Determinación de la densidad del conducto biliar en el hígado del ratón

El árbol biliar es una parte crítica del hígado de mamífero, permitiendo el paso de la bilis de los hepatocitos al intestino. Los conductos biliares intrahepáticos (BD) están formados por colangiocitos, que se diferenciande los hepatoblastos bipotenciales a través de la señalización Notch y TGF 1^,2. La especificación adecuada y el compromiso de los colangiocitos y su ensamblaje en BDs maduros son críticos para el desarrollo del árbol biliar intrahepático. A medida que el hígado crece durante el desarrollo o después de la regeneración de órganos, el sistema biliar necesita desarrollarse a lo largo del hígado para asegurar el drenaje biliar adecuado. Además, una serie de enfermedades sindrómicas y no sindrómicas dan lugar a la escasez de LOS DE intrahepáticos³. Además, una serie de enfermedades hepáticas agudas y crónicas dan lugar a las llamadas reacciones ductulares en el hígado, que se definen como la presencia de un número significativo de células que expresan marcadores biliares pero no necesariamente surgen de células biliares o forma de patente BDs⁴. En el trastorno multisistema Síndrome de Alagille (ALGS), haploinsuficiencia del ligando Notch irregular1 (JAG1) resulta en mala formación de BD y colestasis^5,6. Nuestro laboratorio demostró recientemente que una línea de ratón heterocigoto Jag1 previamente generada⁷ es un modelo animal de la escasez BD en ALGS^8. En este modelo de ratón de ALGS, los colangiocitos todavía están presentes. Sin embargo, no se comprometen a incorporarse a los DE de patente^8. Por lo tanto, el análisis del hígado en un modelo de escasez de BD requiere más que la presencia aparente o ausencia de colangiocitos. Es importante evaluar con precisión el grado en que los BDmaduros están presentes en el hígado.

En patología anatómica, existen métodos cuantitativos aceptados para evaluar si la escasez de BD existe⁹. Por ejemplo, los estudios sobre ALGS en pacientes humanos a menudo cuantifican la relación BD a vena porta (PV) mediante el análisis de al menos 10 vasos de portal por biopsia hepática^9,10. El análisis de la forma y la presencia o ausencia general de LOS BD de patentes, combinados con la química sérica, pueden proporcionar información valiosa sobre el desarrollo de BD en ratones^11,12,13. Sin embargo, los ratones pueden perder un número significativo de BDs con sólo un aumento modesto en el nivel^debilirrubina sérica 8. En consecuencia, un método cuantitativo que evalúe el número de BD presentes por PV puede proporcionar una medida más directa del grado de escasez de BD en ratones. En un informe reciente, cuantificamos el número de BDs por PV en todos los lóbulos hepáticos y reportamos una disminución significativa en la relación BD a PV en Jag1+/– animales⁸. Durante el transcurso de nuestro análisis, nos dimos cuenta de que a pesar de la variación significativa en el grado de respuesta inflamatoria y reacciones ductulares, la relación BD a PV no muestra mucha variabilidad⁸. Además, la cuantificación de la relación BD a PV nos permitió demostrar que la eliminación de una copia del gen de la glicoseltransferasa Poglut1 en Jag1+/– los animales pueden mejorar significativamente su escasez de BD⁸. En un fondo Jag1+/+, la pérdida condicional de Poglut1 en las células musculares lisas vasculares da como resultado un aumento progresivo en el número de BD, que es modesto (20-30%) en P7 pero sehace prominente en adultos 8. Una vez más, esta técnica nos permitió mostrar que incluso en P7, el aumento de la densidad de BD en estos animales es estadísticamente significativo. Cabe destacar que el aumento de la densidad de BD en este genotipo a los cuatro meses de edad también se validó mediante el análisis de fundición de resina. ⁸ Estas observaciones y otros informes que midieron la densidad de BD en diferentes modelos de ratón ALGS^14,15 nos llevaron a incorporar este método en nuestra estrategia general para analizar defectos biliares en varios mutantes y ratones transgénicos.

Aquí, detallamos una técnica sencilla que se puede utilizar para examinar el grado de escasez de BD en modelos de ratón de enfermedad hepática (Figura1). En este método, la co-tinción con marcadores de colangiocitos cytoqueratina (CK) 8 y CK19 (en adelante CK de amplio espectro, wsCK) se utiliza para visualizar BDs y cholangiocitos no incorporados en el hígado del ratón. Se añade un anticuerpo contra la actina muscular alfa-suave (-SMA) a la tinción para etiquetar los vasos. El análisis sistemático de la relación BD a PV en una sección que cubre todos los lóbulos hepáticos garantiza que se analice un gran número de PV para cada genotipo. Dado que nuestro método se basa en la cuantificación de BDs y PV en imágenes 2D, no es adecuado para estudiar los efectos de una mutación dada en la estructura 3D del árbol biliar o la integridad de los pequeños conductos biliares. Sin embargo, proporciona una estrategia simple y objetiva para que los investigadores evalúen el desarrollo biliar en el ratón.

Todos los animales fueron alojados en una instalación de animales de barrera en Baylor College of Medicine según las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales y bajo protocolos de animales aprobados.

1. Colección de tejido hepático de ratón

1. Preparación del ratón para la cosecha hepática
   1. Eutanasia el ratón usando isoflurano.
   2. Realizar la luxación cervical del ratón para asegurar la muerte.
   3. Haga una incisión transversal aproximadamente una pulgada por debajo de la caja torácica.
   4. Exponer toda la superficie ventral del hígado.
2. Colección del hígado de ratón
   1. Con cuidado, con tijeras pequeñas, corte a través de los ligamentos que conectan el hígado con otros órganos del abdomen.
   2. Corte a través de la BD común para separar el hígado del intestino.
   3. Retire cuidadosamente el hígado aferrándose a la vesícula biliar e colóquelo inmediatamente en un tubo de 50 ml lleno a tres cuartas partes por 4% de paraformaldehído (PFA).

2. Fijación e incrustación del hígado en parafina

1. Fijación
   1. Fijar el tejido hepático durante 48 h en 4% de PFA a 4 oC.
   2. Lavar el tejido con 70% EtOH durante 1 h a 4oC.
   3. Lavar el tejido dos veces con 95% EtOH durante 1 h cada uno a 4 oC.
   4. Lavar el tejido dos veces con 100% EtOH durante 1 h cada uno a 4 oC.
2. Claro
   1. Lave el tejido hepático con agente limpiador (Tablade materiales)tres veces durante 30 minutos cada una a temperatura ambiente.
      NOTA: El hígado debe sentirse rígido después del tercer lavado.
3. Incrustar en parafina
   1. Coloque el cassette de tejido en un molde de tejido en cera de parafina durante 3 lavados, 30 min cada uno. La cera se debe precalentar a 60 oC.
   2. Llenar el molde de tejido con cera de parafina a tres cuartos de altura y mantener en un bloque de calentamiento a 60 oC.
   3. Coloque el hígado en el molde con el lado ventral hacia arriba.
   4. Retire con cuidado el molde del bloque de calefacción.
   5. Coloque la parte superior del cassette en el molde y rematar con parafina líquida caliente.
   6. Deje que el molde y el bloque se enfríen a temperatura ambiente durante la noche.
      NOTA: Los bloques de tejido ahora se pueden almacenar a temperatura ambiente.

3. Seccionar el tejido hepático

1. Preparación del bloque para la sección
   1. Coloque el molde sobre hielo durante 5 minutos antes de retirar el bloque del molde.
   2. Coloque el bloque sobre hielo con un papel de tejido de laboratorio presente entre el bloque y el hielo.
   3. Mantenga el bloque en hielo cuando no se ensección para obtener los mejores resultados de corte de tejido.
2. Seccionar los bloqueos hepáticos
   1. Usando un microtome, comience por seccionar a través del lado superficial y dorsal del hígado. Las secciones deben ser de 5 m.
   2. Compruebe las secciones superficiales bajo un microscopio de disección para asegurarse de que las secciones no estén cizalladas ni dobladas.
   3. Tome una sección del hígado que incluya el lóbulo caudado.
      NOTA: Para algunos bloques, tendrá los lóbulos izquierdo, medial, derecho y caudado en la misma rebanada de tejido.
   4. Para aquellos bloques donde los cuatro lóbulos no están presentes en la misma diapositiva, continúe cortando hasta que los lóbulos izquierdo, medial y derecho estén presentes en la misma diapositiva.

4. Inmunohistoquímica para wsCK y SSMA

1. Procesamiento de diapositivas para inmunohistoquímica
   1. Seleccione una diapositiva por genotipo que desee analizar.
   2. Lave el portaobjetos durante 15 min en Xileno, 100% EtOH, 95% EtOH y finalmente 70% EtOH (3 x 5 min en cada solución).
   3. Lavar el portaobjetos durante 5 minutos en H₂O desionizado.
   4. Sumerja la diapositiva en la solución de recuperación de antígenos (basada en tris, pH alto).
   5. Caliente bajo presión en una olla a presión durante 3 min a 10 psi.
   6. Deje que la corredera se enfríe a temperatura ambiente (aproximadamente 35 min).
2. Bloqueo de las secciones tisulares
   1. Con un Pap Pen, delinee las secciones de la diapositiva.
   2. Aplique solución salina con fosfato (PBS) + 0,1% Tween para cubrir la sección dos veces, 5 min cada una.
   3. Haga el tampón de bloqueo mezclando Normal Goat Serum (NGS) a 1:50 en PBS + 0.3% Triton. Para tener suficiente búfer tanto para el bloqueo como para la aplicación de anticuerpos primarios, es suficiente 100 l por sección.
   4. Aplicar 100 l de solución de bloqueo por sección.
   5. Incubar las correderas cubiertas con la solución de bloqueo a 4oC durante 1 h.
3. Tinción para wsCK y SSMA
   1. Diluir los anticuerpos anti-CK8 y anti-CK19¹⁶ (Developmental Studies Hybridoma Bank, TROMA-I y TROMA-III, respectivamente) 1:20 en el buffer de bloqueo a mancha para wsCK. Diluir el anticuerpo anti-SMA¹⁷ (Tablade materiales)a 1:200 en el mismo búfer.
   2. Aplicar 100 l de la solución de anticuerpos diluidos que contenga los tres anticuerpos en cada sección.
   3. Incubar los portaobjetos cubiertos con la solución de anticuerpos a 4oC durante la noche.
   4. Lave los portaobjetos con PBS + 0.1% Tritón tres veces, 5 min cada uno.
   5. Diluir anticuerpos secundarios (anti-rat-Alexa488 y anti-ratón-Cy5) 1:200 en PBS + 0.3% Tritón.
   6. Aplicar 100 l de la solución secundaria de anticuerpos que contenga ambos anticuerpos secundarios en las diapositivas.
   7. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
4. Tinción y montaje nuclear dAPI
   1. Lave los portaobjetos tres veces, 5 min cada uno.
   2. Aplicar 100 sL de DAPI (1:3000) a cada sección durante 10 min.
   3. Aplique el medio de montaje antidesal descolorante (Tablade materiales)a las diapositivas y coloque un cubreobjetos de vidrio en la parte superior de las secciones de tejido. Deje los toboganes a 4oC durante la noche. Selle las diapositivas al día siguiente.
   4. Almacene las diapositivas a 4oC y la imagen dentro de 1 semana de montaje.

5. Imagen y cuantificación de los BD

1. Imágenes de las secciones hepáticas
   1. Antes de tomar imágenes, cegé el genotipo de la muestra con la ayuda de un miembro del laboratorio. Asegúrese de que todos los archivos de imágenes carecen de genotipo u otra información de identificación específica además de un número de animal/muestra.
   2. Usando un microscopio fluorescente, tome imágenes 20x con zoom 1x de cada sección y asegúrese de que cada PV a través del hígado esté fotográfico. Incluya los lóbulos izquierdo, medial, derecho y caudado.
      NOTA: Por lo general encontramos 60-90 vías de portal por animal dependiendo del tamaño del hígado.
   3. Para identificar los PV, busque la tinción de saqueo más wsCK. Las estructuras que son positivas de sam, pero que carecen de tinción wsCK, no son estructuras de portal.
2. Identificación y conteo de BDs
   1. Cree una hoja de cálculo con las siguientes columnas: Número de animal/muestra, Número de imagen, Número de PV y Número de BD.
   2. Repasando cada imagen, identifique y registre el número de PV por imagen.
   3. Identificar los DES de patente en cada imagen mediante la presencia de colangiocitos (wsCK+) que rodean un lumen definible. Las estructuras deben ser distintas y separadas por mesenquime de otras células wsCK+.
   4. Cuente cada BD de patente y colóquela en la misma columna que el número de imagen.
   5. Haga esto para cada imagen tomada de un PV.
   6. Calcule la suma de todos los PV y todos los BD en la muestra de hígado.
   7. Calcule la relación BD a PV para la muestra de hígado.

Anteriormente documentamos defectos biliares en Jag1+/– animales, un modelo de ratón de ALGS8. Para determinar la relación BD a PV, seccionamos los hígados de ratón P30 y los colocamos co-teñidos para CK8 y CK19 (wsCK) junto con el marcador vascular SMA. Luego dimos una imagen de todos los PV en cada uno de los lóbulos hepáticos. Tal y como se muestra en de la Figura 2A,definimos los PV como los recipientes manchados de SMA que tienen tinción wsCK adyacente (puntas de flecha). Las estructuras teñidas de SMA sin wsCK eran venas centrales y no debían incluirse en el análisis (flecha).

Una vez identificados los PV, identificamos los DATOS de patentes por su forma característica. Como se muestra en la Figura3, los conductos de patente tienen un lumen claramente definible que está rodeado de colangiocitos wsCK+. Los conductos generalmente se separan de los conductos cercanos o colangiocitos por mesenquime (cabeza de flecha). Las celdas wsCK+ que no tienen un lumen definible, están unidas a celdas adyacentes, o aparecen de forma aislada, no se cuentan para el número total de BD (flechas). La Figura 3A muestra una sección hepática de tipo salvaje con un PV que está asociada con un conducto completamente patente junto con varias células no incorporadas. La Figura 3B es una sección hepática representativa de un animal P30 Jag1+/–. No hay datos de patentes en torno a los tres PV de esta sección. Todas las celdas wsCK+ no están incorporadas y, por lo tanto, no deben contarse. Esta imagen destaca la importancia del recuento cuidadoso de BD, ya que la presencia o ausencia de células wsCK+ no diferencia los hígados Jag1+/– y de tipo salvaje.

Como se muestra en la Figura 1D,el análisis de la relación BD a PV implica contar cada PV en la sección hepática junto con el número total de EB de patente presentes alrededor de cada PV. Al analizar los hígados Jag1+/–, nos dimos cuenta de que diferentes lóbulos no se ven necesariamente afectados en la misma medida en estos animales (datos no publicados). Por lo tanto, generalmente contamos los PV en los lóbulos izquierdo, medial, derecho y caudado para garantizar una cobertura hepática completa. Tras la tabulación del total de PV y BDs, la relación se calcula para toda la sección.

En la Figura4, mostramos el análisis de las relaciones BD a PV para 3 animales de tipo salvaje y 3 Jag1+–. Este gráfico muestra cómo los dos genotipos se pueden distinguir fácilmente en función de los recuentos de BD. Además, este método proporciona una medida cuantitativa para el análisis del grado de rescate del fenotipo Jag1+/– por manipulaciones genéticas, como se informó anteriormente8.

Figura 1: Esquema del proceso experimental. (A) El hígado se cosecha entero del ratón. (B) Las muestras de hígado se fijan durante 48 h, deshidratadas y despejadas. (C) El tejido hepático está incrustado en la parafina. Las secciones se fabrican y colocan en diapositivas cargadas y se tiñen para wsCK y .SMA. (D) Se crean imágenes y se graba el número de PV y BDs. La relación BD a PV (BD:PV) se calcula para toda la sección hepática. HA - arteria hepática; CV - vena central. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Distinguir las venas centrales de PVs. (A) Un PV se identifica por la presencia de tinción de samio y colangiocitos wsCK+ circundantes (cabezas de flecha). (B) Las venas centrales se identifican por la presencia de tinción de la AMA sin colangiocitos wsCK+ presentes alrededor de la estructura (flecha). (A' y B') Imágenes en escala de grises que muestran los canales de SMA de A y B, respectivamente. Barra de escala de 100 m y se aplica a todos los paneles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Identificación de los EB de patentes. (A-A')  En los hígados de tipo salvaje P30, contamos estructuras redondas a elipsoides con un lumen discernible rodeado de colangiocitos wsCK+ como una patente BD (arrowhead). Los colangiocitos que no rodean un lumen se consideran no incorporados y no se cuentan (flechas). (B-B') En Jag1+/– hígados, los colangiocitos siguen presentes (flechas). Sin embargo, la mayoría no se incorporan a los EB de patente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: El bd a gráfico fotovoltaico de los hígados de ratón P30. Se cuantifican los BD y los PV y se genera la relación bd-PV. Como se informó anteriormente8, Jag1+/– los animales tienen una disminución característica y significativa en la relación BD a PV en comparación con los animales de tipo salvaje. Para el análisis estadístico, se realizó una prueba tbidireccional. Las líneas horizontales muestran medios. P<0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen conflicto de intereses.