversible de transferencia de la cadena de fragmentación (RAFT) para producir polímeros con una arquitectura compleja y una composición precisa. Para producir si-NPs con carga superficial neutral, respuesta de pH, y estabilidad NP, balsa se utiliza para sintetizar poli (etilenglicol-b-[2-(dimetilamino) etil metacrilato-Co-butilo de metacrilato]) (PEG-dB; Figura 1A). PEG-DB es completamenteado electrostaticamente con siRNA, formando si-NPs con una corona de PEG y núcleo de DB/siRNA (figura 1B). El PEG forma una capa hidrófila inerte de carga neutra en la corona si-NP. El bloque DB se compone de una relación 50:50 molar de 2-(dimetilamino) etil metacrilato (DMAEMA) y metacrilato de butilo (BMA). Cationic DMAEMA electrostaticamente complejos con carga negativa siRNA. Los autoasociados de BMA dentro del núcleo NP por las interacciones de van der Waals, aumentando la estabilidad NP. Juntos, DMAEMA y BMA imparten un comportamiento lipídico bicapa-lítico dependiente del pH al bloque de polímero DB. En el pH extracelular, el bloque DB está secuestrado en el núcleo si-NP y es inerte a las bicapas lipídicas. En condiciones ácidas, como las que están dentro de la vía endolisosomal, el DMAEMA ionizables dentro del bloque DB facilita el efecto de la esponja de protones, donde el tampón endosómico conduce a la hinchazón osmótica y la ruptura²⁶. Adicionalmente, las mitades hidrófobas del BMA dentro del bloque DB se integran activamente en las bicapas lipídicas y Lyse, resultando en una potente endosomolisis. Por lo tanto, siRNA es complejado con PEG-dB para formar si-NPS que son neutralmente cargados y altamente estables a pH extracelular pero que interrumpen bicapas lipídicas a pH ácido, asegurando la entrega citosólica de la carga útil siRNA.

Aquí se describen los procedimientos experimentales para producir si-NPs de PEG-DB. Se presentan y discuten los métodos para caracterizar los parámetros fisicoquímicos y la bioactividad del si-NPs. Con el fin de evaluar rápidamente la bioactividad de si-NP, luciferasa se utiliza como un gen modelo para los estudios de Knock-down. Luciferasa luciérnaga es la proteína responsable del "resplandor" de las luciérnagas²⁷. En consecuencia, las células de mamíferos transfectadas con el gen luciferasa Firefly producen un «resplandor» bioluminiscente que puede capturarse utilizando un luminómetro para cuantificar los niveles de expresión de luciferasa. Aquí, utilizamos luciferase para evaluar la bioactividad del si-NPs entregando siRNA contra luciferasa y cuantificando la correspondiente reducción en la bioluminiscencia en las células que expresan luciferasa en comparación con las células que reciben un siRNA revueltos.

Protocolo

1. preparación y caracterización del si-NPs

1. la preparación del si-NP
   1. Disolver el polímero en tampón de ácido cítrico de 10 mM (pH 4,0) a 3,33 mg/mL. El polímero se puede disolver primero a una concentración de 10 veces en etanol para asegurar la disolución.
      Nota: el polímero puede disolverse a concentraciones más bajas, pero el uso a concentraciones superiores a 3,33 mg/mL puede prevenir la formación de NP homogénea.
   2. Añadir siRNA (50 μM en diH₂O) para dar como resultado N⁺:P^- ratio de 10. Mezcle las soluciones de polímero y siRNA a fondo mediante pipeteo y deje incubar durante 30 min. El N⁺:P^- ratio representa el número de grupos de Amina positivamente cargados en el polímero al número de grupos fosfato con carga negativa en el siRNA y se calcula por la siguiente fórmula:
      
      donde, mol Pol es la cantidad molar de polímero, la amina RU es el número de unidades repetidas de aminas cargadas positivamente por polímero, mol siRNA es la cantidad molar de siRNA, y BP siRNA es el número de pares de base por molécula de siRNA.
   3. Agregue un exceso de 5 veces el tampón de fosfato de 10 mM (pH 8,0) y mezcle suavemente mediante el pipeteo o la inversión del tubo. Para confirmar que el pH final es neutro (~ 7.2-7.5), Pipetear 10 μL de solución si-NP en tiras de prueba de pH.
      Nota: los tampones de ácido cítrico y fosfato se preparan de acuerdo con las cartas del centro de referencia de Millipore Sigma buffer.
2. Caracterización fisicoquímica de si-NPs
3. Registre el tamaño y la carga superficial del si-NPs resultante mediante la dispersión de luz dinámica (DLS). Prepare una muestra de DLS filtrando 1 mL de si-NPs (0,1 – 1,0 mg/mL) a través de filtros de jeringa de tamaño de poro de 0,45 μm en una cubeta cuadrada de cuarzo o poliestireno. Registre las mediciones de tamaño y carga superficial utilizando un instrumento DLS de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
   1. Confirme el tamaño y la morfología del si-NPs mediante el análisis por imágenes mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM).
      1. Añadir 5 μL de solución si-NP a 1 mg/mL a las rejillas TEM e incubar durante 60 s. seque durante 3 s.
      2. Añadir 5 μL de solución de acetato de uranil al 3% e incubar durante 20 s. seque durante 3 s. rejillas secas durante la noche bajo desecación.
      3. Rejillas de imagen según el protocolo establecido para el microscopio específico que se utilizará.
   2. Caracterizar la carga de siRNA en si-NPS en varios N⁺:P^- proporciones usando retardación de gel de agarosa.
      1. Para producir gel de agarosa al 2%, añada 2 g de polvo de agarosa de grado electroforesis a 100 mL de buffer 1x TAE (tris-acetato-EDTA) a pH 8,0. Remover para suspender la agarosa. Calor descubierto en el microondas hasta que toda la agarosa se disuelva (1-3 min).
      2. Una vez enfriado, añadir 5 μl de bromuro de etidio (10 mg/ml en H₂O), y mezclar bien. Vierta la agarosa en una bandeja de gel y coloque el peine para producir pozos, dejando secar durante 30 min. Retire cuidadosamente el peine para dejar los pozos de carga, y llene la bandeja de gel a la línea de llenado máximo con 1x TAE buffer.
      3. Genere si-NPs (según el procedimiento anterior) en 0, 1, 2, 5, 7, 10, 20, y 40 N⁺:P^- proporciones. Colocar 2 μL de alícuotos de tinte de carga (sin SDS y agentes reductores) en la película de parafina para cada formulación de si-NP. Mezclar 10 μL de solución si-NP con un tinte de carga en la película de parafina mediante pipetas.
      4. Añadir soluciones de colorante si-NP/carga a pozos de gel de agarosa. Ejecute la fuente de tensión a 100 V para 35 min (o hasta que las muestras hayan atravesado el 80% de la longitud del gel).
      5. Visualice las bandas siRNA en un transilluminador UV según las especificaciones del fabricante.

2. determinar la bioactividad in vitro de si-NPs

1. Derribe del gen modelo luciferasa
   1. Generar luciferasa si-NPS (según el procedimiento anterior) usando luciferasa siRNA y codificado si-NPS usando una secuencia de siRNA codificada como un control. Formualte ambos si-NPS en el mismo final N⁺:P^- ratio y en la proporción óptima identificada por los estudios de retardo de gel de agarosa. Ejemplo de secuencias siRNA se incluyen en la tabla de materiales.
   2. Semilla luciferasa-expresando células [MDA-MB-231/luciferasa (BSD) células estables] en placas de paredes negras de 96-Well a una densidad de 2.000 células por pozo. Permitir que se adhiera durante la noche en medios completos (DMEM, 10% FBS) en una incubadora (37 ° c, 5% CO₂, 95% humedad).
   3. Diluir el si-NPs en un medio sérico completo para un volumen final de 100 μL por pozo y una concentración de siRNA de 100 nM. Trate las células durante 24 h con si-NPs.
   4. Después de 24 h, retire los tratamientos y reemplace los medios con un medio sérico completo que contenga 150 μg/mL de D-Luciferin. Incubar las células durante 5 minutos antes de medir la luminiscencia en un lector de placas o en un sistema de imagen óptica in vivo según las especificaciones del fabricante.
   5. Reemplace los medios que contengan Luciferin con medios séricos frescos y completos e incube 24 h más. Repita el paso anterior, eliminando los medios y sustituyéndolos por un medio sérico completo que contenga 150 μg/mL D-Luciferin, seguido de una incubación de 5 min antes de medir la luminiscencia en el punto de tiempo 48 h.
   6. Para estudios longitudinales, mantener las células en condiciones estériles mientras se mide la luminiscencia. Continúe con la cultura en medios frescos y completos entre las mediciones después de reemplazar el contenido de Luciferin.
      Nota: la concentración apropiada de siRNA variará con diferentes moléculas de si-NPs y siRNA. Cuando se utilizan poliplexos con carga neutra con un núcleo endosomolítico (p. ej., PEG-DB), 100 nM es típicamente bien tolerado por las células y produce > 75% luciferasa Knock-down. La relación de masa de PEG-DB a siRNA a 10 N⁺:P^- ratio y 100 nm tratamientos siRNA (suponiendo 26 BP sirna) es 23,3, es decir, añadir 23,3 ng de PEG-dB por cada 1,0 ng de siRNA. Por ejemplo, añadir 1,16 μL de polímero 3,33 mg/mL para 166,5 ng de siRNA para tratar un pozo a 100 nM en una placa de 96-Well (100 mL de volumen de medios por pozo).

Resultados

Algunas características esenciales de los si-NPs efectivos para la entrega en vivo de siRNA son el tamaño adecuado (~ 20 – 200 nm de diámetro), el envasado de siRNA y la bioactividad del silenciamiento del gen. Si bien esta no es una lista exhaustiva (como se aborda en el debate), estas características básicas deben confirmarse antes de considerar la posibilidad de seguir probando una formulación.

La figura ...

Discusión

Los si-NPs descritos aquí están formados por la Asociación electrostática de siRNA aniónica y polímeros catiónicos en complejos poliónicos (poliplexos). El complejado electrostático de siRNA y el bloque catiónico DB de los polímeros PEG-DB se facilitan mezclando a bajo pH (4,0). A pH 4,0, DMAEMA está altamente protonated, y consecuentemente el bloque DB está altamente cargado. Esto asegura que los polímeros se disuelvan como unimers en solución en lugar de formar micelas y que los complejos DB eficientemente con siRNA. P...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,45 μ m filtros de jeringa de tamaño de poro	Thermo Fisher Scientific	F25133	17 mm de diámetro, membrana de PTFE
0-14 tiras reactivas de pH	Millipore Sigma	P4786
10x tampón TAE	Thermo Fisher Scientific/Invitrogen	AM9869
6-7.7 tiras reactivas de pH	Millipore Sigma	P3536
placas de pared negra de 96 pocillos	Corning	3603	Polvo de agarosa tratado con cultivo de tejidos
	Thermo Fisher Scientific/Invitrogen	16500
Ácido cítrico monohidratado	Millipore Sigma	C1909
fosfato sódico dibásico dihidratado	Millipore Sigma	71643
D-luciferina	Thermo Fisher Scientific	88294	Sal monopotásica
DMEM	Gibco	11995065	Alto contenido de glucosa y piruvato
Etanol	Millipore Sigma	459836
bromuro de etidio	Thermo Fisher Scientific/Invitrogen	15585011
FBS	Gibco	26140079
colorante de carga	Thermo Fisher Scientific/Invitrogen	R0611
Luciferasa siRNA	IDT	N/A	Secuencia de hebra antisentido: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC AAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACU GAUAAUGAACUCCT*C* * Bases de ADN
MDA-MB-231 / Luciferasa (Bsd) células estables	GenTarget Inc	SC059-Bsd	Células que expresan luciferasa demandadas para evaluar la bioactividad de si-NP
monobásico fosfato de sodio monohidratado	Millipore Sigma	S9638
siRNA IDT		/ A	hebra antisentido secuencia: AUACGCGUAUU AUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUAC GCGUA*t* *Bases de ADN
cubetas cuadradas de poliestireno	Fisher Scientific	14-955-129	4.5 mL de capacidad
Rejillas TEM Ted	Pella, Inc.	1GC50	PELCO Rejillas marcadas en el centro, malla 50, diámetro exterior de 3,0 mm,
citrato trisódico de cobre dihidratado	Millipore Sigma	S1804
acetato de uranilo	Polysciences, Inc.	21447-25