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Artículo de método

Evaluación del microambiente tumoral de la permeabilidad vascular mediada por la puerta de la puerta asociada con la diseminación de células cancerosas mediante imágenes intravitales y análisis de tejido fijo

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DOI:

10.3791/59633

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26 de junio de 2019

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1Department of Anatomy and Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, 3Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery, Montefiore Medical Center, 5Department of Pathology, Montefiore Medical Center

En este artículo

Resumen

Describimos dos métodos para evaluar la permeabilidad vascular transitoria asociada con el microambiente tumoral de la función de la puerta de metástasis (TMEM) y la intravasación de células cancerosas mediante inyección intravenosa de dextran de alto peso molecular (155 kDa) en ratones. Los métodos incluyen imágenes intravitales en animales vivos y análisis de tejido fijo utilizando inmunofluorescencia.

Resumen

La causa más común de mortalidad relacionada con el cáncer es la metástasis, un proceso que requiere la diseminación de las células cancerosas del tumor primario a los sitios secundarios. Recientemente, establecimos que la diseminación de células cancerosas en el cáncer de mama primario y en los sitios metastásicos en el pulmón ocurre sólo en las puertas llamadas Microambiente Tumoral de Metástasis (TMEM). El número de puerta tmEM es pronóstico para la recurrencia distante de la enfermedad metastásica en pacientes con cáncer de mama. Las puertas TMEM están compuestas por una célula cancerosa que expresa excesivamente la proteína reguladora de la actina Mena en contacto directo con un macrófago perivascular y proangiogénico que expresa altos niveles de TIE2 y VEGF, donde ambas células están estrechamente unidas a una sangre recipiente endotelial. Las células cancerosas pueden entrar en travas a través de las puertas de TMEM debido a la permeabilidad vascular transitoria orquestada por la actividad articular del macrófago asociado a TMEM y la célula cancerosa mena-expressing asociada a TMEM. En este manuscrito, describimos dos métodos para la evaluación de la permeabilidad vascular transitoria mediada por TMEM: imágenes intravitales e inmunofluorescencia de tejido fijo. Aunque ambos métodos tienen sus ventajas y desventajas, la combinación de los dos puede proporcionar los análisis más completos de la permeabilidad vascular mediada por TMEM, así como los requisitos previos microambientales para la función TMEM. Dado que el proceso metastásico en el cáncer de mama, y posiblemente otros tipos de cáncer, implica la diseminación de células cancerosas a través de las puertas TMEM, es esencial emplear métodos bien establecidos para el análisis de la actividad de las puertas TMEM. Los dos métodos descritos aquí proporcionan un enfoque integral para el análisis de la actividad de las puertas de TMEM, ya sea en animales ingenuos o tratados farmacológicamente, lo cual es de suma importancia para los ensayos preclínicos de agentes que previenen las células cancerosas difusión a través de TMEM.

Introducción

Los avances recientes en nuestra comprensión de la metástasis oncológica han descubierto que la transición epitelial a mesenquimal (EMT) y la inducción de una subpoblación migratoria/invasiva de células cancerosas no son, por sí solas, suficientes para la diseminación hematogena 1. De hecho, anteriormente se pensaba que la metástasis de las células cancerosas se intravasa a través de la totalidad del endotelio asociado al cáncer, ya que la neovasculatura tumoral se caracteriza a menudo por una baja cobertura de pericita, y como tal, es altamente permeable y inestables2,3,4. Aunque son altamente sugestivas de funciones defectuosas dentro del tumor, las modificaciones vasculares durante la carcinogénesis no proporcionan evidencia según el se de que las células tumorales pueden penetrar los vasos sanguíneos fácilmente y de manera incontrolada. Las estadísticas de los estudios de imágenes intravitales (IVI), en los que las células tumorales están etiquetadas fluorescentemente y la vasculatura se etiqueta mediante la inyección intravenosa de sondas fluorescentes (como dextran o puntos cuánticos), muestran que, mientras que los vasos tumorales son uniformemente permeable a bajo peso molecular dextrans (por ejemplo, 70 kD), dextrans de alto peso molecular (155 kD) y células tumorales pueden cruzar el endotelio sólo en sitios especializados de intravasión que se encuentran preferentemente en el puntoderama vascular5, 6 , 7. Los análisis inmunohistoquímicos (IHC) utilizando modelos animales y material humano derivado del paciente han demostrado que estos sitios son "puertas" que se especializan en regular la permeabilidad vascular, local y transitoriamente, proporcionando una breve ventana de oportunidad de que las células cancerosas migratorias/invasivas entren en la circulación. Estas puertas se denominan "Microambiente tumoral de metástasis" o "TMEM", y, muy esperadamente, su densidad se correlaciona con un mayor riesgo de desarrollar enfermedad metastásica en pacientes con cáncer de mama8,9, 10.

Cada puerta TMEM consta de tres tipos distintos de células: un macrofaje perivascular, una célula tumoral que expresa excesivamente la proteína reguladora de actina mamífero habilitado (Mena), y una célula endotelial, todas en contacto físico directo entre sí1, 5,9,10,11,12,13. El evento clave para la función de TMEM como puerta de intravasión es la liberación localizada del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en el vaso subyacente por el macroófago perivascular14. EL VEGF puede interrumpir las unión homotípica entre las células endoteliales15,16,17,18,19, un fenómeno que resulta en fugas vasculares transitorias, también conocida como permeabilidad "ráfaga" como se describe en los estudios IVI 5. Se ha demostrado que los macrófagos TMEM expresan el receptor de tirosina quinasa TIE2, que es necesario parala función TMEM mediada por VEGF y el acceso a estos macrófagos al nicho perivascular 5,20,21 , 22. Además de regular la diseminación y metástasis de las células cancerosas, se ha demostrado que los macrofagos TIE2+ son reguladores centrales de la angiogénesis tumoral21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. Como tal, los macrófagos TIE2+ representan un componente crítico del microambiente tumoral y el principal regulador de la cascada metastásica.

Para conceptualizar mejor la permeabilidad vascular mediada por TMEM (es decir, "bursting"), es muy importante distinguirla de otros modos de permeabilidad vascular que no están asociados con la disolución de las uniones celulares endoteliales. En un endotelio intacto (uno cuyas uniones apretadas y adheridas no se interrumpen), hay tres tipos principales de permeabilidad vascular: a) la pinocitosis, que puede, o no, acoplarse a la transcitosis del material ingerido; (b) transporte de material a través de fenestras endoteliales; y c) transporte de material a través de la vía paracelular, que está regulada por cruces herméticas endoteliales15,16,17,18,19,32 , 33 , 34. Aunque desregulados en muchos tumores, los modos antes mencionados de permeabilidad vascular se han descrito principalmente en el contexto de la fisiología normal del tejido y la homeostasis, cuyos extremos son tejidos con permeabilidad limitada ( por ejemplo, barrera hematoencefálica, barrera hematoencefálica) o permeabilidad abundante (p. ej., capilares fenestrados del aparato glomerular renal)34,35,36,37.

Utilizando imágenes intravitales multifotonas y microscopía de inmunofluorescencia multiplexada, somos capaces de distinguir entre la permeabilidad vascular mediada por TMEM ("ráfaga") y otros modos de permeabilidad vascular en tumores mamarios. Para lograresto, realizamos una sola inyección intravenosa de una sonda de alto peso molecular, etiqueta fluorescentemente en ratones. Los eventos de ráfaga espontánea pueden ser capturados usando imágenes intravitales en ratones vivos; o alternativamente, la extravasación de la sonda se puede cuantificar mediante estudios de colocalización con vasculatura de sangre (por ejemplo, CD31+ o Endomucin+) y puertas TMEM mediante microscopía de inmunofluorescencia. Los protocolos presentados aquí describen ambas técnicas, que podrían utilizarse de forma independiente o conjunta entre sí.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales vivos deben llevarse a cabo de acuerdo con las pautas y regulaciones de uso y cuidado de los animales. Los procedimientos descritos en este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con las regulaciones de los Institutos Nacionales de Salud sobre el cuidado y uso de animales experimentales y con la aprobación del Albert Einstein College of Medicine Animal Care and Use (IACUC).

1. Evaluación de la "permeabilidad de ráfaga" utilizando imágenes de animales vivos

  1. Trasplante de tumores de mama singéricos en huéspedes de ratón con macrófagos fluorescentes
    1. Generar trozos de tejido tumoral adecuados para el trasplante.
      1. Generar tumores etiquetados fluorescentes en modelos de cáncer mamario de ratón cruzando los ratones espontáneos, autóctonos y genéticamente diseñados modelo de cáncer de mamario de ratón MMTV-PyMT con ratones transgénicos que expresan a los reporteros fluorescentes38, 39 [por ejemplo, proteína fluorescente verde mejorada (EGFP), proteína fluorescente cian mejorada (ECFP) o Dendra2].
      2. Permita que los ratones MMTV-PyMT con tumores etiquetados fluorescentemente crezcan hasta un tamaño no superior a 2 cm (aproximadamente 10-12 semanas de edad).
      3. Eutanasia el tumor con ratones MMTV-PyMT colocándolos en una cámara con 5% de isoflurano hasta 30 segundos después de que todas las respiraciones se detengan.
      4. Realizar una luxación cervical.
      5. Retire el cabello del abdomen del ratón eutanasiado con una crema depilatoria tópica.
      6. Coloque un plato DePetr con el medio de cultivo celular DMEM/F12 sobre hielo.
      7. Coloque el ratón y el plato de Petri sobre hielo en la campana de humos.
      8. Desinfecte el abdomen del ratón con un 70% de alcohol etílico.
      9. Usando guantes estériles y herramientas quirúrgicas (tijeras esterilizadas, fórceps y cuchilla) reextra los tumores y colócalos en la placa Petri.
      10. Cortar el tumor en trozos pequeños (2 mm x 2 mm x 2 mm de tamaño), descartando cualquier porción necrótica, mientras están en el plato Petri.
    2. Trasplantar las piezas tumorales en huéspedes receptores.
      1. Criar ratones con macrófagos genéticamente etiquetados fluorescentemente, por ejemplo, MacGreen40 o MacBlue 41 ratones (Csf1r-GAL4VP16/UAS-ECFP)
      2. Permita que los ratones FVB con macrófagos etiquetados fluorescentemente crezcan hasta una edad de 4-6 semanas).
      3. Anestetizar a los ratones FVB con macrófagos etiquetados fluorescentemente en una cámara utilizando 5% de isoflurano con oxígeno como gas portador.
      4. Reduzca la anestesia a isoflurano del 3 % y aplique pomada oftálmica en los ojos del ratón para evitar el secado.
      5. Retire el vello de la glándula mamaria 4 del ratón.
      6. Limpie la piel con betadina. Es importante mantener las condiciones estériles durante el resto del procedimiento. Esto incluye el uso de instrumentos esterilizados y reactivos.
      7. Haga una pequeña incisión de 2-3 mm inferior al pezón 4.
      8. Disecciona hasta que la almohadilla de grasa mamaria esté expuesta.
      9. Tome una pieza tumoral de la placa Petri y cubra en matriz extracelular artificial.
      10. Trasplante de tumores debajo de la almohadilla de grasa mamaria 4.
      11. Cierre la incisión con adhesivo de cianoacrilato.
      12. Monitoree continuamente al animal hasta que se recupere completamente de la anestesia y sea capaz de mantener la recumbencia esternal. Además, no devuelva el animal a la compañía de otros animales hasta su plena recuperación.
      13. Para minimizar las infecciones, agregue 1 ml de 100 mg/ml de antibiótico de enrofloxacina a la botella de agua potable del animal (8 fl oz).
      14. Permita que los tumores crezcan hasta que se palpan (5 mm; 4 semanas).
      15. Dependiendo del experimento, asigne los ratones en grupos de tratamiento y realice los tratamientos correspondientes, si corresponde.
  2. Configuración para imágenes intravitales
    1. Encienda el láser de dos fotones y los detectores del microscopio.
    2. Encienda la caja de calentamiento y precaliente la etapa x-y del microscopio.
    3. Coloque la plaquita de etapa a medida42 en la etapa x-y.
  3. Preparación de la ventana de imágenes
    1. Antes de configurar la creación de imágenes, autoclave el marco de la ventana de imágenes circulares a medida42.
    2. Utilice una pipeta o una jeringa de insulina para colocar una fina capa de adhesivo de cianoacrilato en el marco de la ventana y colocar en su lugar un vidrio de cubierta circular de 8 mm.
      NOTA: 1) Es importante evitar obtener residuos en la abertura transparente del cristal de la cubierta. 2) Es importante adherir el cristal de la cubierta al marco de la ventana al menos 1 h antes de su uso para la toma de imágenes.
    3. Limpie cuidadosamente cualquier exceso de cianoacrilato en la abertura transparente del vidrio de la cubierta con una toallita de laboratorio humedecida con una pequeña cantidad de acetona.
  4. Preparación del catéter de vena de cola para la administración de líquidos y colorantes fluorescentes durante la toma de imágenes
    1. Corte una pieza de 30 cm de tubo de polietileno para construir un catéter de vena de cola.
    2. Separe la parte de la aguja de una aguja de 30 G de su cónico Luer doblando suavemente la aguja hacia adelante y hacia atrás hasta que se rompa.
      NOTA: La aguja debe mantenerse cerca del cónico Luer y no de la punta de la aguja. Esto se puede realizar con alicates o fórceps para agarrar la aguja con el fin de evitar lesiones en el pinchazo de la aguja.
    3. Inserte el extremo romo de la aguja en un extremo del tubo de polietileno.
    4. Inserte el extremo afilado de otra aguja de 30 G, manteniendo su cono Luer unido, en el extremo opuesto del tubo.
    5. Llene una jeringa de 1 cc con solución salina tamponada de fosfato, adjúntela al cónico Luer del catéter montado y enjuague el catéter de la vena de cola asegurándose de que no haya burbujas de aire en el sistema.
    6. Para el etiquetado vascular, llene una jeringa de 1 cc con 100 ml de 10 mg/kg 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine (TMR) o puntos cuánticos.
  5. Preparación del ratón para la toma de imágenes
    1. Anestetizar el ratón en una jaula por debajo (1 pie por debajo) de una lámpara de calor usando 4%-5% de isoflurano mezclado con 100% de oxígeno establecido a un flujo de 1,5-2 L por minuto.
    2. Encienda la lámpara de calor sobre el área de trabajo quirúrgica. Este paso es fundamental para mantener la temperatura corporal fisiológica central del ratón durante la cirugía.
    3. Coloque el ratón debajo de la lámpara de calor y baje la anestesia a 2%-3% durante la duración de la cirugía.
      NOTA: Asegúrese de mantener la lámpara de calor a una distancia segura (1 pie) lejos del ratón para evitar el sobrecalentamiento.
    4. Coloque un pomada oftálmica en los ojos del ratón para evitar el secado de los ojos y la ceguera.
    5. Compruebe que el ratón está anestesiado realizando una prueba de pellizco de dedo del pie. Si el animal se retira, aumentar la dosis de isoflurano por 1% y volver a probar en 1-2 min.
    6. Inserte el catéter de la vena de cola en el punto más distal de la cola posible.
    7. Fije el catéter de la vena de cola a la cola con un pequeño trozo de cinta adhesiva de laboratorio que se envuelve alrededor de la cola y se pega a la aguja para asegurarse de que no se desaloja.
    8. Inyectar 50 ml por h de PBS a través del catéter de la vena de la cola para proporcionar una hidratación adecuada. Es fundamental evitar inyectar demasiado líquido (no más de 200 ol por h) o cualquier burbuja en el catéter, ya que esto puede ser fatal para el ratón.
    9. Retire el vello en el abdomen sobre las glándulas mamarias 4 y 5 usando crema depilatoria.
    10. Limpie la piel con betadina y deje que la piel se seque.
    11. Hacer una incisión longitudinal de línea media que comience inmediatamente superior a los genitales y llevar la incisión hasta el nivel del aspecto superior de la glándula mamaria 4.
    12. Lleve la incisión transversal al aspecto superior de la glándula mamaria 4. Es fundamental evitar comprometer el suministro de sangre en este punto.
    13. Disecciona la almohadilla de grasa mamaria del peritoneo creando un colgajo de tejido usando fórceps estériles y tijeras.
      NOTA: Las imágenes de colgajos de piel son susceptibles a artefactos de movimiento significativos y deshidratación tisular. Estos se evitan, como se describió anteriormente43,44, mediante la colocación de una pieza rígida de goma detrás del lado de la piel de la solapa (para endurecer el tejido blando y aislarlo del resto del cuerpo) y luego colocar el tumor en una imagen poco profunda ventana para preservar la hidratación. Esto es fundamental para la toma de imágenes estables, ya que el tumor y el tejido circundante en este entorno son muy compatibles.
    14. Estabilice la solapa de la piel afiserando (con pegamento de cianoacrilato) una pequeña pieza de goma rígida que mide 2 cm x 2 cm al lado de la piel de la solapa. El tumor debe estar en el centro de la zona siendo estabilizada por el caucho.
    15. Mantenga el tejido expuesto hidratado con gotas de PBS.
    16. Aplique una pequeña película de cianoacrilato en el borde exterior del marco de la ventana de imagen hecha a medida.
    17. Aplique una pequeña gota de PBS (-10–20 l) en el centro del cristal de la cubierta.
    18. Seque el tejido de la solapa circundante con una toallita de laboratorio. Es fundamental asegurarse de que el cianoacrilato en el marco de la ventana no entre en contacto con el PBS en el vidrio, ya que esto puede hacer que el cianoacrilato se polimerice y se ajuste prematuramente.
    19. Fije la pequeña ventana de diagnóstico por imágenes al colgajo de tejido con el tumor en el centro de la abertura clara.
    20. Retire la caja de calentamiento del escenario.
    21. Transfiera el ratón anestesiado y el catéter de la vena trasera a la etapa del microscopio. Tenga mucho cuidado para asegurarse de que el catéter de la vena de la cola no se caiga.
    22. Coloque el ratón sobre el escenario en la posición propensa.
    23. Coloque el cono nasal de isoflurano sobre el hocico para asegurar el mantenimiento de la anestesia.
    24. Inserte la ventana en el agujero de la placa de escenario x-y personalizada.
    25. Vuelva a colocar la caja de calentamiento en el escenario para mantener una temperatura fisiológica.
    26. Supervise los signos vitales del animal conectando una sonda de oxímetro de pulso a través del sensor de clip a la pata posterior.
    27. Disminuir lentamente el isoflurano a 0.5%-1% para mantener un flujo sanguíneo adecuado y evitar el exceso de anestesia del ratón.
  6. Imágenes intravitales
    NOTA: La imagen que describimos en esta sección se realizó en un microscopio multifotónico de dos láser personalizado que se ha descrito previamente5,39,45. Brevemente, un láser de femtosegundo se utiliza para generar 90 femtosegundos luz láser pulsada centrada en 880 nm. La luz de fluorescencia se detecta con tres de los cuatro detectores de adquisición simultánea (Azul 447/60, Verde a 520/65 y Rojo 580/60; longitud de onda central/ancho de banda) después de la separación de la luz de excitación por un dicroico (Chroma, Z720DCXXR). El soporte del microscopio contiene una lente objetivo de 25x, 1.05 NA (apertura numérica) de larga distancia de trabajo (2 mm). Es importante tener en cuenta que, si bien hemos utilizado un microscopio personalizado, el protocolo descrito a continuación también se puede realizar en cualquier microscopio multifotón disponible comercialmente.
    1. Coloque una gota de agua destilada entre el objetivo del microscopio 25x, 1.05 NA y el vidrio de la cubierta de la ventana para hacer contacto óptico.
    2. Utilice el ocular del microscopio para centrarse en áreas con células tumorales fluorescentes cerca de la superficie de la ventana.
    3. Encuentre vasos sanguíneos que fluyen y macrófagos etiquetados. Es fundamental tener vasos sanguíneos que fluyen para evaluar la dinámica de la vasculatura.
    4. Cambie el microscopio al modo multifoton.
    5. Establezca los límites superior e inferior de una serie z, que mide aproximadamente 50 m.
      1. Establezca el límite superior de la serie z utilizando el ajustador de enfoque para mover el objetivo a la ubicación de inicio deseada, en la posición más superficial, y marcando esta posición como cero dentro del software haciendo clic en el botón Superior de la posición Z.
      2. Establece el límite inferior de la serie z moviendo el objetivo a la capa más profunda (normalmente 50-70 m desde la parte superior para tumores más pequeños) y haciendo clic en el botón Inferior de la posición Z.
      3. Establezca el tamaño del paso z en 5 m.
    6. Haga clic en el botón del panel Time-Lapse y establezca el intervalo de tiempo entre adquisiciones en al menos 10 s para proporcionar tiempo adecuado para reponer el agua por encima de la lente objetivo. Esto se hace manualmente con una pipeta de compresión en el objetivo durante el lapso de tiempo largo.
    7. Retire la jeringa con PBS en el catéter de la vena de cola y reemplácela por otra jeringa que contenga el dextran-TMR de 155 kDa (tetrametil rodadamina).
    8. Inyectar 100 l de 155 kDa dextran-TMR a través del catéter de la vena de la cola.
    9. Después de la inyección, sustituya la jeringa TMR por la jeringa PBS.
    10. Adquiera una imagen de lapso de tiempo de la pila z haciendo clic en los botones Z-Stack y Time-Lapse y, a continuación, haciendo clic en el botón de grabación.
    11. Inyectar 50 s de PBS cada 30-45 min para mantener una hidratación adecuada del animal. Evite inyectar más de 200 ml a la vez, ya que esto puede causar sobrecarga de líquidos.
  7. Eutanasia
    1. Aumente el isoflurano al 5% y mantenga al animal por debajo del 5% de isoflurano con cono nasal en su lugar hasta los 30 s después de que cesen las respiraciones.
    2. Retire el ratón del escenario.
    3. Realizar luxación cervical.
  8. Procesamiento de imágenes
    1. Cargue todas las imágenes en ImageJ y formatéelas en un hiperstack de 5 dimensiones (x, y, z, t y canal de color).
    2. Realizar la separación de la superposición espectral (es decir: GFP y CFP) y la eliminación de la deriva x-y de las hiperpilas utilizando los métodos establecidos38.
    3. Utilice el ajuste de brillo y contraste para aumentar el nivel blanco del canal sanguíneo de modo que la señal de fondo se vuelva visible.
    4. Para cada rebanada z, inspeccione cuidadosamente cada película en busca de signos de fuga vascular transitoria (una "ráfaga"). Ejecutar las películas a velocidades de fotogramas rápidas (40 fps) puede ayudar a esta identificación.
    5. Una vez que se ha identificado una ráfaga, devuelva el brillo de este canal a un nivel normal y recorte el hiperstack a esta región y z-slice.

2. Evaluación del deextran extravascular mediante análisis de tejido fijo

  1. Preparación de tumores y muestras
    NOTA: La 2a parte de este protocolo supone que los tumores mamarios se han cosechado de un modelo de ratón de trasplante ortotópico de carcinoma mamario (es decir, el MMTV-PyMT). Este modelo podría ser el mismo que el descrito en la 1a parte del protocolo, aunque los tumores marcados fluorescentemente no son necesarios en este punto.
    1. Tras la terminación de la tubería experimental (es decir, tratamientos farmacológicos, etc.), realizar una inyección de cola-vaina de 100 l de 10 mg/ml 155 kDa dextran-tetrametil rhodamine, 1 h antes de sacrificar los ratones.
    2. Sacrificar a los ratones y cosechar los tumores de mama.
    3. Fijar tumores en 10% de formalina para 48-72 h y proceder a la incrustación de parafina.
    4. Usando un microtome, corta dos diapositivas secuenciales de 5 m de espesor de los tejidos de parafina incrustada en parafina fija (FFPE) de formalina. Una diapositiva se utiliza para manchar el dextran, mientras que la otra se utilizará para realizar TMEM triple-IHC, como referencia.
      NOTA: El protocolo de inmunohistoquímica triple TMEM se ha descrito en otros lugares 10.
  2. SI tinción y escaneo para la primera de las dos secciones secuenciales
    1. Envíe diapositivas a un protocolo de desfinación estándar. Esto incluye dos inmersiones posteriores en xileno (10 min cada una), seguidas de deshidratación en soluciones de alcohol diluido en serie (100%, 95%, 70% y 50% EtOH en H2O para 2 min cada inmersión).
    2. Realizar la recuperación de antígenos calentando (cerca del punto de ebullición) las secciones sumergidas en citrato (pH 6.0-ajustado) durante 20 min.
    3. Deje que las muestras se enfríen a temperatura ambiente durante 15-20 min y luego lave en PBS 3x durante 2 min cada lavado.
    4. Bloque para 60-90 min en tampón de bloqueo (10% FBS; 1% BSA; 0.0025% gelatina de piel de pescado; 0.05% PBST, es decir, PBS con 0.05% Tween-20).
    5. Incubar muestras con una mezcla de anticuerpos primarios de rata y conejo que se dirigen a Endomucina y TMR, respectivamente, y luego lavar en PBST 3x, 2 min cada uno.
    6. Incubar muestras con una mezcla de anticuerpos de burro secundarios contra la rata IgG (conjugado a Alexa-647) y el conejo IgG (conjugado a Alexa-488), y luego lavar en PBST 3x 2 min cada uno.
    7. Realice una tinción DAPI de rutina (es decir, inmersión en la solución DAPI durante 5-6 min), monte las diapositivas utilizando un medio de montaje "duro" libre de glicerol y guárdelas en un lugar oscuro hasta el escaneo.
    8. Para obtener resultados óptimos, escanee las diapositivas en un escáner de diapositivas completo digital.
  3. Análisis de imágenes
    1. Capture 10 campos de alta potencia (HIF) por caso, utilizando cualquier software adecuado para patología digital.
    2. Guarde los canales Endomucin (rojo) y TMR (verde) por separado como TIFF.
    3. Con ImageJ, cargue los archivos TIFF y conviértalos en imágenes de 8 bits.
    4. Umbral de las imágenes de 8 bits al nivel del control negativo, y generar dos imágenes binariz, que muestran las "máscaras" endomucina y TMR.
    5. En las herramientas binarias, seleccione Rellenar taladros en la máscara de endocuina.
    6. Generar y guardar las siguientes cinco regiones de interés: 1) La imagen de dextran umbral como "Dextran ROI" (ROI1), 2) la imagen endomucina umbral como "Roi2 vascular" (ROI2), 3) la imagen endomucina invertida como "ROI extravascular" (ROI3), 4) la intersectada " ROI extravascular" y "Dextran ROI" (ROI1 o ROI3) como "Extravascular Dextran ROI" (ROI4), y 5) toda la imagen como "Tumor ROI" (ROI5).
    7. Divida el área ROI4 por el área ROI5 y multiplique por 100 para generar el área porcentual que cubre la dextrana extravascular en todo el tumor.
    8. Repita el proceso para 10-20 HPF por caso (dependiendo de la disponibilidad de tejido) y genere un Dextran extran extran extran extran medio (% de área) para cada caso.

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Resultados

Los procedimientos experimentales descritos en este artículo de protocolo se resumen e ilustran brevemente en la Figura 1A-C.

Para medir la permeabilidad vascular mediada por TMEM ("actividad de ráfaga") y para reducir el ruido experimental de otros modos de permeabilidad vascular (es decir, transcelular y paracelular, como se explica en la introducción), realizamos vía intravenosa (es decir, v.) inyección de sondas de alto peso molecular, como 15...

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Discusión

Aquí, delineamos dos protocolos que se pueden aplicar para visualizar y cuantificar un tipo específico de permeabilidad vascular que está presente en las puertas de TMEM y se asocia con la interrupción de las uniones vasculares apretadas y adheridas. Este tipo de permeabilidad vascular es transitorio y controlado por el complejo de células TMEM tripartito, como se explicó anteriormente5. La capacidad de identificar y cuantificar la permeabilidad vascular asociada a TMEM es crucial para la evaluaci...

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Divulgaciones

Los autores no revelan conflictos de intereses.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer al Analytical Imaging Facility (AIF) del Albert Einstein College of Medicine por su apoyo a las imágenes. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NCI (P30CA013330, CA150344, CA 100324 y CA216248), la SIG 1S10OD019961-01, el Centro de Biofotónica Gruss-Lipper y su Programa Integrado de Imágenes, y la Beca de Capacitación Ruth L. Kirschstein T32 de Montefiore para el Estudio del Microambiente Tumoral (CA200561).

GSK co-escribió el manuscrito, realizó imágenes para las figuras 1C y 3B, desarrolló un protocolo de análisis de tejido fijo y analizó e interpretó todos los datos; JMP co-escribió el manuscrito, y realizó la cirugía y la imagen intravital para las Figuras 1B,2C y 3A; LB & AC realizó la cirugía y la imagen intravital para la Figura 2B; RJ realizó la cirugía y la imagen intravital para la Figura 2A; JSC co-escribió el manuscrito y analizó e interpretó todos los datos; MHO co-escribió el manuscrito y analizó e interpretó todos los datos; y DE realizó la cirugía y la imagen intravital para la Figura 2D, co-escribió el manuscrito, desarrolló análisis de tejido fijo y protocolos de imágenes intravitales, y analizó e interpretó todos los datos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
IgG anti-conejo (Alexa 488)Life Technologies CorporationA-11034
IgG anti-rata (Alexa 647)Life Technologies CorporationA-21247
Albúmina sérica bovinaFisher ScientificBP1600-100
CitratoEng Scientific Inc9770
Deslizamientos de vidrio de cubiertaCiencias de la microscopía electrónica72296-08
Adhesivo de cianoacrilatoAdhesivo Henkel1647358
DAPIPerkin ElmerFP1490
Dextrano-Tetrametil-RodaminaSigma AldrichT1287
DMEM/F12Gibco11320-033
Endomucina (anticuerpo primario)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
EnrofloxacinoBayer84753076 v-06/2015
Suero fetal bovinoSigma AldrichF2442
Gelatina de piel de pescado FisherScientificG7765
Jeringa de insulinaBecton Dickinson309659
IsofluoranoHenry ScheinNDC 11695-6776-2
MatrigelCorningCB40234Aguja de matriz extracelular artificial
(30 g)Becton Dickinson305128
solución salina tamponada con fosfatoLife Technologies CorporationPBS Tubo de
polietilenoScientific Commodities IncBB31695-PE/1
Oxímetro de pulsoKent ScientificMouseOx
Puralube Vet ungüentoDechraNDC 17033-211-38
Quantum DotsLife Technologies CorporationQ21561MP
CauchoMcMaster Carr1310N14
TMR (anticuerpo primario)InvitrogenA6397
Tween-20MP Productos biológicosTWEEN201
XilenoFisher Scientific 184835

Referencias

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