Determinación de la densidad del conducto biliar en el hígado del ratón

Resumen

Presentamos un método bastante simple y sensible para la cuantificación precisa de la densidad de las vías biliares en el hígado del ratón. Este método puede ayudar a determinar los efectos de los modificadores genéticos y ambientales y la eficacia de las terapias potenciales en modelos de ratón de enfermedades biliares.

Resumen

El ratón se utiliza ampliamente como un organismo modelo para estudiar enfermedades biliares. Para evaluar el desarrollo y la función del sistema biliar, se utilizan diversas técnicas, incluyendo la química sérica, el análisis histológico y la inmunomancha para marcadores específicos. Aunque estas técnicas pueden proporcionar información importante sobre el sistema biliar, a menudo no presentan una imagen completa de los defectos de desarrollo del conducto biliar (BD) en todo el hígado. Esto se debe en parte a la robusta capacidad del hígado del ratón para drenar la bilis incluso en animales con deterioro significativo en el desarrollo biliar. Aquí presentamos un método simple para calcular el número promedio de BDs asociados a cada vena porta (PV) en secciones que cubren todos los lóbulos de ratones mutantes/transgénicos. En este método, los hígados se montan y seccionan de manera estereotípica para facilitar la comparación entre varios genotipos y condiciones experimentales. Los BDse identifican mediante microscopía ligera de colangiocitos manchados de citoqueratina, y luego se cuentan y dividen por el número total de PV presentes en la sección hepática. Como ejemplo, mostramos cómo este método puede distinguir claramente entre ratones de tipo salvaje y un modelo de ratón del síndrome de Alagille. El método presentado aquí no puede sustituir a las técnicas que visualizan la estructura tridimensional del árbol biliar. Sin embargo, ofrece una manera fácil y directa de evaluar cuantitativamente el desarrollo de BD y el grado de formación de reacciones ductulares en ratones.

Introducción

El árbol biliar es una parte crítica del hígado de mamífero, permitiendo el paso de la bilis de los hepatocitos al intestino. Los conductos biliares intrahepáticos (BD) están formados por colangiocitos, que se diferenciande los hepatoblastos bipotenciales a través de la señalización Notch y TGF 1^,2. La especificación adecuada y el compromiso de los colangiocitos y su ensamblaje en BDs maduros son críticos para el desarrollo del árbol biliar intrahepático. A medida que el hígado crece durante el desarrollo o después de la regeneración de órganos, el sistema biliar necesita desarrollarse a lo largo del hígado pa....

Protocolo

Todos los animales fueron alojados en una instalación de animales de barrera en Baylor College of Medicine según las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales y bajo protocolos de animales aprobados.

1. Colección de tejido hepático de ratón

1. Preparación del ratón para la cosecha hepática
   1. Eutanasia el ratón usando isoflurano.
   2. Realizar la luxación cervical del ratón para asegurar la muerte.
   3. Haga una incisión transversal aproximadamente una pulgada por debajo de la caja torácica.
   4. Exponer toda la superficie ventral del hígado.
2. <....

Resultados

Anteriormente documentamos defectos biliares en Jag1+/– animales, un modelo de ratón de ALGS⁸. Para determinar la relación BD a PV, seccionamos los hígados de ratón P30 y los colocamos co-teñidos para CK8 y CK19 (wsCK) junto con el marcador vascular SMA. Luego dimos una imagen de todos los PV en cada uno de los lóbulos hepáticos. Tal y como se muestra en de la Figura 2A,definimos los PV como los recipientes manchados de SMA qu.......

Discusión

El análisis del desarrollo y reparación de BD en ratones es una herramienta importante en el estudio de la patogénesis y el mecanismo de los trastornos colestásicos. Además, el desarrollo de nuevas terapias depende en parte de la creación de un fenotipo reproducible y preferiblemente cuantificable. El fenotipado actual en modelos de ratón generalmente implica química sérica, histología hepática e inmunostaining para marcadores específicos de tipo celular. Aunque estas técnicas generan información valiosa sobre la estruct.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Isothesia (isoflurano)	Henry Schein	11695-6776-2
Desecador	Bel-Art	16-800-552
10% PFA	Ciencias de la Microscopía Electrónica	15712
Tubo de 50	mL ThermoScientific	339653
70% Etanol	Descontaminación	Laboratorios 2401
95% Etanol	Descontaminación Laboratorios	2801
100% Etanol	Descontaminación Laboratorios	2701
HistoChoice	VWR Life Sciences	H103-4L	de limpieza
Omnisette Tissue Cassette Fisher	HealthCare	15-197-710E
Macrosette	Simport	M512
Paraplast X-TRA	McCormick Scientific 39503002		Molde de tejido de Parrafín
	Fisher Scientific	62528-32
Microtomo	Microm	HM 325
Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio	Fisher Scientific	12-550-15
Xileno	Fisher Scientific	C8H10
Laboratorio de vectores de recuperación de antígenos basado en Tris	H-3301
Presión Cocina	Instant Pot	Lux Mini
Mini Pap Pen	Life Technologies	8877
Polioxietileno 20 Monolaurato de sorbitán (Tween-20)	J.T. Baker	X251-07
Etoxilato de Octil Fenol (Triton-X-100)	J.T. Baker	X198-07
Suero de cabra normal	Jackson Immunoresearch	005-000-121
anti-CK8	Banco de Estudios del Desarrollo (Banco de Hibridomas	TROMA-I Identificación del	Registro de Anticuerpos AB531826
anti-CK19	Estudios del Desarrollo Banco de Hibridomas	TROMA-III Identificación del Registro de	Anticuerpos AB2133570
anti-αSMA	Sigma Aldrich	A2547, Clon 1A4
anti-rata-Alexa488	ThermoFisher	A21208
anti-ratón-Cy5	Jackson Immunoresearch	715-175-151
DAPI	Vector Laboratories	H-1000
22 x 50 mm2 microcubreobjetos	VWR Life Sciences	48393 059
Microscopio de fluorescencia	Leica	DMI6000 B
Kimwipes	Kimtech Science	05511
VECTASHIELD	Vector Laboratories	H-1000	Medio de montaje antidecoloración