Construcción de Plásmidos CRISPR y Detección de Eficiencia Knockout en Células de Mamíferos a través de un Sistema Dual de Reporteros Luciferase

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo que describe un método simplificado para la generación eficiente de plásmidos que expresa tanto la enzima CRISPR como el ARN guía único asociado (sgRNAs). La coexistencia de células de mamíferos con este vector sgRNA/CRISPR y un vector reportero de luciferasa doble que examina la reparación de rotura de doble hebra permite evaluar la eficiencia de la eliminatoria.

Resumen

Aunque es altamente eficiente, la modificación de un sitio genómico por la enzima CRISPR requiere la generación de un sgRNA único para el sitio o sitios objetivo de antemano. Este trabajo describe los pasos clave que conducen a la construcción de vectores de sgRNA eficientes utilizando una estrategia que permite la detección eficiente de las colonias positivas por PCR antes de la secuenciación del ADN. Dado que la edición eficiente del genoma mediante el sistema CRISPR requiere un sgRNA altamente eficiente, es necesaria una preselección de los objetivos candidatos de sgRNA para ahorrar tiempo y esfuerzo. Se ha desarrollado un sistema de reportero de doble luciferasa para evaluar la eficiencia de los golpes examinando la reparación de roturas de doble cadena mediante recocido de una sola cadena. Aquí, utilizamos este sistema de reporteros para recoger el objetivo preferido de xCas9/sgRNA de los vectores sgRNA candidatos para la edición de genes específicos. El protocolo descrito proporcionará un vector enzimático sgRNA/CRISPR preferido en 10 días (comenzando con oligonucleótidos adecuadamente diseñados).

Introducción

Los sgRNAs CRISPR comprenden una secuencia de 20 nucleótidos (el protoespacial), que es complementaria a la secuencia de objetivos genómicos^1,2. Aunque es altamente eficiente, la capacidad del sistema CRISPR/Cas para modificar un sitio genómico determinado requiere la generación de un vector que lleve un sgRNA eficiente único en el sitio o sitios de destino^2. Este documento describe los pasos clave en la generación de ese vector sgRNA.

Para una edición exitosa del genoma utilizando el sistema CRISPR/Cas, el uso de sgRNAs altamente eficientes es un requisito p....

Protocolo

1. diseño de oligonucleótidos sgRNA

1. Diseñe sgRNAs utilizando herramientas en línea como la herramienta en línea (http://www.rgenome.net/cas-designer/ de Cas-Designer). La secuencia PAM es importante en función del Cas9 que se está utilizando. Para xCas9, las secuencias PAM relevantes son NG y la antigua herramienta en línea Cas-Designer referida puede generar xCas9 sgRNAs relevantes.
   1. Utilice herramientas de diseño sgRNA que abarquen algoritmos para la predicción dentro y fuera del objetivo (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)¹¹. Se prefiere una puntuación de 0,2 o superior.
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Resultados

Los métodos descritos en este protocolo son para la construcción de vectores de expresión sgRNA y xCas9 y luego para la optimización de los oligos de SGRNA con eficiencias de focalización genética relativamente más altas. Aquí mostramos un ejemplo representativo de 3 objetivos sgRNA a ovinos DKK2 exón 1. Los vectores que expresan SgRNA y xCas9 se pueden construir predigeriendo la columna vertebral del vector (Figura 2) seguida de ligarla en una serie de fragmentos cortos de ADN de d.......

Discusión

Los procedimientos de clonación vectorial de sgRNA que hemos descrito aquí facilitan la producción eficiente de sgRNAs, con la mayoría de los costos derivados del orden de oligonucleótidos y la secuenciación vectorial. Mientras que el método descrito está diseñado para permitir a los usuarios generar sgRNAs para su uso con CRISPR/Cas9, el protocolo se puede adaptar fácilmente para su uso con ortologues Cas9 u otras endonucleasas guiadas por ARN como Cpf1, introduciendo modificaciones menores en la columna vertebral del v.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Una nueva generación de instrumento de PCR con gradiente de pantalla táctil completa	LongGene	A200	Amplificación de genes diana
Enzimas de restricción AscI	New England Biolabs	R0558V	Vectores objetivo de corte
Enzima de restricción BbsI	New England Biolabs	R0539S	Corte de vectores objetivo
Banco de trabajo limpio	AIRTECH	SW-CJ-2FD/VS-1300L-U	Un dispositivo de purificación parcial en forma de flujo laminar vertical, que crea un ambiente local de aire altamente limpio
DH5 y alfa; Células competentes	TaKaRa	K613	Transformación de vectores de plásmidos
Sistema de ensayo reportero de luciferas duales	Promega	E1910	Ensayo reportero de luciferas
duales Baño de agua termostático eléctrico	Sanfa Scientific Instruments	DK-S24	Reactivo de calentamiento a temperatura constante en baño de agua
Electroforesis	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	DYY-6C	Control de voltaje, corriente, etc.
Eppendorf Referencia 2	Eppendorf China Ltd.	Referencia 2	Dibujar y transferir con precisión trazas de
analizador de imágenes de gel	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	WD-9413B	Para el análisis de imágenes de gel de electroforesis
Luminómetro GloMax 20/20	Promega	E5311	Detectar la actividad de la luciferasa dual
Centrífuga refrigerada de alta velocidad	BMH	sigma 3K15	Extracción y purificación de ácidos nucleicos
Incubadora bioquímica inteligente	Sanfa Scientific Instruments	SHP-160	Proporcionar un entorno de temperatura adecuado para el experimento de digestión enzimática
LB Caldo Agar	Sangon Biotech	A507003-0250	Para el cultivo de E.coli
Lipofectamina 3000 Kit de reactivos de transfección	Thermo Fisher	L3000015
Enzimas de restricción de ADN de	Nueva Inglaterra Biolabs	R3138V	Vectores objetivo de corte Gel
ADN de columna SanPrep Kit de extracción	Sangon Biotech	B518131-0050 Reciclaje de fragmentos de	ADN
Mini-Preps Kit de Mini-Preparación de Plásmidos de Columna SanPrep	Sangon Biotech	B518191-0100	Extracción de ADN plasmídico
T4 ADN Ligasa	New England Biolabs M0202V		Enlace Fragmento de ADN
TaKaRa MiniBEST Kit de purificación de fragmentos de ADN Ver.4.0	TaKaRa	9761	Purificación de ADN
Vertical esterilizador de vapor a presión	JIBIMED	LS-50LD	Alta temperatura y autoclave para matar bacterias, hongos y otros microorganismos en equipos de laboratorio
Termostato de baño de agua	Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd.	SHZ-82	Deje que las bacterias sigan temblando, lo cual es bueno para el contacto con el aire.

líquido transfección SalI de