Method Article

Aislamiento y cuantificación del virus del Zika de múltiples órganos en un ratón

DOI:

10.3791/59632

⸱

August 15th, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Saint Louis University, 2School of Veterinary Medicine University of California Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El objetivo del protocolo es demostrar las técnicas utilizadas para investigar la enfermedad viral aislándose y cuantificando el virus del Zika, a partir de múltiples órganos en un ratón después de la infección.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los métodos que se presentan demuestran procedimientos de laboratorio para el aislamiento de órganos de animales infectados por el virus del Zika y la cuantificación de la carga viral. El objetivo del procedimiento es cuantificar los lanzadores virales en áreas periféricas y del SNC del ratón en diferentes momentos posteriores a la infección o en diferentes condiciones experimentales para identificar factores virológicos e inmunológicos que regulan la infección por el virus del Zika. Los procedimientos de aislamiento de órganos demostrados permiten tanto la cuantificación del ensayo de formación de enfoque como la evaluación cuantitativa de la PCR de los lanzadores virales. Las técnicas de aislamiento rápido de órganos están diseñadas para la preservación del morte del virus. La cuantificación de los titer virales mediante el ensayo de formación de enfoque permite la evaluación rápida del rendimiento del virus del Zika. El beneficio del ensayo de formación de enfoque es la evaluación del virus infeccioso, la limitación de este ensayo es el potencial de toxicidad de órganos que reduce el límite de detección. La evaluación del titor viral se combina con un PCR cuantitativo, y el uso de un número de copia del genoma viral de control de ARN recombinante dentro del órgano se evalúa con un límite bajo de detección. En general, estas técnicas proporcionan un método preciso de alto rendimiento rápido para el análisis de los lanzadores virales del Zika en la periferia y el SNC de los animales infectados por el virus del Zika y se pueden aplicar a la evaluación de los tituladores virales en los órganos de los animales infectados con la mayoría de los animales infectados con la mayoría patógenos, incluido el virus del dengue.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El virus del Zika (ZIKV) es un arbovirus que pertenece a la familia flaviviridae, que incluye importantes patógenos humanos neuroinvasivos como el virus powassan (POWV), el virus de la encefalitis japonesa (VJE) y el virus del Nilo Occidental (WNV)1. Tras su aislamiento e identificación, se han notificado periódicamentelas infecciones humanas por el ZIKV en Africa y Asia 2,3,4,5, y epidemias en América Central y del Sur (revisado sin referencia6). Sin embargo, no fue hasta hace pocoque se pensaba que ZIKV causaba una enfermedad grave 7. Ahora hay miles de casos de enfermedades neurológicas y defectos congénitos relacionados con infecciones por ZIKV. La rápida aparición de ZIKV ha suscitado muchas preguntas relacionadas con: por qué hay un aumento en la gravedad de la enfermedad, cuál es la respuesta inmunológica a la infección por ZIKV y existen patologías virales y/o inmunes mediadas relacionadas con el aumento de la neurología manifestaciones y defectos congénitos. Ahora existe la prisa por entender la enfermedad relacionada con el sistema nervioso central (SNC) asociada con el ZIKV, así como la necesidad de probar rápidamente la eficacia de los antivirales y vacunas contra el ZIKV. Es en este contexto que hemos desarrollado métodos para el análisis rápido de los titulas ZIKV tanto en la periferia como en el SNC utilizando un enfoque específico de ZIKV (FFA).

Los modelos animales pequeños son importantes para comprender la progresión de la enfermedad y para la evaluación temprana de vacunas, terapias y antivirales. Hemos establecido pequeños modelos animales para el estudio de la enfermedad de arbovirus mediante el uso de varias cepas de ratón para modelar la infección humana y la protección contra patógenos virales8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Utilizando esta experiencia previa, comenzamos a modificar las técnicas utilizadas para la evaluación del virus WNV y del dengue, un flavivirus relacionado para la evaluación del titer ZIKV tanto en órganos periféricos como en el SNC21,23, 24. Las ventajas de estos métodos sobre otros ensayos son: 1) que combinen la capacidad de cosechar órganos periféricos y del SNC para el análisis; 2) los métodos son adaptables para la citometría de flujo, para mediciones de respuestas inmunitarias innatas y adaptativas, junto con tituladores virales en el mismo animal en el mismo órgano; 3) la técnica de cosecha es adaptable para el análisis histológico; 4) el ZIKV FFA es un método de alto rendimiento rápido para el análisis de titer viral; y 5) estos métodos pueden aplicarse a la evaluación de tituladores virales en los órganos de animales infectados con la mayoría de los patógenos25.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los procedimientos del presente estudio se ajustan a las directrices establecidas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de St. Louis. SLU está totalmente acreditada por la Asociación de Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International (AAALAC).

1. Aislamiento de órganos

NOTA: El virus no es estable a temperatura ambiente (RT), por lo que el número de animales cosechados a la vez debe planificarse cuidadosamente para preservar los lanzadores virales.

  1. Infectar ratones utilizando la dosis y la ruta elegidas, en función del fenotipo requerido. Para este protocolo, infectar 8-10 semanas de edad macho y hembra tipo I interferón receptor deficiente (Ifnar1-/-) C57BL/6 ratones.
    1. Anestetizar ifnar1-/- ratones con un cóctel de ketamina (90 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg). Pruebe el reflejo del pedal con un pellizco firme en el dedo del pecho para confirmar la anestesia. Administrar 1 x 105 unidades de formación de enfoque (FFU) de ZIKV en 50 s por vía subcutánea (SC) a través de la almohadilla.
  2. Preparar todos los materiales necesarios para la cosecha el día anterior: 2 tijeras, fórceps y 20 ml de etanol 70% (EtOH) en un cónica de 50 ml para la desinfección de herramientas.
    1. Preparar jeringas y agujas: una jeringa de 20 ml para perfusión, 23 G de agujas (aproximadamente 1 por jaula) y una jeringa de 1 ml con aguja de 25 G (1 por 3-5 ratón). Antes de pesar los tubos, agregue perlas de acero (en el capó) a los tubos de la tapa de tornillo de la coma de 1,5 ml (uno para cada órgano). Los tubos deben ser apropiados para la homogeneización.
  3. Preparar el día de la cosecha los materiales necesarios para la perfusión y la congelación de órganos.
    1. Llene un cubo de hielo con hielo seco y 70% EtOH para hacer un baño de hielo. Preparar solución salina tamponada de fosfato estéril (PBS) suponiendo que 25-30 mL por ratón de PBS para cada perfusión se necesita 5-10 mL para la médula espinal). Obtener anestesia, un cóctel de ketamina y Xylazine, y asumir 300 l por ratón. Coloque todos los materiales y cualquier tubo adicional necesario para la citometría de flujo, etc., en un contenedor secundario para transportarlos a las instalaciones de animales.
  4. Siga todos los procedimientos necesarios para la entrada, incluyendo el servicio de colocación y alimentación de equipos de protección personal durante la entrada y salida en las instalaciones de los animales.
    PRECAUCION: Todos los procedimientos se llevarán a cabo en un gabinete de bioseguridad certificado dentro de una instalación de laboratorio de nivel 2 de bioseguridad (BSL-2).
  5. Administrar anestesia, 200-500 l, intraperitonealmente dependiendo del tamaño y peso del animal. Si trabaja solo, administre anestesia a un animal a la vez para evitar matar a los animales antes de la cosecha de órganos.
    1. Confirme la dosis de anestesia pellizcando el dedo del dedo del día con fórceps para evaluar el reflejo del pedal. No continúe a menos que no responda por completo. Utilice pasadores para fijar el ratón a una tabla de cera. En este punto, douse el ratón en 70% etanol para evitar la contaminación del cabello en el procedimiento de extracción de órganos
  6. Sangrado terminal por punción cardíaca.
    1. Usando las tijeras y fórceps, abra al animal a través de la cavidad torácica para exponer el corazón. Recoger la sangre a través de la punción cardíaca (800 l), esto se puede utilizar para múltiples ensayos, incluyendo química clínica, hematología, citometría de flujo para detectar respuestas específicas de antígeno, y PCR cuantitativo en tiempo real (qRT-PCR) para el análisis del número de copia viral.
    2. Para el análisis de ARN viral por qRT-PCR, recoja la sangre en un tubo EDTA si se extrae de sangre entera o en un tubo de microcentrífuga si se extrae del suero. (Para suero, tubo de centrifugado a máxima velocidad en centrífuga, temperatura ambiente, durante 20 min y retire el suero a un tubo separado). Agregue una poliacrilamida lineal como portador a la muestra de suero después de terminar. El ARN se puede analizar o almacenar a -80 oC para seguir procesando en una fecha posterior.
  7. Llene la jeringa de 20 ml con PBS, a temperatura ambiente (o 37 oC), y perfumar ratones insertando la aguja de mariposa en el ventrículo izquierdo. Perfore la aurícula derecha para permitir la salida de sangre y PBS. Administrar lentamente el PBS mientras se comprueba el color del hígado para confirmar que el animal está completamente perfundido. El hígado debe cambiar de rojo intenso a color salmón rosa.
    1. Si prepara los órganos para la histología, deje la aguja de mariposa en su lugar y luego pertore con 20 ml de hielo frío 4% paraformaldehído. Si es así, es conveniente tener la jeringa conectada a un tapón de 3 vías con ambas jeringas conectadas a ella, encendiendo y apagando la válvula como alternativa entre PBS y PFA.
  8. Cosere los órganos en tubos etiquetados y pesados. Para los órganos periféricos, siga un orden establecido para la cosecha: hígado, bazo, riñón y pulmones.
    1. Tome sólo un lóbulo del hígado; no importa cuál, pero para todos los experimentos siempre tratan de tomar el mismo lóbulo con la misma pieza de tamaño. Del mismo modo, para los riñones y los pulmones, tome el mismo riñón y pulmón. Si también se debe completar la citometría de flujo, cualquier órgano se puede cortar por la mitad. Almacene la mitad que se utilizará para la citometría en el medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) a temperatura ambiente hasta que la cosecha esté completa.
    2. Inmediatamente después de la cosecha, coloque cada órgano en un tubo etiquetado y colóquelo en el baño de hielo seco. El ticter de virus se reduce con el tiempo a temperatura ambiente, por lo que la cantidad de tiempo que se tarda en cosechar órganos es extremadamente importante. Debe haber consistencia entre ratones, así que después de la seguridad, la siguiente prioridad es la velocidad.
      NOTA: Si la cosecha de órganos para títulos virales, es muy útil tener un segundo individuo cosechar el cerebro en este punto, para preservar títulos virales.
  9. Retire los órganos restantes de la cavidad del cuerpo del ratón para acceder a la columna vertebral y al cráneo.
    1. Retire el ratón de la tabla y retire la pelta, seguido de la extracción de los brazos y las piernas.
      Retire la cabeza del ratón con una tijera dedecapitación, contundente o quirúrgica para cosechar el cerebro cortando el cráneo con unatijera laGrange serrada a través del foramen magnum. Luego, despega el cráneo con fórceps y saca el cerebro con una espátula.
    2. Usando tijeras fuertes y contundentes, retire las costillas y otros huesos que rodean la columna vertebral. Luego, corta el hueso pélvico, exponiendo el foramen vertebral a nivel lumbar. La pequeña punta de la médula espinal debe ser visible en este punto.
    3. Utilice una jeringa de 10 ml llena de PBS y una aguja de 18 G para expulsar la médula espinal "lavando" el cordón de la columna lumbar a la columna cervical sobre una placa Petri.
    4. Con cuidado, coloque la punta biselada de la aguja dentro del foramen vertebral, evitando una presión excesiva para evitar que la aguja invada el cuerpo vertebral. Sostenga fuertemente para ejercer presión sobre el cuerpo vertebral y la aguja y presione el émbolo de la jeringa para expulsar el cordón. Transfiera inmediatamente la médula espinal en el tubo etiquetado y colóquela en el baño de hielo seco.
  10. Repita el procedimiento con todos los animales hasta que se complete la cosecha. Coloque las herramientas de cosecha en el 70% de etanol entre animales. Concéntrese en la consistencia y la velocidad. El tiempo entre cada cosecha de órganos debe permanecer constante para no sesgar los resultados virales del tareado.
  11. Cuando haya terminado, desinfecte el armario de bioseguridad y todo el material antes de retirarlo de las instalaciones para animales.
  12. Retire cada tubo del baño de hielo y pese los tubos para determinar el peso de los órganos. Para determinar el peso de los órganos, reste el peso del tubo vacío del peso del tubo que contiene el órgano.
    NOTA: En este punto, los órganos se pueden congelar a -80 oC para seguir procesando en una fecha posterior o los órganos pueden homogeneizarse inmediatamente antes de congelar alícuotas individuales. Congelar muestras de descongelación varias veces disminuye el titer viral. Por lo tanto, es importante realizar el mismo procedimiento para todos los experimentos dentro de un solo proyecto.

2. Homogeneización de órganos

  1. Prepare 3 tubos de 1,5 ml etiquetados y con tapa rápida para cada órgano que se homogeneice.
  2. Si las muestras no se están homogeneiparando inmediatamente después de la cosecha, retire los tubos de -80 oC. No es necesario descongelar las muestras para homogeneizarlas.
  3. Ponga las muestras en hielo para mantenerlas frías para minimizar la pérdida viral del diezmo. A continuación, agregue 1 ml de DMEM frío que contenga 5% DE FBS a cada tubo que contenga órgano.
  4. Batir inmediatamente los tubos en el batidor de cuentas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Homogeneizar todos los órganos con cuentas de acero en un instrumento homogeneizador de cuentas. Compruebe que cada órgano se ha homogeneizado por completo.
  5. Esgire los restos de órganos en microfúctelos a 12.000 x g durante 5 minutos en un microfúgelo que se haya enfriado a 8 oC. A continuación, vuelva los tubos al cubo de hielo. En el gabinete de bioseguridad, la alícuota toma muestras en tubos para los ensayos necesarios. A continuación, vuelva los tubos al cubo de hielo.
  6. Para el ensayo de formación de enfoque, alícuota 500 l en un tubo etiquetado. A continuación, coloque los tubos en el estante en un cubo de hielo. Aliquot 50 l en un tubo de ARN para RT-PCR cuantitativo fluorogénico (qRT-PCR) para medir el número de copia del genoma viral.
  7. Aísle el ARN total de los órganos de los animales infectados utilizando un kit de aislamiento de ARN comercial. Determinar el ARN viral flavivirus utilizando los conjuntos de sondas de imprimación específicos para ZIKV, que reconoce secuencias únicas en cada genoma flavivirus. Determine el número de copia viral utilizando un plásmido de control de copia que contenga un ARN de una sola cadena positivo definido generado in vitro utilizando la polimerasa T7 que contenga las secuencias diana ziKV.
  8. Alícuota la muestra restante, que es de aproximadamente 300 ol, en el tercer tubo y almacenar a -80 oC si es necesario.
    NOTA: Si las muestras no se congelaron previamente, congele a -80 oC. Si las muestras se habían congelado previamente, continúe con el ensayo de formación de enfoque y/o el aislamiento de ARN antes de detenerse.

3. Ensayo de formación de enfoque del virus del Zika26

NOTA: Es importante incluir un control sin virus y un control positivo. El control positivo es una serie de dilución de un stock de virus con una concentración conocida. No todos los controles deben estar en la misma placa, pero a medida que el ensayo se hace más grande que 5 placas, se deben agregar más controles y extenderse entre las placas. Tenga cuidado de no rayar la monocapa con las puntas de pipeta o mediante un lavado vigoroso. Múltiples órganos pueden ser mareados en el mismo día o en días diferentes. Pero un órgano individual no debe ser titered durante varios días porque diferentes condiciones de ensayo pueden afectar el título viral. Se recomienda encarecidamente ejecutar un órgano individual en un solo día.

  1. Antes del día del ensayo, prepare las células y los reactivos necesarios para el ensayo de formación de enfoque.
    1. Preparar medios de crecimiento que contengan 500 mL de DMEM con 5 mL de HEPES y 25 mL de FBS. Tener células de la Organización Mundial de la Salud (OMS) que crecen en medios de crecimiento a 37 oC, 5% co2 antes del inicio del ensayo. Las células de Vero no deben ser un pasaje alto o haber crecido más del 100% de confluencia antes del inicio del ensayo.
    2. Preparar 500 ml de una solución de metilcelulosa al 2% autoclavendo una botella de medios de vidrio de 1 L con 10 g de metilcelulosa y una barra de agitación grande y una botella de medio de vidrio separada de 1 L con 500 ml de H2O. Si el agua autoclave se ha enfriado, recalienta el microondas hasta que la botella esté caliente al tacto, pero no hirviendo.
    3. Vierta suavemente agua caliente/caliente en una botella de metilcelulosa mientras esté en la campana de cultivo de tejido. Cubra parcialmente el frasco y revuelva la placa caliente hasta que la metilcelulosa esté en solución (1-4 h). Alícuota la solución de metilcelulosa al 2% en tubo cónico estéril de 50 ml. 2% La metilcelulosa se puede almacenar a 4 oC hasta que sea necesario.
    4. Preparar una solución de Paraformaldehído al 5% en PBS para fijar las placas y almacenarlas a 4 oC hasta que sea necesario. Preparar un búfer de lavado de ensayo de conformado de enfoque 1x agregando 0.05% Triton X-100 a PBS y almacenado en RT. Preparar un tampón de tinción ffA 1x agregando 1 mg/ml de saponina a PBS y almacenado a 4 oC hasta que sea necesario. Estos se pueden preparar con una o dos semanas de antelación.
  2. Calcular el número de placas de 96 pozos de fondo plano necesarias para el ensayo de tal manera que cada órgano esté chapado en triplicado. Incluya suficientes pozos adicionales para los controles positivos y negativos.
    1. Crece suficientes células Vero en medios de crecimiento para completar el ensayo diseñado. Intente probar las células de Vero y contarlas resuspendingelas a 1.5 x 105 células por ml en medios de crecimiento. Células de Plate Vero en las 96 placas de fondo plano de pozo a 3.0 x 104 células Vero-OMS/bien en medios de crecimiento mediante la adición de 200 ol por pozo.
    2. Incubar placas a 37oC a 5% de CO2 durante la noche, asegúrese de que las placas estén niveladas en la incubadora para que las células se distribuyan equitativamente dentro del pozo.
      NOTA: Cada laboratorio cultiva células Vero ligeramente diferente; el objetivo es una monocapa confluente del 90-95% en cada pocil el día del ensayo para el virus del Zika.
  3. Diluir las muestras del virus del Zika el día del ensayo. Si las muestras de órganos habían sido homogeneizadas previamente, retire las muestras del congelador de -80 oC y permita que se descongelen antes de colocar las muestras en hielo para el ensayo.
    1. Sobre hielo, prepare una placa de 96 pozos de fondo redondo añadiendo 180 ml de medios de crecimiento en frío a las filas B a H dejando la fila A vacía. Agregue 150 l de cada muestra de órgano homogeneizado a la fila A de la placa inferior redonda.
    2. Preparar diluciones seriales de 10 veces de cada muestra, utilizando una pipeta multicanal. Diluir las muestras en una placa de pozo de fondo redondo 96 añadiendo 20 ml de muestra en 180 ml de medios de crecimiento, cambiando las puntas de la pipeta entre cada dilución.
  4. Prepare la placa de formación de enfoque quitando el medio de la placa de 96 pocillos de fondo plano que cubre las células de Vero. Haga esto inmediatamente antes de agregar las muestras de virus para evitar que la monocapa se seque.
    1. Añadir 100 l de dilución del virus a cada pocal en la placa Vero. Agregue la muestra usando el mismo conjunto de puntas yendo de la concentración más baja a la más alta. Placas de roca de lado a lado 2-4 veces teniendo cuidado de no girar.
    2. Incubar a 37oC, 5% CO2 durante 1-2 h. Asegúrese de que las placas estén niveladas dentro de la incubadora. Durante la incubación se calienta un 2% de metilcelulosa a RT.
    3. Diluir 2% solución de metilcelulosa en medios de crecimiento. La dilución debe ser de aproximadamente 2:1 de 2:1 de metilcelulosa al crecimiento de los medios. Manténgalo a temperatura de la habitación hasta que sea el momento de usarlo. Añadir 1-2 gotas/bien (establecer la pipeta a 125 ol) de la metilcelulosa: medios de crecimiento a cada pocal de la placa de 96 pocillos.
    4. Incubar 32-40 h a 37oC, 5%CO2. A medida que las células Deo de todos crecen de manera ligeramente diferente y factores como la confluencia celular y la tensión del virus del Zika pueden cambiar el tiempo de incubación.
  5. Corrija las células de Vero utilizando la solución preparada de paraformaldehído al 5%.
    1. Añadir 50 sl de 5% de paraformaldehído a cada pozo sobre la parte superior de la capa de metilcelulosa en el gabinete de bioseguridad. Incubar durante 60 min a RT. La fijación puede pasar la noche a 4 oC, pero cubrir la placa con parafilm para reducir la evaporación.
    2. Vuelque la superposición y los medios de las células en un contenedor de eliminación dentro del gabinete de bioseguridad. Lavar suavemente con PBS, 150 l/bien. Retire el PBS de las placas y retire la placa del BSL-2.
    3. Repita el lavado PBS 2x añadiendo 150 l/bien. A continuación, quite el PBS. Agregue 150 l/bien 1x tampón de lavado FFA y deje sentarse durante 5-10 minutos en RT para permeabilizar las células fijas.
  6. Detectar la infección con anticuerpos primarios contra el zika. Preparar el anticuerpo primario 4G2 (D1-4G2-4-15) a una concentración de 1 mg/ml en tampón de tinción FFA. Preparar suficiente anticuerpo para todo el ensayo.
    NOTA: Manténgase alejado de los pañales de laboratorio u otro material absorbente de alta pelusa, ya que las fibras afectarán negativamente la imagen de los focos.
    1. Retire el tampón de lavado FFA de las placas. Añadir 50 l/bien del anticuerpo primario en el tampón de tinción FFA. Sellar las placas con parafilm e incubar durante la noche a 4oC en una plataforma de balanceo. El ensayo se puede hacer con una incubación durante 2 h a RT.
  7. Visualice la infección mediante la adición de un anticuerpo conjugado HRP secundario. Prepare el anticuerpo secundario con la etiqueta HRP de Cabra a una concentración de 1:5.000 en tampón de tinción FFA. Preparar suficiente anticuerpo para todo el ensayo.
    1. Lave las células 3 veces con el tampón de lavado FFA, eliminando el tampón de lavado entrando en el fregadero cada vez. Manchar las células con el anticuerpo secundario en el tampón de tinción FFA a 50 l/bien. Incubar 1-2 h en RT.
    2. Lave las células 3 veces con el tampón de lavado FFA, eliminando el tampón de lavado entrando en el fregadero cada vez. Añadir 50 l/bien del sustrato Trueblue.
    3. Observe las placas cuidadosamente, esperando 2-15 minutos hasta que las manchas estén completamente definidas y un fondo mínimo. Después de que las manchas sean visibles, lave suavemente con agua, usando una mano para proteger a la monocapa de la fuerza del agua que corre. Toque secar en toallas de papel (NO DIAPERS) e imagen tan pronto como sea posible.
    4. Las manchas se pueden contar manualmente o mediante un contador de puntos automatizado. Si se cuenta manualmente, se puede utilizar un ámbito de diseción para ayudar en la visualización.
    5. Para cada muestra, seleccione una dilución con focos fácilmente distinguidos (por ejemplo, 20 a 200 por pozo) y calcule el diezmo en unidades formadoras de enfoque por ml (FFU/ml), utilizando el promedio de pozos duplicados: FFU/ml (focos medios/pozos) (factor de dilución) (inóculo de ml).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para evaluar los lanzadores ziKV utilizando el protocolo descrito anteriormente Ifnar1-/- ratones se infectaron con ZIKV (PRVABC59) mediante inyección subcutánea (SC) en la almohadilla del pie. Aquí, la administración de 1 x 105 FFU de ZIKV a 8-12 semanas de edad Ifnar1-/- ratones SC no es letal, pero el virus puede replicarse tanto en la periferia como en el SNC. Esta dosis y ruta se utilizan para estudiar las respuestas inmunitarias de...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Por lo tanto, la infección por ZIKV puede causar una enfermedad neurológica, por lo que los modelos animales actuales para estudiar la patogénesis, las respuestas inmunitarias y la eficacia protectora de las vacunas y los antivirales deben centrarse en el control viral dentro del SNC. Uno de los desafíos para centrarse en la enfermedad del SNC es que a menudo viene a expensas de estudiar la infección periférica. Los métodos de aislamiento de órganos propuestos aquí se centran en la necesidad de evaluar rápidamente la inf...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El Dr. Pinto es financiado por una beca de semilla de la Escuela de Medicina de la Universidad de Saint Louis y fondos de startups de la Escuela de Medicina de la Universidad de Saint Louis. El Dr. Brien es financiado por un premio K22AI104794 de investigador temprano de la NIH NIAID, así como una beca de semilla de la Escuela de la Universidad de Saint Louis. Para todas las personas financiadas, los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-bromo-3-cloropropano (BCP)MRC genBP151
Jeringa de 10 ccThermo FisherScientific BD 309642
aguja de 18 gThermo Fisher Scientific22-557-145
Jeringa TB de 1 ccThermo Fisher Scientific14-823-16H
Jeringa de 20 ccThermo Fisher Scientific05-561-66
Molino de bolas de 24 tubosThermo Fisher Scientific15 340 163
perlas de acero inoxidable de 3,2 mmThermo Fisher ScientificNC9084634
37 ° C Incubadora de cultivo de tejidosNuair5800
4G2 anticuerpoen casa
Placas de fondo plano de 96 pocillosMidsciTP92696
Placas de fondo redondo de 96 pocillosMidsciTP92697
Basix 1,5 mL Tubos EppendorfThermo Fisher Scientific02-682-002
Grapas concentradas de lejía germicida30966CT
CTL S6 Analizador CTLCTL S6 Analizador
Tijeras de corte curvasFine Science Tools14061-11
Dulbecco' s Águila Modificada' s Glucosa media-alta Con 4.500 mg/L de glucosaMilliporeSigmaD5671
Etanol (grado de biología molecular)MilliporeSigmae7023
Suero fetal bovinoMilliporeSigmaF0926-500ML
PinzasFine Science Tools11036-20
Ácido acético glacialMilliporeSigma537020
Cabra anti-ratón anti-HRP anticuerpo marcado con HRPMilliporeSigma8924
HEPES 1 MMilliporeSigmaH3537-100ML
Isopropanol (grado de biología molecular)MilliporeSigmaI9516
Cóctel de ketamina/xilacinaMedicina comparativa
L-glutaminaMilliporeSigmag7513
Magmax RNA kit de purificaciónThermo Fisher ScientificAM1830
MetilcelulosaMilliporeSigmaM0512
MicrocentrífugaEpendorf5424R
MiniCollect 0,5 mL Tubos EDTABio-one450480
Tubos de junta tóricaThermo Fisher Scientific21-403-195
Un paso q Mezcla RT-PCRThermo Fisher Scientific4392938
ParaformaldehídoThermo Fisher ScientificEMS- 15713-S
Solución salina tamponada con fosfatoMilliporeSigmad8537-500ml
Pipetas multicanal ProlineSartorius72230/72240
Pipetas monocanal ProlineSartorius728230
Agua libre de ARNasaThermo Fisher Scientific10-977-023
RNAzol BDMRC genRB192
Plataforma oscilanteThermo Fisher Scientific11-676-333
RPMI 1640FisherMT10040CV
SaponinaMilliporeSigmas7900
Cuchara/espátulaFine Science Tools10090-17
Recto tijeras de corteFine Science Tools14060-11
Triton X-100MilliporeSigmat8787
True Blue SubstrateVWR95059-168
TripsinaMilliporeSigmaT3924-100ML
universal

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
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