Protocatechuato 3,4-dioxigenasa (PCD) puede eliminar enzimáticamente el oxígeno diatómico libre de un sistema acuoso utilizando su sustrato ácido protocatecúrico (PCA). Este protocolo describe la expresión, purificación y análisis de actividad de esta enzima de barrido de oxígeno.
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Artículo de método
Expresión y purificación de la distribución de oxígeno libre de nucleasa Protocatechuato 3,4-Dioxigenasa
En este artículo
Resumen
Resumen
La microscopía de molécula única (SM) se utiliza en el estudio de interacciones moleculares dinámicas de biomoléculas etiquetadas con fluoróforo en tiempo real. Sin embargo, los fluoróforos son propensos a la pérdida de señal a través del fotoblanqueo por oxígeno disuelto (O2). Para evitar el fotoblanqueo y prolongar la vida útil del fluoróforo, se emplean sistemas de barrido de oxígeno (OSS) para reducir O2. El SAO disponible comercialmente puede estar contaminado por nucleasas que dañan o degradan los ácidos nucleicos, interpretando confundiendo los resultados experimentales. Aquí detallamos un protocolo para la expresión y purificación de Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) sin contaminación nucleasa detectable. PCD puede eliminar eficientemente las especies reactivas de O2 mediante la conversión del sustrato ácido protocatecúico (PCA) a 3-carboxy-cis, ácido cis-muconic. Este método se puede utilizar en cualquier sistema acuoso donde O2 desempeña un papel perjudicial en la adquisición de datos. Este método es eficaz en la producción de PCD libre de nucleasas altamente activo en comparación con PCD disponible comercialmente.
Introducción
La biofísica de molécula única (SM) es un campo que cambia rápidamente la forma en que miramos los fenómenos biológicos. Este campo tiene la capacidad única de vincular las leyes fundamentales de la física y la química a la biología. La microscopía de fluorescencia es un método biofísico que puede lograr la sensibilidad SM. La fluorescencia se utiliza para detectar biomoléculas vinculándolas a pequeños fluoróforos orgánicos o puntos cuánticos1. Estas moléculas pueden emitir fotones cuando se excitan con láseres antes de fotoblanquear irreversiblemente2. El fotoblanqueo se produce cuando las etiquetas fluorescentes sufren....
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Protocolo
1. Inducir la expresión de PCD en E. coli
- Combinar 1 plzantes de expresión PCD pVP91A-pcaHG (20 ng/L, Figura 1A) y 20 l de E.coli BL21 (células disponibles comercialmente de 20 l, > 2 x 106 cfu/g de plásmido) en un tubo. Deslice el tubo para mezclar. Coloque el tubo sobre hielo 5 min.
- Coloque la transformación a 42 oC durante 30 s. Luego hielo 2 min.
- Añadir medios SOC de 80 l (caldo súper óptimo con represión catabolita: 2,5 mM KCl, 10 mM de NaCl, 2% de triptona, 0,5% de extracto de levadura, 10 mM MgSO4,10 mM MgCl2,20 mM de glucosa). Agitar ....
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Resultados
El PCD carroñero de oxígeno disponible en el nombre comercial con frecuencia está contaminado con una nucleasa de ADN. La contaminación de la actividad nucleasa podría dar lugar a resultados espurios en estudios fluorescentes, particularmente estudios que analizan el ADN o las proteínas que interactúan con el ADN. Hemos encontrado que el PCD recombinante, un heterodérmero de hexahistidina etiquetado pcaH y pcaG, puede expresarse en E. coli (Figura 1). El hete.......
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Discusión
Los sistemas de barrido de oxígeno se incluyen comúnmente en la microscopía de fluorescencia de una sola molécula para reducir el fotoblanqueo3,7,8. Estas técnicas de microscopía se utilizan a menudo para observar ácidos nucleicos o interacciones proteicas con ácidos nucleicos1,13,14. La contaminación de los SSS con nucleasas puede dar .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por NIH GM121284 y AI126742 a KEY.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M3148 | y beta; ME |
| 30% acrilamida y solución de bis-acrilamida, 29:1 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Ácido acético, Glacial Certified ACS | Fisherl Chemical | A38C-212 | |
| Agar, Granulado | BD Biosciences | DF0145-17-0 | |
| AKTA Sistema FPLC | GE Healthcare Life Sciences | AKTA Purificador: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900 y Frac-920 | |
| Unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-2 | EMD Millipore | UFC201024 | 10 kDa MWCO |
| Sulfato de hierro (II) amonio hexahidratado | Sigma | F-2262 | |
| Persulfato de amonio (APS) Tabletas | Amresco | K833-100TABS | |
| Ampicilina | Amresco | 0339-25G | |
| Bacto Triptona | BD Biosciences | DF0123173 | |
| Aditivo de medios de cultivo deshidratados BD Becto: extracto de levadura de botella | VWR | 90004-092 | |
| propano BIS-TRIS, > = 99.0% (valoración) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| Azul de bromofenol | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue | Amresco | 0472-50G | |
| Costar 96– Bien plano – Placa inferior EIA | Bio-Rad | 2240096EDU | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 500ML | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | PBS |
| Bromuro de etidio | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glicerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Caldo LB granulado Miller | EMD Biosciences | 1.10285.0500 | |
| Agarosa estándar de alta resolución | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I0250-250G | |
| IPTG | Goldbio | I2481C25 | |
| Leupeptina | Roche | 11017128001 | |
| Lisozima de Clara de Huevo de Gallina | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Cloruro de magnesio hexahidratado | Amresco | 0288-1KG | |
| Espectrofotómetro de microvolumen, con capacidad de cuveta | Thermo Fisher | ND-2000C | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| Ni-NTA Superflow (100 ml) | Qiagen | 30430 | |
| Novagen BL21 Células competentes | EMD Millipore | 69-449-3 | Medios SOC incluidos |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Pepstatin | Gold Biotechnology | P-020-25 | |
| PMSF | Amresco | 0754-25G | |
| Ácido protocatecuico | Fisher Scientific | ICN15642110 PCA | |
| Dodecil sulfato de sodio | P212121 | CI-00270-1KG | |
| SpectraMax M2 Lector de microplacas | Dispositivos moleculares | ||
| Unidades de filtro desechables estériles con membrana PES > 250 ml | Thermo Fisher Scientific | 09-741-04 | |
| Unidades de filtro desechables estériles con membrana PES > 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 09-741-02 | |
| Superose 12 10/300 GL | GE Healthcare Ciencias de la Vida 17517301 | ||
| TEMED | Amresco | 0761-25ML | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| Typhoon 9410 generador de imágenes fluorescente de modo variable | GE Healthcare Life Sciences | ||
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 |
Referencias
- Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).
- Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen....
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Reimpresiones y permisos
