Implementación de un microscopio no lineal basado en la dispersión estimulada de Raman

Summary

En este manuscrito, se describe la implementación de un microscopio de dispersión Raman (SRS) estimulado, obtenido mediante la integración de una configuración experimental SRS con un microscopio de escaneo láser. El microscopio SRS se basa en dos fuentes láser de femtosegundo (fs), un Ti-Sapphire (Ti:Sa) y un oscilador paramétrico óptico sincronizado (OPO).

Abstract

La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) utiliza luz de excitación infrarroja cercana; por lo tanto, comparte muchas propiedades de imágenes microscópicas multifono. La modalidad de imagen SRS se puede obtener utilizando microscopios comerciales de exploración láser equipando con un detector de avance no desescaneado con filtros de paso de banda adecuados y un esquema de detección de amplificador de bloqueo (LIA). Un diseño esquemático de un microscopio SRS típico incluye lo siguiente: dos rayos láser pulsados, (es decir, la bomba y la sonda dirigidas en un microscopio de escaneo), que deben superponerse tanto en el espacio como en el tiempo en el plano de la imagen, y luego enfocarse mediante un objetivo de microscopio la muestra a través de dos espejos de exploración (SM), que rasterizan el punto focal a través de un plano x-y. Después de la interacción con la muestra, los pulsos de salida transmitidos son recogidos por un objetivo superior y medidos por un sistema de detección hacia adelante insertado en un microscopio invertido. Los pulsos de la bomba se eliminan mediante una pila de filtros ópticos, mientras que los pulsos de la sonda que son el resultado del proceso SRS que se produce en el volumen focal de la muestra se miden mediante un fotodiodo (PD). La lectura de los datos sobre el rendimiento es demodulada por la LIA para extraer la profundidad de modulación. Se obtiene una imagen bidimensional (2D) sincronizando la unidad de detección directa con la unidad de escaneo del microscopio. En este artículo, se describe y demuestra con éxito la implementación de un microscopio SRS, así como la notificación de imágenes sin etiquetas de perlas de poliestireno con diámetros de 3 m. Vale la pena señalar que los microscopios SRS no están disponibles comercialmente, por lo que para aprovechar estas características, la construcción casera es la única opción. Dado que la microscopía SRS se está volviendo popular en muchos campos, se cree que esta descripción cuidadosa de la implementación del microscopio SRS puede ser muy útil para la comunidad científica.

Introduction

En aplicaciones de ciencias de la vida, la microscopía SRS ha surgido como una poderosa herramienta para la creación de imágenes sin etiquetas. La idea básica de la microscopía SRS es combinar la fuerza del contraste vibratorio y su capacidad para adquirir imágenes en pocos segundos.

SRS es un proceso en el que la diferencia de frecuencia entre dos frecuencias de rayos láser (señal de bomba y señal de estoculas a diferentes frecuencias) coincide con la vibración molecular de una muestra investigada, causando dispersión de Raman estimulada y una dispersión significativa de Raman y una dispersión significativa aumento de la señal Stokes. A di....

Protocol

1. Puesta en marcha del sistema láser

1. Compruebe si la temperatura de los enfriadores se mantiene a o por debajo de 20 oC.
2. Compruebe si la unidad de control de humedad funciona correctamente y la humedad se mantiene en un valor de alrededor del 40%.
3. Encienda el láser Ti:Sa, siguiendo estrictamente las instrucciones del manual.
4. Establezca la longitud de onda en 810 nm.
5. Encienda la OPO y el miniordenador conectado. Ejecute la aplicación que controla el láser de OPO.
6. Seleccione bypass si se requiere el 100% de la salida láser Ti:Sa a la salida del cuadro OPO.
7. Anule la selección de

Results

En la Figura 7se indica un ejemplo de medición SRS (es decir, medición SRS en un único punto de la muestra). Cuando las vigas no se superponen en el tiempo o el espacio, el resultado obtenido se indica en la Figura 8a. En la baja resonancia, la amplitud de la señal medida por LIA es cero, mientras que la fase de la señal medida por LIA salta entre los valores negativos y positivos. Mientras que, cuando las vigas se superponen en el espacio, moviendo la lí.......

Discussion

La microscopía SRS ha llevado la imagen sin etiquetas a nuevas alturas, especialmente en estudios de estructuras biológicas complejas como los lípidos, que son fundamentales para las células y la arquitectura celular. Los lípidos están involucrados en múltiples vías fisiológicas como la producción de membranas biológicas, y sirven como precursores biosintéticos y transductores de señal^10. Los lípidos se envasan en orgánulos intracelulares especializados, también llamados gotas de lípidos (LD). Sus.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Herramienta de adquisición	Nikon	Nikon C2Tool Herramienta	compatible con la adquisición
APE Software de control de enlace de pulso	APE-APE Software de control de	enlace de pulso
Autocorrelador	APE	APE PulseCheck USB 50	Detector de autocorrelador
	Thorlabs Thorlabs	DET10A	Tarjeta detectora de fotodiodos
	Thorlabs	Tarjeta del detector IR	Thorlabs VRC
Espejo dicroico	Semrock Semrock	FF875-Di01-25X36	Espejo dicroico
Espejo dicroico	Semrock	FF875-Di01-25x36	Espejo dicroico
EOM	Conoptics	(EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P).	Célula de Pockels
Detector rápido	Thorlabs	Thorlabs DET025AL/M	Fotodiodo Unidad de
escaneo de espejo rápido	Nikon	C2	Cabezal de escaneo Microscpe
Láser de femtosegundo Ti:SA	Coherente	Coherente Chameleon Ultra II	Chameleon Ultra II Generador
funciones	TTi	TG5011 AIM – Generador de funciones TTi
Microscopio óptico invertido	Nikon	Eclipse TE-2000-E, Nikon	Eclipse TE-2000-E, Nikon
Lock-in Amplifier	Standford Research System	SR844-200 MHz Amplificador	de bloqueo de doble fase A de Stanford Research
Systems Filtro de muesca,	Semrock	NF03-808E-25 Filtro de	muesca
Línea de retardo óptico	Newport Newport	M-ILS200CC	Línea de retardo óptico sintonizable
Oscilador óptico paramétrico		Coherente OPO
Coherente Osciloscopio	WaveRunner	640Zi 4GHz OSC/LeCroy	Osciloscopio digital
Tarjeta PCI	Instrumento nacional	NI PCIe 6363	Tarjeta de adquisición de datos
Sensores de posición Detectores	Newport Newport	Conex PSD9	Sensor detector de posición
Cabezal del medidor de potencia	Coherent	PowerMax PM10,Detector	potencia láser
Etapas de traducción	Thorlabs	Thorlabs PT1/M	Etapa de traducción melocochónica con micrómetro estándar