Presentamos un protocolo para estudiar la regulación de la traducción de mRNA en células infectadas por poxvirus usando el ensayo de reportero de luciferasa transcrito in vitro basado en ARN. El ensayo se puede utilizar para estudiar la regulación de la traducción por CIS-Elements de un mRNA, incluyendo 5 '-región no traducida (UTR) y 3 '-UTR. También se pueden examinar diferentes modos de iniciación de la traducción utilizando este método.
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Artículo de método
Ensayo in vitro transcrito luciferase Reporter basado en ARN para estudiar el Reglamento de traducción en las células infectadas por el poxvirus
En este artículo
Resumen
Resumen
Cada poxvirus mRNA transcrito después de la replicación del ADN viral tiene un líder de 5 '-Poly (A) evolutivamente conservado, no con plantilla en el 5 '-UTR. Para diseccionar el papel de 5 '-Poly (A) líder en la traducción de mRNA durante la infección por el poxvirus desarrollamos un ensayo in vitro transcrito basado en ARN de luciferasa. Este ensayo de reportero consta de cuatro pasos principales: (1) PCR para amplificar la plantilla de ADN para la transcripción in vitro; (2) transcripción in vitro para generar ARNm utilizando la polimerasa de T7 RNA; (3) transfección para introducir in vitro el mRNA transcrito en las células; (4) detección de la actividad luciferasa como indicador de la traducción. El ensayo de la reportera luciferasa basado en ARN descrito aquí elude los problemas de la replicación plásmia en las células infectadas por el poxvirus y la transcripción críptica del plásmido. Este protocolo se puede utilizar para determinar la regulación de la traducción por CIS-Elements en un mRNA que incluye 5 '-UTR y 3 '-UTR en sistemas que no sean células infectadas por el poxvirus. Por otra parte, diferentes modos de iniciación de la traducción como dependiente de la PAC, Cap-independiente, re-iniciación, y la iniciación interna se pueden investigar utilizando este método.
Introducción
Según el dogma central, la información genética fluye del ADN al ARN y finalmente a la proteína1,2. Este flujo de información genética está altamente regulado en muchos niveles, incluyendo la traducción de mRNA3,4. El desarrollo de ensayos de reportera para medir la regulación de la expresión génica facilitará la comprensión de los mecanismos regulatorios involucrados en este proceso. Aquí describimos un protocolo para estudiar la traducción de mRNA usando un ensayo in vitro transcrito basado en ARN de luciferasa en células infectadas con poxvirus.
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Protocolo
1. preparación de la plantilla de ADN por PCR para la transcripción in vitro
- Para preparar la plantilla de ADN mediante PCR, diseñe imprimadores. Al diseñar imprimaciones considerar características cruciales como la longitud de imprimación, temperatura de recocido (Tm), contenido GC, 3 ' end con G o C, etc.
Nota: Discutidos detalladamente en esta literatura25,26,27. - Diseño de imprimadores para generar amplicón PCR que contiene los siguientes elementos en la dirección 5 ' a 3 ': T7-Promoter, líder Poly (A), lu....
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Resultados
Los cuatro pasos del ensayo in vitro transcrito de la luciferasa basada en ARN: la PCR para generar una plantilla de ADN para la transcripción in vitro, la transcripción in vitro para generar ARNm, la transfección de mRNA y la medición de luciferasa, se pueden ver en el diagrama esquemático ( Figura 1). El diseño de imprimadores para ambas plantillas de ADN (FLUC y Rluc) y el esquema general de PCR de extensión de voladizo se ilustra en el esquema (
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Discusión
Todos los pasos de cuatro núcleos son fundamentales para el éxito del ensayo de reportero de luciferasa, basado en ARN transcrito in vitro. Se debe prestar especial atención al diseño de imprimación, especialmente para la secuencia de promotor T7. La polimerasa de T7 RNA comienza la transcripción de la primera G (gGG-5'-UTR-Aug-) subrayada en T7 promotor añadida antes de la secuencia 5 '-UTR. Aunque el sitio de inicio de la transcripción (TSS) comienza a partir de la primera G en el extremo 5 ', la disminución del.......
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Divulgaciones
A los autores no les gustaría declarar ningún interés financiero competidor.
Agradecimientos
El proyecto fue financiado por los institutos nacionales de la salud (AI128406 www.nih.gov) a la ZY y en parte por el centro de investigación del cáncer de Johnson (http://cancer.k-state.edu) en forma de postgrado estudiante verano Stipend a PD.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2X-Q5 Mezcla maestra | New England Biolabs | M0492 | ADN polimerasa de alta fidelidad utilizada en PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G Estructura de tapa de ARN análoga | New England Biolabs | S1411L | Tapa anti inversa analógica o ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area microplaca de poliestireno de fondo plano blanco | Corning | 3693 | Placa blanca de 96 pocillos con paredes opacas con fondo sólido |
| Sistema de ensayo reportero de luciferasa dual | Promega | E1960 | Kit de ensayo de luciferasa dual (DLAK) |
| E.Z.N.A. Kit puro | de ciclo OMEGA BIO-TEK | D6492 | Kit de purificación de PCR |
| GloMax Navigator Luminómetro de microplaca | Promega | GM2010 | Referido como luminómetro de lector de placas multimodo |
| HiScribe T7 Kit rápido de síntesis de ARN de alto rendimiento | New England Biolabs | E2050S | en Kit de transcripción in vitro |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 Reactivo de transfección de lípidos catiónicos | |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Se utiliza para medir la concentración de ADN y ARN |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medios de suero reducidos |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A Kit de | purificación de ARN |
| Sistema de tapado Vaccinia | taponado | M2080 | New England Biolabs |
Referencias
- Crick, F. H. On protein synthesis. Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).
- Crick, F. Central Dogma of Molecular Biology. Nature. 227, 561-563 (1970).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G.
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Reimpresiones y permisos
