La preparación de nanopartículas poliméricas con capacidad de pH, cargadas de neutralmente, para la entrega de siRNA citosólica

John Hendershot; Adam  E. Smith; Thomas A. Werfel

doi:10.3791/59549

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Artículo de método

La preparación de nanopartículas poliméricas con capacidad de pH, cargadas de neutralmente, para la entrega de siRNA citosólica

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DOI:

10.3791/59549

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2 de mayo de 2019

John Hendershot¹ , Adam E. Smith¹ , Thomas A. Werfel¹^,²^,³

¹Department of Chemical Engineering, University of Mississippi, ²Department of BioMolecular Sciences, University of Mississippi, ³Biomedical Engineering Program, University of Mississippi

En este artículo

Resumen

Se presentan los métodos para preparar y caracterizar las propiedades fisicoquímicas y la bioactividad de las nanopartículas de siRNA con respuesta al pH, que son neutralmente cargadas. Se discuten los criterios para los nanomedicamentos siRNA exitosos, como el tamaño, la morfología, la carga superficial, la carga de siRNA y el silenciamiento del gen.

Resumen

El éxito de siRNA como medicina molecular dirigida depende de su eficiente entrega citosólica a las células dentro del tejido de la patología. Se ha logrado el éxito clínico para el tratamiento de los objetivos de enfermedad hepática previamente ' no druggable ' con siRNA. Sin embargo, la entrega eficiente de siRNA tumoral requiere consideraciones adicionales de diseño farmacocinético, incluyendo tiempo de circulación prolongado, evasión de órganos de aclaramiento (p. ej., hígado y riñones), y penetración y retención de tumores. Aquí describimos la preparación y la caracterización fisicoquímica/biológica in vitro de nanopartículas poliméricas diseñadas para el parto eficiente de siRNA, particularmente a los tejidos no hepáticos como los tumores. Las nanopartículas de siRNA se preparan mediante la compleción electrostática de siRNA y el copolímero de dibloque poli (etilenglicol-b-[2-(dimetilamino) etil metacrilato-Co-butilo metacrilato]) (PEG-dB) para formar complejos poliónicos ( poliplexos) donde siRNA es secuestrado dentro del núcleo de POLIPLEX y PEG forma una corona hidrófila, con carga neutra. Por otra parte, el bloque DB se convierte en membrana-lítica como vesículas de la vía endolisosomal acidificación (< pH 6,8), desencadenando la fuga endosómica y la entrega citosólica de siRNA. Se describen los métodos para caracterizar las características fisicoquímicas de las nanopartículas de siRNA, como el tamaño, la carga superficial, la morfología de las partículas y la carga de siRNA. La bioactividad de las nanopartículas de siRNA se mide utilizando luciferasa como un gen modelo en un ensayo de silenciamiento del gen rápido y de alto rendimiento. Los diseños que superan estas pruebas iniciales (como los poliplexos basados en PEG-DB) se consideran apropiados para la traducción a estudios en animales preclínicos que evalúan la entrega de siRNA a tumores u otros sitios de patología.

Introducción

Debido a que los siRNAs inhiben la traducción de las proteínas de las secuencias de mRNA, teóricamente pueden ser utilizados para drogas todas las patologías conocidas¹^,²^,³^,⁴^,⁵. Sin embargo, el uso de siRNA en medicina está limitado por el perfil farmacocinético de las moléculas de siRNA⁶^,⁷. Cuando se inyecta por vía intravenosa, los siRNAs se borran rápidamente a través de los riñones y/o se degradan mediante nucleasas⁸^....