Hemos convertido con éxito el ensayo estándar de protocolo de amplificación de repetición de telómeros (TRAP) que se empleara en las reacciones de la cadena de polimerasa digital de gotas. Este nuevo ensayo, llamado ddTRAP, es más sensible y cuantitativo, lo que permite una mejor detección y análisis estadístico de la actividad de la telomerasa dentro de varias células humanas.
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Artículo de método
TRAMPA digital de gota (ddTRAP): adaptación del Protocolo de amplificación de repetición de telómeros a la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas
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Resumen
Resumen
El protocolo de amplificación de repetición de telómeros (TRAP) es el ensayo más ampliamente utilizado para detectar la actividad de la telomerasa dentro de una muestra determinada. El método basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite mediciones robustas de la actividad enzimática de la mayoría de los lisatos celulares. El TRAP basado en gel con imprimadores con etiquetas fluorescentemente limita el rendimiento de la muestra, y la capacidad de detectar diferencias en las muestras está restringida a dos pliegues o mayores cambios en la actividad enzimática. El TRAP digital de gota, ddTRAP, es un enfoque altamente sensible que ha sido modificado a partir del ensayo TRAP tradicional, permitiendo al usuario realizar un análisis robusto en 96 muestras por corrida y obtener la cuantificación absoluta de los productos de DNA (extensión de telomerasa ) dentro de cada PCR. Por lo tanto, el ensayo ddTRAP recientemente desarrollado supera las limitaciones del ensayo TRAP tradicional basado en gel y proporciona un enfoque más eficiente, preciso y cuantitativo para medir la actividad de la telomerasa en entornos clínicos y de laboratorio.
Introducción
Los telómeros son complejos de ADN-proteína dinámicos en los extremos de los cromosomas lineales. Los telómeros humanos se componen de una serie de repeticiones hexamericas de 5 '-TTAGGGn que varían en longitud entre 12 – 15 kilobases (KB) al nacer1. La telomerasa humana, la enzima ribonucleoproteína que mantiene los telómeros, se identificó por primera vez en los lisados de las células de la Hela (línea de células cancerosas)2. Juntos, los telómeros y la telomerasa desempeñan un papel importante en un espectro de procesos biológicos como la protección del genoma, la regulación génica y la inmortalidad de las ....
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Protocolo
1. preparación y almacenamiento del búfer
- Preparar 50 ml de 1x stock-/DNase-Free NP-40 lisis buffer (Tris-HCl 10 mm [pH 8,0], 1 mm MgCl2, 1 mm ácido ethylenediaminetetraacético (EDTA), 1% [VOL/VOL] NP-40, 10% [VOL/VOL] glicerol, 150 mm NaCl, 5 mm β-mercaptoetanol, y 0,1 mm 4- clorhidrato de fluoruro de Bencenosulfonilo (AEBSF)). Este búfer puede ser alicitado y almacenado a-20 ° c para su uso futuro. Evitar el congelamiento/descongelación de ciclos para obtener una lisis óptima de las células.
- Prepare 50 mL de un buffer de extensión de trampa libre de Rnasa-/DNase-10 (200 mM Tris-HCl [pH 8,0], 15 mM MgCl2, 630 mm KCl, 0,5% [VO....
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Resultados
Usando el ddTRAP, la actividad de telomerasa se midió en un panel celular que consta de las siguientes líneas celulares (figura 1): cáncer de pulmón de células no pequeñas (H2882, H1299, Calu6, H920, A549 y H2887), cáncer de pulmón de células pequeñas (H82 y SHP77) y telomerasa negativa fibroblastos (BJ). 1 millón pellets de células fueron lisados en tampón NP-40, y las reacciones de extensión de telomerasa se realizaron en triplicados biológicos. Un control .......
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Discusión
La medición de la actividad de la telomerasa es fundamental para una plétora de temas de investigación, incluyendo, pero no limitado a, cáncer, biología de los telómeros, envejecimiento, medicina regenerativa y diseño de fármacos basados en la estructura. Las RNP de telomerasa son muy abundantes, incluso en las células cancerosas, lo que hace que la detección y el estudio de esta enzima sean desafiantes. En este documento, describimos los procedimientos paso a paso para el nuevo ensayo ddTRAP desarrollado para cuantifica.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores le gustaría reconocer las fuentes de financiación de los institutos nacionales de salud (NIH) (NCI-R00-CA197672-01A1). Las líneas de cáncer de pulmón de células pequeñas (SHP77 y H82) fueron un regalo generoso de los doctores John Minna y Adi Gazdar del centro médico del sudoeste de UT.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Ambion | AM9855G | libre de ARNasa/ADNasa |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G | libre de RnAsa/ADNasa |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Ambion | AM9261 | Libre de ARNasa/ADNasa |
| Surfact- Amps NP-40 | Thermo Scientific | 28324 | |
| 100% Glicerol ultrapuro | Invitrogen | 15514011 | Libre de ARNasa/ADNasa |
| fluoruro de fenilmetilsulfonilo | Thermo Scientific | 36978 | Polvo |
| 2-Mercaptoetanol | SIGMA-ALDRICH | 516732 | |
| Libre de nucleasas H20 | Ambion | AM9932 | Libre de ARNasa/ADNasa |
| 2,5 mM Mezcla de dNTP | Thermo Scientific | R72501 | 2,5 mM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP |
| 2 M KCl | Ambion | AM9640G | libre de ARNasa/ADNasa |
| 100% Tween-20 | Fisher | 9005-64-5 | |
| 0.5 M EGTA pH 8.0 | Fisher | 50-255-956 Libre de | ARNasa/ADNasa |
| Sustrato de telomerasa (TS) Imprimación | ADN integrada (IDT) | Imprimación personalizada (purificada por HPLC) | 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'ACX |
| (Revers) Imprimación | con tecnología de ADN integrada (IDT) | Imprimación personalizada (purificada por HPLC) | 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3'Tubos |
| grado PCR DE PARED DELGADA (250 ul) | USA Scientific | 1402-2900 | tiras, placas, tubos, etc. |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio Rad | 1864034 | |
| Twin-Tec Placa de 96 pocillos | Fisher | Eppendorf 951020362 | |
| Sellado térmico de lámina Piercable | Bio Rad 1814040 | ||
| Bio Rad (DG8) | Bio Rad | 1863008 | |
| Aceite generador de gotas | Bio Rad | 1863005 | |
| Junta del generador de gotas | Bio Rad | 1863009 | |
| Termociclador de 96 pocillos T100 | Bio Rad | 1861096 | |
| PX1 Selladora de placas PCR | Bio Rad | 1814000 | |
| QX200 Lector de gotas y software Quantasoft | Bio Rad | 1864001 y 1864003 | |
| ddPCR Aceite lector de gotas | Bio Rad | 1863004 | |
| Nucleasa Puntas de pipeta filtradas sin nucleasa | Thermo Científico | 10 ul, 20 ul, 200 ul y 1000 ul |
Referencias
- Frenck, R. W. Jr, Blackburn, E. H., Shannon, K. M. The rate of telomere sequence loss in human leukocytes varies with age. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5607-5610 (1998).
- Morin, G. B.
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Reimpresiones y permisos
