Funcionalización de voladizos de microscopio de fuerza atómica con células de una t o de una sola partícula para espectroscopia de fuerza de una sola célula inmunológica

Resumen

Presentamos un protocolo para funcionalizar los voladizos del microscopio de fuerza atómica (AFM) con una sola célula T y partícula de cuentas para estudios inmunológicos. Se muestran los procedimientos para sondear la unión de células T de un solo par por AFM y para monitorear la respuesta celular en tiempo real de los macrófagos a una sola partícula sólida por AFM con imágenes de fluorescencia.

Resumen

La espectroscopia de fuerza de célulaúnica basada en microscopía de fuerza atómica (AFM-SCFS) es una poderosa herramienta para estudiar las propiedades biofísicas de las células vivas. Esta técnica permite sondear las fuerzas de interacción y la dinámica en una membrana celular viva, incluyendo aquellos entre las células, receptor y ligandos, y junto con muchas otras variaciones. También funciona como un mecanismo para entregar un estímulo físico o bioquímico en células individuales de una manera controlada espaciotemporalmente, permitiendo así la activación celular específica y los eventos celulares subsiguientes para ser monitoreadoen en tiempo real cuando se combina con células vivas fluorescencia. El paso clave en esas mediciones AFM-SCFS es la funcionalización AFM-cantilever, o en otras palabras, adjuntar un sujeto de interés al voladizo. Aquí, presentamos métodos para modificar los voladizos AFM con una sola célula T y un solo cordón de poliestireno respectivamente para estudios inmunológicos. El primero implica un pegamento biocompatible que acopla células T individuales a la punta de un voladizo plano en una solución, mientras que el segundo se basa en un pegamento epoxi para la adhesión de un solo cordón en el ambiente del aire. También se proporcionan dos aplicaciones inmunológicas asociadas con cada modificación en voladizo. Los métodos descritos aquí se pueden adaptar fácilmente a diferentes tipos de células y partículas sólidas.

Introducción

La microscopía de fuerza atómica (AFM), una herramienta versátil, ha encontrado muchas aplicaciones en la investigación de biología celular^1,2,3,4,5. Aparte de su capacidad de imagen de alta resolución, la función nativa de sondeo de fuerza permite investigar directamente las propiedades biofísicas de las células vivas in situ en el nivel^6deuna sola célula,^7. Estas incluyen las rigideces de las estructuras subcelulares o incluso células enteras

Protocolo

El protocolo de experimento de ratón sigue las pautas de cuidado animal de la Universidad de Tsinghua

1. Funcionalización en voladizo con células T únicas

1. Preparación de células de bazo de ratón
   1. Sacrificar el ratón (8-16 semanas de edad (ya sea sexo); por ejemplo, cepa C57BL/6) usando dióxido de carbono, seguido de luxación cervical.
   2. Limpie el ratón con 75% de etanol y haga una incisión cutánea de línea media seguida de una esplenectomía.
   3. Homogeneizar el bazo en 4 ml de PBS que contiene 2% de suero bovino fetal (FBS) utilizando diapositivas de vidrio y eliminar agregados y desechos pasando la suspensi....

Resultados

La Figura 4A muestra las curvas típicas de fuerza-distancia de la interacción de enlace entre la célula de una T y la sola CC en un ciclo de aproximación-retracción. La curva roja clara es la curva de extensión y la roja oscura es la curva de retracción. Dado que la curva de extensión se utiliza normalmente para la sangría o el análisis de rigidez, aquí sólo la curva de retracción se refiere a la adhesión de celdas. El valor mínimo (el círculo verde) en la cu.......

Discusión

La espectroscopia de fuerza de una sola célula basada en AFM ha evolucionado hasta convertirse en una poderosa herramienta para abordar las propiedades biofísicas de las células vivas. Para esas aplicaciones, el voladizo debe ser funcionalizado correctamente con el fin de sondear interacciones específicas o propiedades en las celdas de interés. Aquí, se describen los métodos para acoplar una sola célula T y un solo micronés a la voladizo sin punta, respectivamente. Para fijar una sola célula T al voladizo, se eligió un p.......

Materiales

NameCompanyNúmero de catálogo

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Material
10 μ l punta de pipeta	Thermo Fisher	104-Q
tubo de 15 ml	Corning	430791
plato de cultivo de 6 cm de diámetro	NALGENE nunc
placa de cultivo de 6 pocillos	JET	TCP011006
AFM Voladizo	NanoWorld Arrow-TL1-50		voladizo sin punta
β-Mercaptoethanol	Sigma	7604
Pegamento biocompatible	BD Cell-Tak	354240
CD4+ Cóctel de aislamiento de células T	STEMCELL	19852C.1
Línea celular DC2.4	Un regalo de K. Rock (Facultad de Medicina de la Universidad de Massachusetts, Worcester, MA)
Partículas magnéticas recubiertas de dextrano	STEMCELL	SV30010
EDTA	GENEray	Generay-E1101-500 ml
Epoxi	ERGO	7100
Etanol	twbio	00019
FBS	Ex Cell Bio	FSP500
FcR bloqueador	STEMCELL	18731
Cubreobjetos de vidrio	vendedor local (Hai Men Lian Sheng)	HX-E37	24 mm de diámetro, 0,17 mm de espesor
Portaobjetos de	vidrioDepartamento de gestión de equipos y laboratorio de JinTong, Haimen	N/A	personalizado
H2O2 (30%)	Sino pharm	10011218
H2SO4	Sino pharm	80120892
HEPES	Sigma	51558
Imán	STEMCELL	18000
Colador de nylon de malla	BD Falcon	REF 352350
Moesin-EGFP	N/A		clonado en laboratorio
Ratón CD25 Kit de aislamiento positivo de células Treg	STEMCELL	18782	Componente: Bloqueador de FcR, Cóctel de selección positiva de células T reguladoras, Cóctel de selección de PE, Dextran RapidSpheres,
Ratón CD4+ kit de aislamiento de células T	STEMCELL	19852	Componente:Cóctel de aislamiento de células CD4 + T, estreptavidina RapidSpheres, suero de rata
NaOH	Lanyi productos químicos co., LTD? Pekín	1310-73-2
PBS	Solarbio	P1022-500
PE cóctel de selección	STEMCELL	18151
Penicilina-estreptomicina	Hyclone	SV30010
PLCδ-PH-mCherry	Addgene	36075
Microesferas de poliestireno 6.0μ m	Polysciences	07312-5
poliestireno tubo de fondo redondo	BD Falcon	352054
Suero de rata	STEMCELL	13551
RAW264.7	ATCC
Interleucina-2 humana recombinante	Peprotech	Peprotech, 200-02-1000
Tampón de lisis de glóbulos rojos	Beyotime	C3702
Cóctel regulador de selección positiva de células T	STEMCELL	18782C
RPMI 1640	Life	C11875500BT
Cámara de muestras	Hecho en casa
Partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina	STEMCELL	50001
Kit de transfección	Pinzas	25200114
Tripsina 0.25% EDTA		JD
			strong>Comments
Equipment
20x objetivo NA 0.8	Zeiss	420650-9901	Plan-Apochromat
Microscopio de fuerza atómica	JPK	cellHesion200
Centrífuga	Beckman Reja	Allegra X-12R
Imágenes	de fluorescenciaMicroscopo de fluorescencia de reflexión interna total de tipo objetivo casero basado en un soporte
Incubadora de CO2 humidificada	Thermo Fisher	HERACELL 150i
Microscopio de luz invertida	Zeiss	Observer A1 manual

150462 de de vida Clontech 631318 N/A<de microscopio Zeiss