Artículo de método

Un ensayo semicuantitativo de estabilidad de objetivos sensibles a la afinidad de drogas (DARTS, por sus) para estudiar la interacción con Rapamicina/mTOR

DOI:

10.3791/59656

⸱

27 de agosto de 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, New York University Medical Center, 2Department of Cell Biology, New York University School of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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En este estudio, mejoramos las capacidades de análisis de datos del experimento DARTS mediante el seguimiento de los cambios en la estabilidad de las proteínas y la estimación de la afinidad de las interacciones proteína-ligand. Las interacciones se pueden trazar en dos curvas: una curva proteolítica y una curva de dependencia de dosis. Hemos utilizado la interacción mTOR-rapamicina como un caso ejemplar.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La estabilidad de objetivos sensibles a la afinidad de fármacos (DARTS) es un método robusto para la detección de nuevos objetivos de proteínas de moléculas pequeñas. Se puede utilizar para verificar las interacciones molécula-proteína seres(as) conocidas y para encontrar posibles dianas proteicas para productos naturales. En comparación con otros métodos, DARTS utiliza moléculas nativas, no modificadas, pequeñas y es simple y fácil de operar. En este estudio, mejoramos aún más las capacidades de análisis de datos del experimento DARTS mediante el seguimiento de los cambios en la estabilidad de las proteínas y la estimación de la afinidad de las interacciones proteína-ligand. Las interacciones proteína-ligand se pueden trazar en dos curvas: una curva proteolítica y una curva de dependencia de dosis. Hemos utilizado la interacción mTOR-rapamicina como un caso ejemplar para el establecimiento de nuestro protocolo. De la curva proteolítica vimos que la proteólisis de mTOR por pronasa fue inhibida por la presencia de rapamicina. La curva de dependencia de dosis nos permitió estimar la afinidad vinculante de rapamicina y mTOR. Es probable que este método sea un método potente y sencillo para identificar con precisión nuevas proteínas diana y para la optimización de la participación objetivo de fármacos.

Introducción

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La identificación de proteínas diana de moléculas pequeñas es esencial para la comprensión mecanicista y el desarrollo de fármacos terapéuticos potenciales1,2,3. La cromatografía de afinidad, como método clásico para identificar las proteínas diana de moléculas pequeñas, ha dado buenos resultados4,5. Sin embargo, este método tiene limitaciones, en que la modificación química de moléculas pequeñas a menudo resulta en una especificidad o afinidad de unión reducida o alterada. Para superar estas limitaciones, recientemente se han desarrollado y aplicado varias estrategias nuevas para identificar los objetivos de moléculas pequeñas sin modificación química de las moléculas pequeñas. Estos métodos directos para la identificación diana de moléculas pequeñas sin etiquetas incluyen la estabilidad objetivo sensible a la afinidad de los fármacos (DARTS)6, la estabilidad de las proteínas a partir de las tasas de oxidación (SPROX)7, el ensayo de cambio térmico celular (CETSA)8 ,9, y perfilado de proteome térmico (TPP)10. Estos métodos son muy ventajosos porque utilizan moléculas pequeñas naturales y no modificadas y dependen únicamente de interacciones de unión directa para encontrar proteínas objetivo11.

Entre estos nuevos métodos, DARTS es una metodología comparativamente simple que puede ser fácilmente adoptada por la mayoría de los laboratorios12,13. DARTS depende del concepto de que las proteínas ligadas a ligando de ligando demuestran la susceptibilidad modificada a la degradación enzimática en relación con las proteínas no unidas. La nueva proteína diana se puede detectar mediante el examen de la banda alterada en gel SDS-PAGE a través de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS/MS). Este enfoque se ha implementado con éxito para la identificación de objetivos previamente desconocidos de productos naturales y medicamentos14,15,16,17,18, 19. También es potente como medio para detectar o validar la unión de compuestos a una proteína específica20,21. En este estudio, presentamos una mejora en el experimento mediante el seguimiento de los cambios en la estabilidad de proteínas con moléculas pequeñas y la identificación de afinidades de unión proteína-ligand. Utilizamos la interacción mTOR- rapamicina como ejemplo para demostrar nuestro enfoque.

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Protocolo

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1. Recoger y lijar células

  1. Cultivar células 293T usando el medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero bovino fetal, 2 mM de glutamina y 1% de antibióticos. Incubar cultivos a 37oCpor debajo del 5% de CO 2.
    NOTA: El estado de crecimiento de las celdas puede afectar a la estabilidad de los experimentos posteriores.
  2. Amplíe las celdas en el cultivo hasta que alcancen la confluencia del 80-u201290%.
  3. Mezclar 345 ml de reactivo de lisis celular (ver la Tabla de Materiales)con 25 l de cóctel inhibidor de la proteasa 20x, 25 ml de fluoruro sódico de 1 M, 50 ml de 100 m de glicerofosfato, 50 ml de pirofosfato sódico de 50 ml y 5 ml de ortovanato sódico de 200 mM. Mantenga el tampón de lisis refrigerado en hielo.
    NOTA: Otros tampones de lisis con diversos detergentes (por ejemplo, Triton X-100 o NP-40) se pueden utilizar con DARTS siempre y cuando no se desnaturalizen. Las proteínas de membrana o proteínas nucleares se pueden extraer añadiendo 0.4% Triton X-100 o 0.4% NP-40 al lisado celular.
  4. Lave las células dos veces con solución salina con fosfato frío (PBS).
  5. Utilice un rascador de células para recoger las células en una cantidad apropiada de tampón de lisis celular y transferir las células de lising en un tubo de 1,5 ml.
    NOTA: El número de células necesarias para cada experimento DARTS variará en función de la cantidad de proteína que se pueda extraer de varias líneas celulares. En general, la concentración proteica del lisato utilizado se encuentra entre 4 u20126 g/L. Una placa de 10 cm de células de 293T a 85-u201290% de confluencia, lysed con 300 s de tampón de lisis típicamente resulta en un lisado con una concentración de proteínas de 5 g / L.
  6. Mezclar bien las células tampón/lisis y incubar el tubo en hielo durante 10 min.
  7. Centrifugar el tubo a 18.000 oG durante 10 min a 4oC.
  8. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml y manténgalo refrigerado sobre hielo.
  9. Realizar un ensayo BCA para aproximar la concentración proteica de los lysatos.

2. Incubar lete proteínas con la molécula pequeña

  1. Dividir 99 l de los lysates en dos tubos de 1,5 ml.
  2. Hacer una concentración de stock inicial de 10 mM pequeña molécula. Al realizar DARTS, se puede comenzar con una mayor concentración de la molécula pequeña (5-u201210x el valor EC50) para asegurar una unión óptima.
    1. Añadir 1 l de disolvente en el que la molécula pequeña es soluble o de 1 l de soluciones de stock de moléculas pequeñas a cada alícuota de lisato. Incubar el lisado celular con las soluciones para 30 u201260 min a temperatura ambiente con temblor.
  3. En hielo, establezca diluciones en serie (1:200, 1:400, 1:800 y 1:1600) de solución de pronasa recién desawed en 1x TNC (Para 1 mL de tNC 10x, mezcle 300 l de agua ultrapura con 100 ol de cloruro de sodio de 5 M, 100 ml de 1 M de tnc tcmón, mezcle 300 l de agua ultrapura con 100 ol de cloruro de sodio de 5 M, 100 ml de 1 M de tampón de calcio de 1 M , y 500 l de 1 M Tris-HCl, pH 8,0).
  4. Examine una amplia gama de proporciones pronasa:proteína (por ejemplo, que abarcan de 1:100 a 1:2000) para garantizar la observabilidad del efecto escalonado de la pronasa en los objetivos.
    NOTA: Para calcular las concentraciones de pronasa (ejemplo): concentración de proteína de 5 g/L x 20 oL de muestra a 100 g de proteína. Para una relación pronase:proteína de 1:100 necesitamos una solución de pronasa de 0,5 g/l (100 g a 100 x 2 l). Este experimento puede tener que repetirse varias veces para obtener un rango adecuado de proporciones pronasa:proteína.

3. Realizar proteólisis

NOTA: Para la proteólisis, los pasos se llevan a cabo a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario

  1. Después de la incubación con la molécula pequeña, divida cada alícuota en muestras de 20 ml.
  2. Añadir 2 l de la gama de soluciones de pronasa en cada muestra a intervalos específicos (cada 30 s). Utilice un volumen igual de búfer TNC 1x para establecer una muestra de control no digerida.
  3. Después de 5 u201220 min, detenga la digestión mediante la adición de 2 ol de cóctel inhibidor de la proteasa fría 20x cada 30 s. Mezcle bien e incubar en hielo durante 10 minutos.
  4. Diluir las muestras con el volumen adecuado de 5 tampón de carga SDS-PAGE y hervir a 95 oC durante 5 min.
  5. Llevar a cabo la siguiente porción del experimento o almacenar la muestra de proteína a 80 oC.

4. Cuantificación y análisis

  1. Después de DARTS, realice la tinción azul de Coomassie de acuerdo con el protocolo22publicado anteriormente.
  2. Las bandas de proteínas manchadas deben ser muy claras después de la desención. Vierta la solución de desfinación usada y agregue una solución fresca de ácido acético al 1% para cubrir el gel. Coloque el gel bajo la luz para observar las bandas con diferencias significativas entre grupos con (grupo de muestra) o sin (grupo de control) la molécula pequeña.
  3. Corte las dos bandas correspondientes del gel con un instrumento estéril y realice LC-MS/MS inmediatamente.
    NOTA: LC-MS/MS debe realizarse lo antes posible porque las proteínas del gel se degradarán continuamente.
  4. Digerir las bandas, extraer péptidos y realizar el análisis LC-MS/MS23.
    1. Para analizar los datos de LC-MS/MS, primero identifique todas las proteínas de la banda individual. En segundo lugar, utilice la coincidencia del espectro de péptidos (PSM) para representar la abundancia de cada proteína.
      NOTA: PSM proporciona el número total de secuencias de péptidos identificadas para la proteína, incluidas las identificadas de forma redundante. En general, la frecuencia con la que se identifica/secuencia un péptido se puede utilizar como una estimación aproximada de cuán abundante es la proteína en la muestra. Las proteínas enriquecidas en el grupo de muestra sin el grupo de control son proteínas de interés.
  5. Procurar los anticuerpos primarios de las proteínas seleccionadas. Realizar mancha occidental para verificar que la molécula pequeña puede unirse directamente a las proteínas objetivo potenciales24.
    1. Cargar cantidades iguales de proteína en los pozos de un 8% de gel SDS-PAGE, junto con un marcador de peso molecular adecuado. Ejecuta el gel durante 30 min a 80 V, luego ajusta la tensión a 120 V y continúa funcionando durante 1.u20122 h.
  6. Cuantifique las diferentes bandas de proteínas diana utilizando el software de procesamiento y análisis de imágenes (consulte la Tabla de materiales).
  7. Analice los datos y dibuje las curvas.
    1. Determinación de la curva proteolítica para una proteína diana
      1. La relación pronase:proteína es variada cuando se realiza proteólisis. Normalice los datos del análisis de imágenes atribuyendo los valores de intensidad de banda correspondientes a las bandas no digeridas al 100%.
      2. Utilice el análisis de regresión no lineal del software de análisis estadístico y dibujo para trazar una curva de datos normalizados para la intensidad relativa de la banda y las relaciones pronase:proteína.
      3. En primer lugar, abra el software, seleccione el tipo de tabla y gráfico como XY y permita 3 valores de réplica en subcolumnas en paralelo. A continuación, introduzca los datos correspondientes en el espacio debajo de x e y. En x, introduzca los números 0, 1, 2, 3, 4, 5 (como los portalugares correspondientes pronasa:proteínas).
      4. En la columna y, introduzca los datos normalizados para las intensidades de banda relativas. Realice "Regresión no lineal" e implemente una "Dosis-respuesta-Estimulación" utilizando la ecuación "Log (agonista) versus response—Variable slope (cuatro parámetros)".
      5. Convierta las anotaciones del eje X en la curva en las relaciones pronase:proteína correspondientes.
    2. Determinación de la curva de dependencia de la dosis para una proteína diana
      NOTA: Para el análisis de la dosis-dependencia, la molaridad de la molécula pequeña se diferencia entre las muestras. La relación pronase:proteína estable debe ser informada mediante el análisis de los datos de proteólisis. Para el experimento de la dosis se debe utilizar la relación pronase:proteína que mostró la máxima diferencia en la intensidad de la proteína diana durante la curva proteolítica.
      1. Cuantifique las diferentes bandas de proteínas diana utilizando un software de análisis de imágenes. Al igual que en la generación de la curva de dependencia de dosis, normalice los datos del análisis de imágenes atribuyendo los valores de intensidad de la banda correspondientes a la banda menos digerida al 100%.
      2. Aplique el análisis de regresión no lineal dentro del software de análisis estadístico y dibujo a los datos normalizados. En primer lugar, abra el software, seleccione el tipo de tabla y gráfico como XY e introduzca 3 valores de réplica en subcolumnas en paralelo.
      3. A continuación, introduzca los datos correspondientes en el espacio inferior a x e y. Para la variable 'x', introduzca diferentes concentraciones de la molécula pequeña; 'y' incluye los datos normalizados correspondientes para la intensidad relativa de la banda.
      4. Transformar los valores x mediante X - Log(X). Por último, emplee la regresión no lineal e implemente una estimulación dosis-respuesta utilizando la ecuación "Log (agonista) versus response—Variable slope (cuatro parámetros)".

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Resultados

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El diagrama de flujo del experimento se describe en la Figura1. El resultado de la tinción azul de Coomassie se muestra en la Figura2. La incubación con la molécula pequeña confiere protección contra la proteólisis. Se encuentran tres bandas que parecen estar protegidas por la incubación con rapamicina sobre el control del vehículo. Los resultados esperados del experimento de curva proteolítica se muestran en la Figura3. Como prueba...

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Discusión

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DARTS permite la identificación de pequeñas dianas de moléculas explotando el efecto protector de la unión a proteínas contra la degradación. DARTS no requiere ninguna modificación química o inmovilización de la molécula pequeña26. Esto permite utilizar moléculas pequeñas para determinar sus objetivos de proteína de unión directa. Los criterios de evaluación estándar para el método Clásico DARTS incluyen la tinción de gel, espectrometría de masas y la hincha occidental12,

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado en parte por las becas de investigación DE NIH R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, y una beca de investigación del Departamento de Defensa W81XWH-16-1-0482.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
100X Cóctel de inhibidores de la proteasaSigma-AldrichP8340Diluido a 20X con agua ultrapura
Línea celular 293TATCCCRL-3216Medio DMEM con 10% de ácido
acéticoFBS Sigma-AldrichA6283
BCA Kit de ensayo de proteínasThermo Fisher23225
Cloruro de calcioSigma-AldrichC1016
Rascador de célulasThermo Fisher179693
Coomassie Brilliant Blue R-250 Solución de tinciónBio-Rad1610436
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD2650
GraphPad PrismaGraphPad Software GraphPadversión 6.0software de análisis estadístico y dibujo
Ácido clorhídricoSigma-AldrichH1758
ImageJNational Institutes of HealthVersión 1.52software de procesamiento y análisis de imágenes
M-PER Reactivo de lisis celularThermo Fisher78501
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)CorningR21-040-CV
PronaseRochePRON-RO10 mg/ml
Cloruro de sodioSigma-AldrichS7653
Fluoruro de sodioSigma-AldrichS7920
Ortovanadato de sodioSigma-Aldrich450243
Pirofosfato de sodioSigma-Aldrich221368
Trizma baseSigma-AldrichT1503ajustar a pH 8.0
β-glicerofosfatoSigma-AldrichG9422

Referencias

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