Method Article

Preparación de la médula ósea entera para el análisis de citometría de masa de células de linaje neutrófilo

DOI:

10.3791/59617

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June 19th, 2019

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1Division of Inflammation Biology, La Jolla Institute for Immunology, 2Flow Cytometry Core Facility, La Jolla Institute for Immunology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un protocolo para procesar la médula ósea fresca (BM) aislada del ratón o humana para el análisis de citometría de masa de alta dimensión (citometría por tiempo de vuelo, CyTOF) de células de linaje neutrófilo.

Abstract

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En este artículo, presentamos un protocolo que está optimizado para preservar las células de linaje neutrófilo en BM fresco para el análisis completo de BM CyTOF. Utilizamos un panel CyTOF de 39 anticuerpos sesgado por mieloides para evaluar el sistema hematopoyético con un enfoque en las células de linaje neutrófilo mediante el uso de este protocolo. El resultado de CyTOF se analizó con un algoritmo de reducción dimensional de recursos abiertos, viSNE, y los datos se presentaron para demostrar el resultado de este protocolo. Hemos descubierto nuevas poblaciones celulares de linaje neutrófilo basadas en este protocolo. Este protocolo de preparación fresca de BM entera puede utilizarse para 1), análisis CyTOF para descubrir poblaciones celulares no identificadas de BM entera, 2), investigando defectos enteros de BM para pacientes con trastornos de la sangre como leucemia, 3), ayudando a la optimización de protocolos de citometría de flujo activado por fluorescencia que utilizan BM fresco y entero.

Introduction

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En las últimas décadas, los métodos de citometría han sido una poderosa herramienta para investigar el sistema hematopoyético en el BM. Estos métodos incluyen la citometría de flujo activada por fluorescencia y el nuevo método de CyTOF utilizando anticuerpos etiquetados con metales pesados. Han dado lugar a descubrimientos de muchos tipos de células en una muestra biológica heterogénea mediante la identificación de sus perfiles únicos de expresión de marcadores de superficie. El aumento de las superposiciones de espectro que se asocia con más canales conduce a una mayor inexactitud de los datos en aplicaciones de citometría de flujo activada por fluorescencia. Por lo ....

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Protocol

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Todos los experimentos siguieron las directrices aprobadas del Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto La Jolla para la Alergia e Inmunología, y la aprobación para el uso de roedores se obtuvo del Instituto La Jolla para la Alergia y la Inmunología de acuerdo con los criterios descritos en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud.

1. Cosecha de médula ósea del ratón (BM)

  1. Compre ratones C57BL/6J de un proveedor comercial. Alimente la dieta estándar de comida para roedores y manifieste en jaulas de microisolator en una instalación libre de patógenos.
  2. Utilice r....

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Results

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La Figura 1 se presenta como un resultado de ejemplo de los experimentos CyTOF. En esta gráfica tSNE, las celdas a través de varios tejidos de ratón se agruparon en subconjuntos en función de la similitud de sus perfiles de expresión de marcador de superficie medidos por un panel CyTOF de 33 parámetros. Las celdas con propiedades más similares se agrupaban automáticamente, como los neutrófilos, los macrófagos o los datos de dominio, basándose en la expresión de los 33 marcadores de cada celd.......

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Discussion

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En las últimas décadas, la citometría de flujo basada en fluorescencia se utilizó como método principal para estudiar linajes celulares y heterogeneidad1,2,3. Aunque la citometría de flujo ha proporcionado datos multidimensionales, este método está limitado por las opciones de parámetros y la superposición espectral. Para superar la debilidad de la citometría de flujo aprovechamos CyTOF, que utiliza isótopos de metales pesados e.......

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

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Nos gustaría agradecer al núcleo de la citometría de flujo LJI por la ayuda con el procedimiento de citometría masiva. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones NIH R01HL134236, P01HL136275 y R01CA202987 (todas a C.C.H) y ADA7-12-MN-31 (04) (a C.C.H. e Y.P.Z).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anticuerpos CyTOF (ratón)
Anti-Ratón CD45 (Clon 30-F11) -89YFluidigmCat# 3089005B
Anti-Humano/Ratón CD45R/B220 (Clon RA36B2)-176YbFluidigmCat# 3176002B
Anti-ratón CD105 (Clon MJ7/18)-PurificadoBiolegendCat# 120402; RRID:AB_961070
Anti-ratón CD115 (CSF-1R) (Clon AFS98)-Biolegend purificadoCat# 135502; RRID:AB_1937293
Anti-Ratón CD117/c-kit (Clon 2B8)-166ErFluidigmCat# 3166004B
Anti-ratón CD11a (Clon M17/4)-PurificadoBiolegendCat# 101101; RRID:AB_312774
Anti-Ratón CD11B (Clon M1/70)-148NdFluidigmCat# 3148003B
Anti-Ratón CD11c (Clon N418)-142NdFluidigmCat# 3142003B
Anti-ratón CD127 (IL-7Rα) (Clon A7R34)-MaxPar ReadyBiolegendCat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Ratón CD150 (Clon TC1512F12.2)-167ErFluidigmCat# 3167004B
Anti-ratón CD16.2 (Fcγ RIV) (Clon 9E9)-Biolegend PurificadoCat# 149502; RRID:AB_2565302
Anti-Ratón CD162 (Clon 4RA10 (RUO))-PurificadoBD BiosciencesCat# 557787; RRID:AB_647340
Anti-ratón CD169 (Siglec-1) (Clon 3D6.112)-Biolegend purificadoCat# 142402; RRID:AB_10916523
Anti-ratón CD182 (CXCR2) (Clon SA044G4)-Biolegend purificadoGato# 149302; RRID:AB_2565277
Anti-ratón CD183 (Clon CXCR3-173)-Biolegend purificadoGato# 126502; RRID:AB_1027635
Anti-ratón CD335 (NKp46) (Clon 29A1.4)-MaxPar ReadyBiolegendCat# 137625; RRID:AB_2563744
Anti-ratón CD34 (Clon MEC14.7)-Biolegend purificadoCat# 119302; RRID:AB_345280
Anti-ratón CD41 (Clon MWReg30)-MaxPar ReadyBiolegendCat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Ratón CD43 (Clon S11)-146NdFluidigmCat# 3146009B
Anti-Ratón CD48 (Clon HM48.1)-156GdFluidigmCat# 3156012B
Anti-ratón CD62L (Clon MEL-14)-MaxPar ReadyThermoFisherCat# 14-1351-82; RRID:AB_467481
Anti-ratón CD71 (Clon RI7217)-Biolegend purificadoCat# 113802; RRID:AB_313563
Anti-ratón CD90 (Clon G7)-Biolegend purificadoGato# 105202; RRID:AB_313169
Anti-Ratón F4/80 (Clon BM8)-159TbFluidigmCat# 3159009B
Anti-ratón Fcε RI&alfa; (Clon MAR-1)-MaxPar ReadyBiolegendCat# 134321; RRID:AB_2563768
Anti-ratón GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-PurificadoBD BiosciencesCat# 554404; RRID:AB_395370
Anti-Ratón I-A/I-E (Clon M5/114.15.2)-174YbFluidigmCat# 3174003B
Anti-Ratón Ki67 (Clon B56 (RUO))-PurificadoBD BiosciencesCat# 556003; RRID:AB_396287
Anti-Ratón Ly-6A/E (Sca-1) (Clon D7)-169TmFluidigmCat# 3169015B
Anti-Ratón Ly6B (Clon 7/4)-PurificadoabcamCat# ab53457; RRID:AB_881409
Anti-ratón Ly-6G (Clon 1A8)-MaxPar ReadyBiolegendCat# 127637; RRID:AB_2563784
Anti-Ratón NK1.1 (Clon PK136)-165HoFluidigmCat# 3165018B
Anti-Ratón Siglec-F (Clon E50-2440 (RUO))-PurificadoBD BiosciencesCat# 552125; RRID:AB_394340
Anti-Ratón TCRβ (Clon H57-597)-143NdFluidigm(Clon H57-597)-143Nd
Anti-Mouse TER-119/Células Eritroides (Clon TER-119)-MaxPar Ready BiolegendCat# 116241; RRID:AB_2563789
químicos, péptidos y proteínas recombinantes lisis
ThermoFisherCat# 00-4333-57
eBioscience Foxp3 / Juego de tampones de tinción de factor de transcripciónThermoFisherCat# 00-4333-57
EQ Cuentas de calibración de cuatro elementosFluidigmCat# 201078
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)ThermoFisherCat# AM9260G
Suero fetal bovinoOmega ScientificCat# FB-02
HyClone Fosfato Solución salina tamponadaGE LifesciencesCat#SH30256.01
Intercalator-IrFluidigmCat# 201192B
MAXPAR Kits de etiquetado de anticuerposFluidigmhttp://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php
ParaformaldehídoSigma-AldrichCat# 158127
Azida sódicaSigma-AldrichCat# S2002
Triton  X-100Sigma-AldrichGato# X100
Tripsina EDTA 1xCorningCat# 25-053-CL
Modelo experimental: Organismo/Cepas
Ratón: C57BL/6JThe Jackson LaboratoryNº de inventario: 000664
Software Alogrithm
Normalizador basado en perlasFinck et al., 2013https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf
CytobankCytobankhttps://www.cytobank.org/
Cytofkit v1.r.0Chen et al., 2016https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html
t-SNEvan der Maaten y Hinton, 2008https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html
anticuerpo Estabilizador CANDOR Bioscience Cat# 130050 Albúmina sérica bovina Sigma-Aldrich Cat# A4503 Cisplatino-194Pt Fluidigm Cat# 201194 eBioscience 1x Tampón de RBC

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
  2. Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26....

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