Un sistema preciso de entrega y recuperación de patógenos para modelos murinos de neumonía bacteriana secundaria

Resumen

Aquí, presentamos métodos para mejorar los estudios secundarios de neumonía bacteriana proporcionando una vía no invasiva de instilización en el tracto respiratorio inferior seguida de recuperación de patógenos y análisis de transcripción. Estos procedimientos son reproducibles y se pueden realizar sin equipos especializados como cánulas, cables guía o cables de fibra óptica.

Resumen

Las neumonías bacterianas secundarias después de las infecciones por gripe se sitúan constantemente entre las diez principales causas de muerte en los Estados Unidos. Hasta la fecha, los modelos murinos de coinfección han sido la principal herramienta desarrollada para explorar las patologías de las infecciones primarias y secundarias. A pesar de la prevalencia de este modelo, se presentan considerables discrepancias con respecto a los procedimientos de instilación, los volúmenes de dosis y las eficacias en los estudios. Además, estos esfuerzos han sido en gran medida incompletos para abordar cómo el patógeno puede estar influyendo directamente en la progresión de la enfermedad después de la infección. Aquí proporcionamos un método preciso de administración, recuperación y análisis de patógenos para ser utilizado en modelos murinos de neumonía bacteriana secundaria. Demostramos que la insinsatación intratraal permite una entrega eficiente y precisa de volúmenes controlados directa y uniformemente en las vías respiratorias inferiores. Los pulmones se pueden extirpar para recuperar y cuantificar la carga de patógenos. Después de la escisión de los pulmones infectados, describimos un método para extraer ARN patógeno de alta calidad para el análisis transcripcional posterior. Este procedimiento se beneficia de ser un método no quirúrgico de parto sin el uso de equipos de laboratorio especializados y proporciona una estrategia reproducible para investigar las contribuciones de patógenos a la neumonía bacteriana secundaria.

Introducción

La neumonía bacteriana secundaria tras la infección por gripe es una de las principales causas de muerte en los Estados Unidos y un área activa de investigación^1,2. A pesar de numerosos estudios utilizando modelos murinos de neumonía bacteriana secundaria, las incoherencias con respecto a la inscriplación e interrogación de patógenos siguen siendo^3,4,5. Además, si bien muchos esfuerzos anteriores se han centrado en los efectos inmunomoduladores de la gripe que conducen a un aumento susceptible mente a una infección bacteriana secundaria, datos más recientes sugieren que la regulación de la virulencia del patógeno bacteriano es igual contribuyente al establecimiento de la enfermedad^6,7,8,9. Estos nuevos datos requieren un método más preciso para explorar la neumonía bacteriana secundaria en modelos murinos de coinfección que facilitan la investigación de la respuesta del patógeno.

Los organismos huésped, exclusivos de los modelos de coinfección de la gripe, se inmunovenla intencionalmente por una infección por gripe primaria antes de la administración del agente bacteriano secundario. Con el fin de replicar mejor la patogénesis de la enfermedad observada en los huéspedes humanos, es imperativo que la carga de patógenos de los agentes primarios y secundarios se controle para observar los efectos individuales y combinatoriales de cada agente infeccioso. Más comúnmente, las infecciones respiratorias en ratones se han establecido a través de una administración intranasal^3,4,5,6,10. En la medida en que esta ruta se observa por ser técnicamente simple y puede ser apropiada en algunas aplicaciones de infección de un solo agente, no es adecuada para los modelos de coinfección, ya que los procedimientos de instilación, los volúmenes de dosis y la eficacia son muy variables dentro de literatura publicada^3,4,5,6.

Para obtener una comprensión más completa de la patogénesis de la neumonía bacteriana secundaria, se deben considerar las contribuciones tanto del huésped como del patógeno. Para ello, hemos desarrollado un enfoque sencillo y reproducible para la recuperación de bacterias viables y ARN patógeno de los pulmones infectados. Este método utiliza un procedimiento de instilación intratraal simplificada y no invasiva seguido de un posterior aislamiento del ARN bacteriano. El procedimiento de insculación intratraal descrito en el presente documento es similar a los métodos descritos anteriormente y no se limita a la administración de patógenos^11,12,13. El uso de este procedimiento en particular se beneficia de ser de bajo costo y no requiere el uso de equipos especializados tales como cánulas, cables guía o cable de fibra óptica; además, debido a que este procedimiento no es invasivo, asegura un estrés mínimo en sujetos murinos, minimiza una respuesta inflamatoria de la mecánica de la inoculación y proporciona una vía de entrega eficiente para la infección de múltiples sujetos. Brevemente, los ratones anestetizados con isoflurano se suspenden de los incisivos. Los fórceps se utilizan para agarrar suavemente la lengua seguido de la inserción de una aguja precargada doblada, con punta contundente y calibre 21 en la tráquea y la entrega de carga de patógenos. La validación de este procedimiento se demuestra mediante la confirmación visual del tinte distribuido equitativamente en el compartimento pulmonar y la recuperación de la carga bacteriana. A continuación, demostramos cómo recuperar viable Staphylococcus aureus (S. aureus) de los pulmones infectados y describir un método reproducible para aislar el ARN patógeno de alta calidad.

Protocolo

Todos los métodos se ajustan a las directrices de los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de Montana.

1. Insinsatación intratraal

1. Prepare un espacio de trabajo que contenga los siguientes suministros: una plataforma de intubación, una jeringa estéril de 1 ml, fórceps estériles con puntas romas, aguja estéril de punta contundente de calibre 21 y dos tubos cónicos para almacenar la jeringa y fórceps.
   NOTA: Las plataformas de intubación se pueden comprar comercialmente o construir internamente. La plataforma de intubación utilizada aquí fue construida usando plexiglás de 0,25 pulgadas. En resumen, se aplicó calor al plexiglás y la placa se dobla a un ángulo interior aproximado de 65o. En el lado exterior de la plataforma de intubación, dos tornillos de la máquina fueron sembrados 3 pulgadas de distancia y una banda de goma fue suspendida entre los dos tornillos.
2. Preparar el inóculo patógeno diluyendo en serie la muestra para obtener la concentración final deseada en un volumen total de 50 l. Almacenar el inóculo sobre hielo.
3. Usando guantes estériles, doble una aguja de 21 G con punta sin rodeos a aproximadamente 35o.
   NOTA: Se necesita una aguja separada para cada ratón.
4. Fije la aguja doblada de 21 G con punta contundente a una jeringa de 1 ml. Extraiga un cojín de aire de 100 ml en la jeringa seguido de 50 ml del agente infeccioso. Coloque la aguja cargada y la jeringa en un lugar de fácil acceso por la mano dominante.
5. Anestetiza profundamente un ratón usando una mezcla de isoflurano/oxígeno del 4% o un método de anestesia aprobado por la IACUC similar. La profundidad adecuada de la anestesia se obtiene típicamente cuando las tasas de respiración disminuyen a aproximadamente 1 inhalación por 5-8 s y se puede confirmar pellizcando un apéndice y observando ninguna reacción del ratón.
   NOTA: Este método de anestesia proporcionó una duración de anestetización suficiente de aproximadamente 1,5 min. Esto fue suficiente para que los miembros de nuestro laboratorio aprendieran y realizaran este procedimiento de instilación; sin embargo, otros métodos de anestesia aprobados institucionalmente pueden emplearse^11,12,13.
6. Retire el ratón anestesiado de la cámara de anestesia y suspenda el ratón en la plataforma de intubación de los incisivos maxilares.
7. Para abrir un pasaje claro hacia la tráquea, usa los fórceps con puntas romas para agarrar y extender suavemente la lengua fuera de la boca. Transfiera la lengua de los fórceps al pulgar y al dedo índice de la mano no dominante.
8. Permanezca sosteniendo la lengua en la mano no dominante y recoja la jeringa precargada. Apunte el extremo doblado de la aguja lejos del cuerpo e inserte la aguja en la cavidad oral a la base de la lengua.
9. Con la aguja en la base de la lengua, angulo suavemente la muñeca para causar un ligero empujón de la aguja lejos del cuerpo. Este paso asegura que la aguja se insertará en la tráquea y no en el esófago.
10. Guiar lentamente la aguja hacia abajo en la tráquea; a menudo se siente una garrapata leve a medida que la aguja pasa a través del pliegue vocal. Pase la aguja a través de la tráquea hasta que se sienta una ligera resistencia a medida que la aguja se encuentra con la carina.
11. Levante ligeramente la aguja en la dirección proximal para suspender la aguja por encima de la carina. Esto permite el parto en los dos bronquios primarios. Presione completamente el émbolo de la jeringa para entregar la carga infecciosa. Retire la aguja de la tráquea levantando hacia arriba y deseche.
12. Retire el ratón de la plataforma de intubación presionando la banda de goma, pero mantenga el ratón en posición vertical. Obstruir las vías respiratorias nasales colocando un dedo directamente sobre las nares. Mantenga esta posición durante aproximadamente 1 min o hasta que se observen varias respiraciones profundas.
    NOTA: Este último paso garantiza que el volumen total del inóculo se entregue en el tracto respiratorio inferior.
13. Devuelva el ratón a su jaula y observe una recuperación completa de la anestesia.

2. Escisión de los pulmones infectados

1. Trabajando dentro de una campana de flujo laminar para mantener la esterilidad, prepare un espacio de trabajo con los siguientes elementos: una báscula y un bote de pesaje estéril, una plataforma de disección, un kit de disección que contenga tijeras y fórceps, PBS estéril libre de ARS y gasa estéril.
2. Euthanizar un ratón infectado con CO₂ o similar IACUC aprobado método de eutanasia.
3. Coloque un ratón infectado en una plataforma de disección y fije el ratón con alfileres al final de cada apéndice. Rocíe el ratón con etanol para ayudar a mantener la esterilidad de las superficies de trabajo.
4. Comenzando en el umbilicus, usa un par de fórceps para levantar la piel y hacer una incisión hasta la base de la tráquea. Sujetar la piel a ambos lados de la incisión inicial, alejar la piel del cuerpo y cortar las conexiones tisulares.
   NOTA: Puede ser útil hacer varios cortes laterales a través de la piel para revelar más de la región torácica.
5. Comenzando en la base del proceso de xifoide, haga una pequeña incisión con la intención de puncturar el diafragma. Esto resulta en un aumento en la presión en la cavidad torácica que hace que los pulmones se retraigan. Con los pulmones retraídos continuar la incisión para liberar el diafragma.
6. Retire las costillas haciendo una incisión a lo largo de ambos lados de la caja torácica. Esto expondrá completamente la cavidad torácica y los pulmones.
7. Para extirpar los pulmones, agarre la base del corazón con los fórceps y levántese hacia arriba. Coloque las tijeras detrás de los pulmones y comience a hacer pequeñas incisiones a través de las conexiones de tejido mientras continúa hasta levantar el corazón hacia arriba.
8. Una vez que los pulmones hayan sido extirpados, colóquelos sobre la gasa estéril y retire el corazón. El corazón se puede extraer fácilmente al levantarlo de los pulmones con los fórceps y cortar las conexiones de tejido restantes.
9. Transfiera los pulmones a un bote de pesaje pre-tared y registre el peso.
10. Después de que los pulmones hayan sido pesados, transfiéralos a la solución salina tamponada de fosfato estéril (PBS) y guárdelos temporalmente en hielo hasta avanzar a los pasos de recuperación y análisis de patógenos.

3. Recuperación y Análisis de Patógenos

1. Continuando trabajando dentro de una campana de flujo laminar, prepare un espacio de trabajo con los siguientes suministros: una trituradora de tejido, PBS estéril libre de ARSa, Buffer RLT complementado con mercaptoetanol (1:100) y tubos de microcentrífuga sin ARDes de 1,5 ml.
   ADVERTENCIA: El mercaptoetanol puede ser peligroso en caso de contacto con la piel, ingestión, contacto con los ojos o inhalación. La dilución de é-mercaptoetanol en el tampón RLT debe hacerse en una campana de humo.
2. Comience agregando primero 1 ml de PBS estéril libre de ARS a la trituradora de tejido. Una vez lleno, guarde la trituradora de tejido en hielo.
3. Preparar una serie de tubos de dilución en serie estériles libres de ARSa que se utilizarán para cuantificar la carga bacteriana recuperada de los pulmones infectados. Esto se logra más fácilmente alísando 900 l de agua estéril en cada tubo de microcentrífuga seguido de dilución en serie del inóculo patógeno.
   NOTA: El número de tubos de dilución necesarios para la enumeración precisa de patógenos variará en función de la entrada inicial de patógenos y la duración de la infección. Esto debe ser empíricamente determinado.
4. Usando fórceps estériles, transfiera los pulmones a la trituradora de tejido preparada y homogeneice completamente el tejido presionando hacia abajo sobre el pedestal mientras gira.
5. Abra la trituradora de tejido y la alícuota de 100 ml de la muestra homogeneizada en el primero de los tubos de dilución en serie preparados. Diluir en serie las muestras y enumerar las UFC mediante el enchapado en el agar nutritivo. Las UFC se pueden registrar como UFC/ml o UFC/mL/mg de tejido pulmonar.
   NOTA: En este paso se pueden extraer 200 oC adicionales de la muestra homogeneizada para la purificación del ARN viral (ver Tabla de Materiales)o almacenarse a -80 oC para su análisis futuro.
6. Después de que las alícuotas hayan sido retiradas para la determinación de la UFC y/o el aislamiento viral del ARN, sustituya el pedestal de molienda y peletice el tejido homogeneizado por centrifugación a 4.000 rpm (3724 x g)durante 10 min a 4 oC.
7. Con una pipeta, retire el sobrenadante de la muestra peletada y colóquelo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   NOTA: El sobrenadante está libre de bacterias y se puede almacenar a -80 oC para el análisis de los factores de patógenos secretos y huésped soluble.
8. Resuspenda el pellet de tejido homogeneizado pipeteando o vórtice en 700 ml de tampón RLT-o-mercaptoetanol y transfiera la muestra a un tubo estéril de microcentrífuga libre de ARVsa de 1,5 ml.
   NOTA: En este punto, las muestras se pueden almacenar a -80 oC durante varios meses.
9. Purificar el ARN utilizando ligeras modificaciones al protocolo del fabricante de un kit de purificación (ver Tabla de Materiales); véase Voyich et al. 2008¹⁴.
   1. Transfiera la suspensión pulmonar homogeneizada a un tubo de microcentrífuga de 2 ml que contenga perlas de sílice de 0,1 mm y se procese a través de un batidor de perlas durante 20 s a 6 m/s.
   2. Centrifugar la muestra a 1.500 rpm durante 3 minutos. Después de la centrifugación, pipetee el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   3. Añadir 350 s l de etanol de 96%-100% a la muestra y mezclar a fondo mediante pipeteo o inversión.
   4. Transfiera 700 l de la muestra a una columna de purificación colocada en un tubo de recogida de 2 ml. Centrifugar la muestra a 8.000 x g durante 15 s y desechar el flujo. Ejecute cualquier muestra de exceso a través de la misma columna como se describió anteriormente.
   5. Lavar la columna con 700 ml de tampón RW1 y una muestra de centrífuga a 8.000 x g durante 15 s. Deseche el flujo y transfiera la columna de membrana de sílice a un nuevo tubo de recogida de 2 ml.
   6. Aplique 500 l de RPE de búfer a la columna. Lavar la columna por centrifugación a 8.000 x g durante 15 s. Deseche el flujo.
   7. Aplique 500 l adicionales de RPE tampón a la columna RNeasy y centrífuga a 8.000 x g durante 2 min. Deseche el flujo a través y centrifuque la columna a 10.000 x g durante 1 min.
   8. Para eluir el ARN purificado, comience transfiriendo la columna a un nuevo tubo de microcentrífuga libre de ARNide de 1,5 ml. Pipetear 50 l de agua libre de RNase directamente sobre la membrana de sílice-gel de la columna y centrifugar a 8000 x g durante 1 min.
      NOTA: El ARN eludado se puede ejecutar sobre la misma columna de nuevo para aumentar el rendimiento del ARN.
   9. Añadir 50 l de agua libre de RNase al ARN purificado para llevar el volumen total a 100 ol. Aliquot 350 l de RLT-o-mercaptoetanol seguido de 250 ml de etanol del 96%-100% a la muestra y mezclar a fondo mediante pipeteo o inversión.
   10. Aplicar la muestra a una columna de purificación colocada en un tubo de recogida y centrifugar a 8000 x g durante 15 s. Deseche el flujo y reemplace el tubo de recogida.
   11. Lavar la columna añadiendo 350 ml de tampón RW1 seguido de centrifugación a 8000 x g durante 15 s.
   12. Preparar una solución de DNase que contenga aproximadamente 27 unidades de Kunitz añadiendo 10 ml de stock de DNase (750 unidades de Kunitz/ml) a 70 l de RDD tampón. Añadir 80 ml de solución de DNase directamente sobre la membrana de sílice-gel e incubar la muestra durante 15 minutos a temperatura ambiente.
   13. Lave la columna con 350 ml de tampón RW1 y centrífuga a 8000 x g durante 15 s y deseche el flujo.
   14. Repita los pasos 3.9.6–3.9.8 para purificar el ARN.
       NOTA: Se recomienda repetir el procedimiento de limpieza del ARN siguiendo los pasos 3.9.9–3.9.10 y 3.9.6–3.9.8 (omita los pasos 3.9.11–3.9.13 de DNase). Esta limpieza adicional resulta en ARN de muy alta calidad.
10. El rendimiento del ARN se puede cuantificar utilizando un espectrofotómetro con lecturas a 260 nM para determinar la concentración y 260:280 nM para la pureza. Una vez obtenido el rendimiento del ARN, estandarizar la concentración de cada muestra de ARN a 50 ng/L.
    NOTA: Se recomienda hacer múltiples alícuotas a una concentración de 50 ng /L para evitar ciclos de congelación/descongelación que pueden conducir a la degradación del ARN.
11. Almacene el ARN purificado a -80 oC o utilícelo inmediatamente para el análisis de transcripción.
    NOTA: En publicaciones anteriores, el ARN de 3 a 5 ratones se agrupaba para el análisis de transcripciones. A través de la optimización de la técnica anterior, el ARN de 1 ratón se ha determinado empíricamente como suficiente para el análisis de transcripción (80-120 ng / L).

Resultados

La Figura 1 utiliza una solución azul brillante Coomassie de peso/volumen del 0,1% para demostrar que una insitación intratraal entrega el inóculo directa y uniformemente dentro del tracto respiratorio inferior. La Figura 2 muestra que las bacterias (S. aureus) UFC se recuperaron directamente del tejido pulmonar homogeneizado. La Figura 3 demuestra el uso de este sistema para la entrega y recuperación precisa del inóculo en el tracto respiratorio inferior trazando las UFC de entrada y recuperación de ratones individuales. La Figura 4 muestra la curva de amplificación qRT-PCR del gen de limpieza bacteriana gyrB para demostrar que el ARN bacteriano se puede extraer directamente del tejido pulmonar infectado con una contaminación mínima del ADN. La Figura 5 muestra la construcción de una curva estándar utilizando la amplificación qRT-PCR del segmento M del virus de la gripe A para demostrar que el ARN viral se puede extraer directamente del tejido pulmonar infectado.

Figura 1: La insinsatación intratraal permite una distribución uniforme en el tracto respiratorio inferior. (A, B) Los pulmones no infectados fueron extirpados de un ratón sano después de la insinsinfección intratraal de PBS estéril y fotografiados desde (A) dorsal y (B) perspectivas ventrales. (C, D) 50 l de una solución azul brillante Coomassie al 0,1% se administró a un ratón anestesiado a través de la administración intratraal. (C) Dorsal. (D) Ventral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Recuperación representativa de las UFC bacterianas del homogeneato pulmonar infectado. Los pulmones fueron extirpado un día después del desafío con S. aureus. Después de la homogeneización, 100 l de la suspensión pulmonar se diluyó en serie a través de 10^-6. Para enumerar las UFC recuperadas, se celenaron 10 oL gotas de las diluciones de 10^-5 y 10^-6 en el agar de soja tríptico (TSA) e incubadas a 37 oC con 5% C0₂ durante la noche. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Entrega precisa y recuperación del inóculo patógeno después de la administración intratraal. Los ratones se dividieron en dos grupos que contenían tres ratones por grupo. Los ratones fueron sometidos a instilización intratraal de S. aureus a 1 x 10⁸ (bajo) y 2 x 10⁸ (alto) CFU/ml. Una hora después de la infección, los ratones fueron eutanasiados y los pulmones fueron extirpidos para demostrar la precisión de la insitación y recuperación. El inóculo bacteriano y las bacterias recuperadas del homogeneato pulmonar se faban en TSA (agar de soja tríptico). No se notificaron diferencias significativas entre la entrada bacteriana y la recuperación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Recuperación y pureza representativas del ARN bacteriano. Seis horas después de la inscripción intratraal con 1 x 10⁸ UFC/50 l de S. aureus, se eutanasiaron ratones. Los pulmones fueron extirgados y homogeneizados seguidos de la resuspensión de la suspensión pulmonar en el tampón RLT-o-mercaptoetanol. El ARN se purificó como se describe en el paso 3.9¹⁴. qRT-PCR se utilizó para detectar transcripciones del gen de limpieza bacteriana gyrB. Se incluyó un control que no contenía transcriptasa inversa (nRT) para demostrar la pureza del ARN recuperado. En un umbral de 0,1, las transcripciones de la gyrB se detectaron en un ciclo medio de 21,1, 20,3 y 20,5. No se detectaron controles nRT hasta los promedios del ciclo 35,9, 35,5 y 35,0. n 3 réplicas biológicas, que contienen 3 réplicas técnicas/replicas biológicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Recuperación representativa del ARN viral. Seis días después de la inscripción intratraal con 100 PFU/50 l de gripe A/PR/8/1934(H1N1), los ratones fueron eutanasiados. Los pulmones fueron extirpado y homogeneizados, y se recogieron 200 l de la suspensión homogeneizada y pasaron a través de un colador celular de 70 m antes de la purificación viral del ARN. El ARN purificado se diluyó en serie (10^-1-10^-4) seguido de la amplificación del segmento M de la gripe A. (A) Gráfica de amplificación del ARN de la gripe A recuperado de un pulmón infectado y diluido 10^-1–10^-4. (B) Curva estándar del segmento M de la gripe A. Umbral de 0,2, R² a 0,994, pendiente -3,46. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El uso de este modelo proporciona un método altamente eficiente y reproducible para estudiar las infecciones bacterianas secundarias. La capacidad de controlar estrechamente la entrega del inóculo patógeno permite observaciones más precisas de los efectos individuales y combinatoriales de cada patógeno. Las ineficiencias en la vía de la instilación intranasal más común probablemente han contribuido a las discrepancias en los volúmenes de dosis y las concentraciones presentes en la literatura. Es razonable que la falta de un sistema murino preciso para estudiar la neumonía bacteriana secundaria haya retrasado los hallazgos que identifican respuestas específicas bacterianas que contribuyen a la gravedad de las coinfecciones pulmonares. El desarrollo de un modelo reproducible para estudiar la expresión de virulencia durante las infecciones bacterianas secundarias podría conducir a la identificación de vacunas o dianas farmacológicas para mejorar estas infecciones.

El paso de la instilación intratraal es crítico para establecer con éxito una infección del tracto respiratorio inferior y cualquier análisis aguas abajo de los patógenos. Al aprender esta técnica, puede ser útil practicar usando un tinte (como se describe en los métodos) antes de administrar material infeccioso. El uso de un tinte permite la visualización directa del inóculo en el tracto respiratorio. Un error común que puede ocurrir es la inserción de la aguja contundente en el esófago en lugar de la tráquea. Esto resultará en la entrega del inóculo en el estómago en lugar de los pulmones. Para corregir este error, angulo la aguja más lejos del cuerpo y pasarla hacia abajo en la tráquea. Una vez masterizado, este procedimiento es muy eficiente y se puede utilizar para llevar a cabo experimentos con un gran número de ratones. Trabajando en lotes para anestesiar ratones, la instilización intratraal se puede completar en aproximadamente 30 segundos por ratón. Además, la escisión de los pulmones se puede completar en 2 a 3 minutos por ratón.

La recuperación del ARN bacteriano viable y puro de los tejidos infectados es fundamental para el análisis de transcripciones. Las RNases son omnipresentes y pueden arruinar rápidamente un experimento¹⁵. Algunos métodos incluyen el uso de inhibidores de la RNase; sin embargo, hemos descubierto que congelar la muestra a -80 oC en RLT-o-mercaptoetanol o procesar inmediatamente la muestra para el aislamiento de ARN utilizando todos los tubos y reactivos libres de RNase son eficaces para reducir la contaminación por RNase. Además, recomendamos que se purifique un máximo de seis muestras a la vez. La inclusión de más de seis muestras puede dar lugar a latencias prolongadas entre los pasos del protocolo que pueden culminar en la degradación del ARN. Una vez purificado, también se debe tener cuidado de evitar cualquier ciclos innecesarios de congelación-descongelación. Por lo tanto, si se realizan múltiples análisis en una muestra, se recomienda alísarse con ARN purificado para su almacenamiento a -80 oC.

Además de las técnicas revisadas aquí, este método se puede complementar realizando lavado salveolar bronquial antes de la escisión y homogeneización de los pulmones^16. Esto se puede lograr mediante el lavado de todo el tracto respiratorio inferior o mediante el uso de hilo de sutura para restringir un brazo ramificado del árbol bronquial seguido de lavado a través de la rama restante. A menudo esto conduce a una reducción en la recuperación de la carga de patógenos, pero proporciona una muestra con lo cual se puede obtener información como la actividad de lactato deshidrogenasa, la identidad de la población celular y los perfiles de citoquinas¹⁶. Juntos, estos datos pueden formar una comprensión más completa de las interacciones huésped-patógeno que se producen durante la neumonía bacteriana secundaria.

Si bien los métodos discutidos han sido en el contexto de la neumonía bacteriana secundaria, son adecuados para extenderse a cualquier modelo murino de infección respiratoria inferior; específicamente, aquellos que se beneficiarían de la entrega y recuperación del inóculo instalado. Además, al igual que muchas otras vías de infección, la instilación intratraal se puede utilizar en aplicaciones no infecciosas, como la administración de terapias y compuestos ambientales^12.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Lysing Matrix B	MP Biomedicals	6911100	Referido en el texto como "perlas de sílice de 0,1 mm",
una aguja roma de calibre 21	SAI	B21-150	1,5".
Conjunto de DNasa libre de RNasa	Qiagen	79254	DNasa utilizada en el texto adjunto.
FastPrep-24 Classic Instrument	MP Biomedicals 116004500		FastPrep FP120 ha sido vendido a nivel mundial. Referido en el texto como "Bead Beater"
TaqMan AIV-Matrix Reagents	Applied Biosystems	4405543	Influenza A Kit qRT-PCR del segmento M.
Soporte de intubación	Kent Scientific	ETI-MES-01	Referida en el texto como "plataforma de intubación". La plataforma de intubación utilizada en el video adjunto fue hecha internamente.
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106	Kit de purificación de ARN; contiene columnas RNeasy, Buffer RLT, Buffer RW1 y Buffer RPE
QIAamp Viral RNA Mini Kit	Qiagen	52904	Kit de purificación de ARN viral.
Molinos de papel tisú	Thermo Fisher Scientific	02-542-08
2-Mercaptoetanol (β-Mercaptoetanol)	Calbiochem	UN2966