Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de inmunofluorescencia indirecta de flotación libre en secciones de biopsia de piel que permite la identificación de variantes de conformación específicas de la enfermedad de la sinucleína alfa implicadas en la enfermedad de Parkinson y múltiples proteínas de la sistema nervioso periférico.
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Artículo de método
Dirigido a agregados de alfa sinucleína en fibras nerviosas periféricas cutáneas por el ensayo de inmunofluorescencia de flotación libre
En este artículo
Resumen
Resumen
Hasta la fecha, para la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas sólo se dispone de un diagnóstico definitivo histopatológico post mortem. Para la enfermedad de Parkinson (PD), el diagnóstico todavía se basa sólo en los signos clínicos de afectación motora que aparecen más adelante en el curso de la enfermedad, cuando la mayoría de las neuronas dopaminérgicas ya se han perdido. Por lo tanto, existe una fuerte necesidad de un biomarcador que pueda identificar a los pacientes al comienzo de la enfermedad o a riesgo de desarrollarla. En los últimos años, la biopsia de piel ha demostrado ser una excelente herramienta de investigación y diagnóstico para enfermedades de los nervios periféricos como la neuropatía de fibra pequeña. Curiosamente, una pequeña neuropatía de fibra y depósitos neuronales alfa de sinucleína (Syn) se han demostrado mediante biopsia de piel en pacientes con DP. De hecho, la biopsia de piel tiene la gran ventaja de ser un procedimiento fácilmente accesible, mínimamente invasivo e indoloro que permite el análisis de tejido nervioso periférico propenso a la patología. Además, la posibilidad de repetir la biopsia de piel en el curso del seguimiento del mismo paciente permite estudiar la correlación longitudinal con la progresión de la enfermedad. Creamos un protocolo estandarizado y confiable para investigar la presencia de agregados de Syn en las fibras nerviosas de la piel del paciente con DP. Este protocolo implica algunos pasos cortos de fijación, un corte criotomo y luego una doble tinción de inmunofluorescencia flotante con dos anticuerpos específicos: anti Protein Gene Product 9.5 (PGP9.5) para marcar las fibras nerviosas cutáneas y anti 5G4 para detectar Agregados de Syn. Es un protocolo versátil, sensible y fácil de realizar que también se puede aplicar para apuntar a otras proteínas de interés en los nervios de la piel. La capacidad de marcar los agregados de La sinción es otro paso adelante en el uso de la biopsia de piel como herramienta para establecer un diagnóstico histopatológico premortem de DP.
Introducción
La biopsia de piel ha adquirido una gran importancia como herramienta de diagnóstico e investigación en el campo de los trastornos neurológicos1. De hecho, la epidermis y la dermis contienen abundantes fibras nerviosas sensoriales somáticas (mielinizadas y no mielinizadas), terminaciones nerviosas libres nociceptivas, receptores sensoriales e inervación autonómica de glándulas sudoríparas, vasos, glándulas sebáceas y arrector muscular pilorum 2.
A mediados del siglo XX, la configuración de la inmunohistoquímica del anticuerpo PGP9.5 permitió la evidencia de una extensa ertración de ....
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Protocolo
El protocolo ha sido aprobado por el Comité Cantonal de ética y todos los sujetos inscritos dieron su consentimiento informado por escrito al estudio.
1. Colección de biopsia de piel
- Permita que un médico calificado realice la biopsia de piel en un entorno clínico adecuado.
- Elija el área para realizar la biopsia de piel y límpiela con un hisopo de alcohol.
- Preparar la solución anestésica con 1 cc de lidocaína 2%.
- Con la aguja paralela a la zona, inyecte anestesia local por vía subcutánea.
- Después de comprobar el efecto de la anestesia, tomar el punzón desechable de 3 mm y aplicar presión des....
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Resultados
Siguiendo el procedimiento descrito (Figura1), detectamos los agregados de Syn, etiquetados con anticuerpo 5G4, en fascículos nerviosos dérmicos que inercen estructuras autonómicas de pacientes con DP. La morfología de los depósitos de alfa-sinucleína aparece como una señal punteada a lo largo de los axónicos de los nervios dérmicos (Figura2). De hecho, aprovechando este protocolo en 19 pacientes con DP y 17 controles en biopsias de piel en tres sitios anatómico.......
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Discusión
Describimos un ensayo de inmunofluorescencia flotante para biopsias de piel para el diagnóstico de DP: explota la inmunomancha doble con anticuerpo anti-PGP9.5, un marcador panaxonal y anti-5G4, un anticuerpo específico de conformación que reconoce la forma agregada de Syn.
Las grandes ventajas de la biopsia de piel con fines diagnósticos en DP y posiblemente en otros trastornos de la conformación de proteínas son: 1) el acceso directo al tejido nervioso propenso a la enfermedad mediante una t.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Parkinson Schweiz y ABREOC (el Consejo Asesor de Investigación Científica del Ente Ospedaliero Cantonale) por su apoyo financiero a este estudio.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 5G4 (anti humano y alfa; Syneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | Ratón monoclonal |
| AlexaFluor 488 Cabra anti Conejo IgG | Invitrogen | 1971418 | 2 mg/mL |
| AlexaFluor 594 Cabra anti Ratón IgG | Invitrogen | 1922849 | 2 mg/mL |
| Solución de fosfato de hidrógeno disódico | Merk Millipore | 106586 | |
| Etilenglicol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| L-lisina monoclorhidrato | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Paraformaldehído | Aldrich Química | ||
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | |
| Cloruro de sodio | Sigma | S3014 | |
| Dihidrógeno Fosfato de Sodio Monohidrato | Merck Millipore | 106346 | |
| (meta)periodato de sodio | Sigma-Aldrich | S1878 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Tryton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Medio de montaje |
Referencias
- McArthur, J. C., Griffin, J. W. Another Tool for the neurologist's Tollbox. Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).
- Wilkinson, P. F., Millington, R. Skin. , Cambridge University Press. Cambridge. ISBN 978-0-521-10681-8 49-50 (2009).
- Weddell, G., et al.
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Reimpresiones y permisos
