Aquí, presentamos un protocolo para procesar la médula ósea fresca (BM) aislada del ratón o humana para el análisis de citometría de masa de alta dimensión (citometría por tiempo de vuelo, CyTOF) de células de linaje neutrófilo.
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Artículo de método
Preparación de la médula ósea entera para el análisis de citometría de masa de células de linaje neutrófilo
En este artículo
Resumen
Resumen
En este artículo, presentamos un protocolo que está optimizado para preservar las células de linaje neutrófilo en BM fresco para el análisis completo de BM CyTOF. Utilizamos un panel CyTOF de 39 anticuerpos sesgado por mieloides para evaluar el sistema hematopoyético con un enfoque en las células de linaje neutrófilo mediante el uso de este protocolo. El resultado de CyTOF se analizó con un algoritmo de reducción dimensional de recursos abiertos, viSNE, y los datos se presentaron para demostrar el resultado de este protocolo. Hemos descubierto nuevas poblaciones celulares de linaje neutrófilo basadas en este protocolo. Este protocolo de preparación fresca de BM entera puede utilizarse para 1), análisis CyTOF para descubrir poblaciones celulares no identificadas de BM entera, 2), investigando defectos enteros de BM para pacientes con trastornos de la sangre como leucemia, 3), ayudando a la optimización de protocolos de citometría de flujo activado por fluorescencia que utilizan BM fresco y entero.
Introducción
En las últimas décadas, los métodos de citometría han sido una poderosa herramienta para investigar el sistema hematopoyético en el BM. Estos métodos incluyen la citometría de flujo activada por fluorescencia y el nuevo método de CyTOF utilizando anticuerpos etiquetados con metales pesados. Han dado lugar a descubrimientos de muchos tipos de células en una muestra biológica heterogénea mediante la identificación de sus perfiles únicos de expresión de marcadores de superficie. El aumento de las superposiciones de espectro que se asocia con más canales conduce a una mayor inexactitud de los datos en aplicaciones de citometría de flujo activada por fluorescencia. Por lo ....
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Protocolo
Todos los experimentos siguieron las directrices aprobadas del Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto La Jolla para la Alergia e Inmunología, y la aprobación para el uso de roedores se obtuvo del Instituto La Jolla para la Alergia y la Inmunología de acuerdo con los criterios descritos en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud.
1. Cosecha de médula ósea del ratón (BM)
- Compre ratones C57BL/6J de un proveedor comercial. Alimente la dieta estándar de comida para roedores y manifieste en jaulas de microisolator en una instalación libre de patógenos.
- Utilice r....
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Resultados
La Figura 1 se presenta como un resultado de ejemplo de los experimentos CyTOF. En esta gráfica tSNE, las celdas a través de varios tejidos de ratón se agruparon en subconjuntos en función de la similitud de sus perfiles de expresión de marcador de superficie medidos por un panel CyTOF de 33 parámetros. Las celdas con propiedades más similares se agrupaban automáticamente, como los neutrófilos, los macrófagos o los datos de dominio, basándose en la expresión de los 33 marcadores de cada celd.......
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Discusión
En las últimas décadas, la citometría de flujo basada en fluorescencia se utilizó como método principal para estudiar linajes celulares y heterogeneidad1,2,3. Aunque la citometría de flujo ha proporcionado datos multidimensionales, este método está limitado por las opciones de parámetros y la superposición espectral. Para superar la debilidad de la citometría de flujo aprovechamos CyTOF, que utiliza isótopos de metales pesados e.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer al núcleo de la citometría de flujo LJI por la ayuda con el procedimiento de citometría masiva. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones NIH R01HL134236, P01HL136275 y R01CA202987 (todas a C.C.H) y ADA7-12-MN-31 (04) (a C.C.H. e Y.P.Z).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anticuerpos CyTOF (ratón) | |||
| Anti-Ratón CD45 (Clon 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Humano/Ratón CD45R/B220 (Clon RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-ratón CD105 (Clon MJ7/18)-Purificado | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
| Anti-ratón CD115 (CSF-1R) (Clon AFS98)-Biolegend purificado | Cat# 135502; RRID:AB_1937293 | ||
| Anti-Ratón CD117/c-kit (Clon 2B8)-166Er | Fluidigm | Cat# 3166004B | |
| Anti-ratón CD11a (Clon M17/4)-Purificado | Biolegend | Cat# 101101; RRID:AB_312774 | |
| Anti-Ratón CD11B (Clon M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Ratón CD11c (Clon N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-ratón CD127 (IL-7Rα) (Clon A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Ratón CD150 (Clon TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-ratón CD16.2 (Fcγ RIV) (Clon 9E9)-Biolegend Purificado | Cat# 149502; RRID:AB_2565302 | ||
| Anti-Ratón CD162 (Clon 4RA10 (RUO))-Purificado | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| Anti-ratón CD169 (Siglec-1) (Clon 3D6.112)-Biolegend purificado | Cat# 142402; RRID:AB_10916523 | ||
| Anti-ratón CD182 (CXCR2) (Clon SA044G4)-Biolegend purificado | Gato# 149302; RRID:AB_2565277 | ||
| Anti-ratón CD183 (Clon CXCR3-173)-Biolegend purificado | Gato# 126502; RRID:AB_1027635 | ||
| Anti-ratón CD335 (NKp46) (Clon 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| Anti-ratón CD34 (Clon MEC14.7)-Biolegend purificado | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | ||
| Anti-ratón CD41 (Clon MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Ratón CD43 (Clon S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| Anti-Ratón CD48 (Clon HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| Anti-ratón CD62L (Clon MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481 | |
| Anti-ratón CD71 (Clon RI7217)-Biolegend purificado | Cat# 113802; RRID:AB_313563 | ||
| Anti-ratón CD90 (Clon G7)-Biolegend purificado | Gato# 105202; RRID:AB_313169 | ||
| Anti-Ratón F4/80 (Clon BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-ratón Fcε RI&alfa; (Clon MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| Anti-ratón GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purificado | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| Anti-Ratón I-A/I-E (Clon M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Ratón Ki67 (Clon B56 (RUO))-Purificado | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| Anti-Ratón Ly-6A/E (Sca-1) (Clon D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Anti-Ratón Ly6B (Clon 7/4)-Purificado | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| Anti-ratón Ly-6G (Clon 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID:AB_2563784 | |
| Anti-Ratón NK1.1 (Clon PK136)-165Ho | Fluidigm | Cat# 3165018B | |
| Anti-Ratón Siglec-F (Clon E50-2440 (RUO))-Purificado | BD Biosciences | Cat# 552125; RRID:AB_394340 | |
| Anti-Ratón TCRβ (Clon H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Clon H57-597)-143Nd | |
| Anti-Mouse TER-119/Células Eritroides (Clon TER-119)-MaxPar Ready Biolegend | Cat# 116241; RRID:AB_2563789 | ||
| químicos, péptidos y proteínas recombinantes | lisis | ||
| ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | ||
| eBioscience Foxp3 / Juego de tampones de tinción de factor de transcripción | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Cuentas de calibración de cuatro elementos | Fluidigm | Cat# 201078 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Suero fetal bovino | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| HyClone Fosfato Solución salina tamponada | GE Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| MAXPAR Kits de etiquetado de anticuerpos | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| Azida sódica | Sigma-Aldrich | Cat# S2002 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Gato# X100 | |
| Tripsina EDTA 1x | Corning | Cat# 25-053-CL | |
| Modelo experimental: Organismo/Cepas | |||
| Ratón: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Nº de inventario: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Normalizador basado en perlas | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten y Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
Referencias
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26....
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Reimpresiones y permisos
