Artículo de método

En Vivo Estudio Funcional de Variantes Humanas Raras Asociadas a la Enfermedad Usando Drosophila

DOI:

10.3791/59658

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20 de agosto de 2019

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1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience, Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, 5Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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El objetivo de este protocolo es esbozar el diseño y la realización de experimentos in vivo en Drosophila melanogaster para evaluar las consecuencias funcionales de las variantes genéticas raras asociadas con las enfermedades humanas.

Resumen

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Los avances en la tecnología de secuenciación han hecho que los conjuntos de datos de genoma completo y de exoma completo sean más accesibles tanto para el diagnóstico clínico como para la investigación en genética humana de vanguardia. Aunque se han desarrollado varios algoritmos in silico para predecir la patogenicidad de las variantes identificadas en estos conjuntos de datos, los estudios funcionales son críticos para determinar cómo las variantes genómicas específicas afectan la función proteica, especialmente por tener un sentido erróneo Variantes. En la Red de Enfermedades No Diagnosticadas (UDN) y otros consorcios de investigación de enfermedades raras, organismos modelo (MO) incluyendo Drosophila, C. elegans,pez cebra y ratones se utilizan activamente para evaluar la función de la enfermedad humana putativa Variantes. Este protocolo describe un método para la evaluación funcional de variantes humanas raras utilizadas en el Centro de Detección de Organismos Modelo Drosophila Core de la UDN. El flujo de trabajo comienza con la recopilación de información humana y MO de múltiples bases de datos públicas, utilizando el recurso web MARRVEL para evaluar si la variante es probable que contribuya a la condición de un paciente, así como diseñar experimentos eficaces basados en disponibles conocimientos y recursos. A continuación, se generan herramientas genéticas (por ejemplo, líneas de ADNc humanos T2A-GAL4 y UAS) para evaluar las funciones de las variantes de interés en Drosophila. Tras el desarrollo de estos reactivos, se pueden realizar ensayos funcionales de dos puntas basados en experimentos de rescate y sobreexpresión para evaluar la función de las variantes. En la rama de rescate, los genes de la mosca endógena se "humanizan" reemplazando el gen de la Drosophila ortopéloga por transgenes humanos de referencia o variante. En la rama de sobreexpresión, las proteínas humanas de referencia y variante se impulsan exógenamente en una variedad de tejidos. En ambos casos, cualquier fenotipo escorable (por ejemplo, letalidad, morfología ocular, electrofisiología) se puede utilizar como lectura, independientemente de la enfermedad de interés. Las diferencias observadas entre los alelos de referencia y de variante sugieren un efecto específico de la variante, y por lo tanto probablemente la patogenicidad. Este protocolo permite evaluaciones rápidas e in vivo de variantes putativas causantes de enfermedades humanas de genes con funciones conocidas y desconocidas.

Introducción

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Los pacientes con enfermedades raras a menudo se someten a un arduo viaje conocido como la "odisea diagnóstica" para obtener un diagnóstico preciso1. Se cree que la mayoría de las enfermedades raras tienen un fuerte origen genético, lo que hace que los análisis genéticos/genómicos sean elementos críticos del estudio clínico. Además de la secuenciación de paneles genéticos candidatos y el análisis de variación de los números de copia basados en microarrays cromosómicos, las tecnologías de secuenciación de todo el exónmio (WES) y de secuenciación del genoma completo (WGS) se han convertido en herramientas cada vez más valiosas en la última década2, 3. Actualmente, la tasa de diagnóstico para la identificación de una variante patógena conocida en WES y WGS es de 25% (mayor en casos pediátricos)4,5. Para la mayoría de los casos que permanecen sin diagnosticar después del WES/WGS clínico, un problema común es que hay muchos genes y variantes candidatas. La secuenciación de próxima generación a menudo identifica variantes novedosas o ultra raras en muchos genes, y la interpretación de si estas variantes contribuyen a los fenotipos de la enfermedad es un reto. Por ejemplo, aunque se cree que la mayoría de las mutaciones sin sentido o en marcadas en los genes son alelos de pérdida de función (LOF) debido a la descomposición mediada por tonterías de la transcripción codificada, las mutaciones truncadas encontradas en los últimos exones escapan a este proceso y pueden funcionar como alelos benignos o de ganancia de función (GOF)6.

Por otra parte, predecir los efectos de un alelo de sentido erróneo es una tarea desalentadora, ya que puede dar lugar a una serie de diferentes escenarios genéticos como se describe por primera vez por Herman Muller en la década de 1930 (es decir, amorfo, hipómorfo, hipermorfo, antimorfo, neomorfo o isomorfo)7 . Numerosos programas y metodologías en silico se han desarrollado para predecir la patogenicidad de variantes de mala detección basadas en la conservación evolutiva, el tipo de cambio de aminoácidos, la posición dentro de un dominio funcional, la frecuencia del alelo en la población general, y otros parámetros8. Sin embargo, estos programas no son una solución integral para resolver el complicado problema de la interpretación de variantes. Curiosamente, un estudio reciente demostró que cinco algoritmos de predicción de patogenicidad variante ampliamente utilizados (Polyphen9, SIFT10, CADD11, PROVEAN12, Mutation Taster) están de acuerdo en la patogenicidad -80% del tiempo8 . En particular, incluso cuando todos los algoritmos están de acuerdo, devuelven una predicción incorrecta de patogenicidad hasta el 11% del tiempo. Esto no sólo conduce a una interpretación clínica defectuosa, sino que también puede disuadir a los investigadores de dar seguimiento a nuevas variantes al enumerarlas falsamente como benignas. Una forma de complementar la limitación actual del modelado de silico es proporcionar datos experimentales que demuestren el efecto de la función variante in vitro, ex vivo (por ejemplo, células cultivadas, organoides) o in vivo.

Los estudios funcionales in vivo de variantes asociadas a enfermedades raras en MO tienen fortalezas únicas13 y han sido adoptados por muchas iniciativas de investigación de enfermedades raras en todo el mundo, incluyendo la Red de Enfermedades No Diagnosticadas (UDN) en los Estados Unidos y Rare Redes de Modelos y Mecanismos de Enfermedades (RDMM) en Canadá, Japón, Europa y Australia14. Además de estos esfuerzos coordinados para integrar a los investigadores de MO en el flujo de trabajo de diagnóstico de enfermedades raras y estudios mecánicos a escala nacional, una serie de estudios de colaboración individuales entre investigadores clínicos y de MO han llevado al descubrimiento y la caracterización de muchos nuevos genes y variantes causantes de enfermedades humanas82,83,84.

En la UDN, un Centro centralizado de Cribado de Organismos Modelo (MOSC) recibe presentaciones de genes y variantes candidatas con una descripción de la condición del paciente y evalúa si la variante es probable que sea patógena utilizando herramientas informáticas e in vivo Experimentos. En la Fase I (2015-2018) de la UDN, el MOSC comprendía un Núcleo Drosophila [Baylor College of Medicine (BCM)] y Zebrafish Core (Universidad de Oregón) que trabajaba en colaboración para evaluar casos. Utilizando el análisis informático y una serie de estrategias experimentales diferentes en Drosophila y pez cebra, el MOSC ha contribuido hasta ahora al diagnóstico de 132 pacientes, identificación de 31 nuevos síndromes55,descubrimiento de varios nuevos genes de la enfermedad (p. ej., EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) y expansión fenotípica de la enfermedad conocida genes (por ejemplo, CACNA1A21,ACOX122).

Además de los proyectos dentro de la UDN, los investigadores del MOSC Drosophila Core han contribuido a los nuevos descubrimientos genéticos de la enfermedad en colaboración con los Centros de Genómica Mendeliana y otras iniciativas (por ejemplo, ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) utilizando el mismo conjunto de informática y genética estrategias desarrolladas para la UDN. Dada la importancia de los estudios de MO sobre el diagnóstico de enfermedades raras, el MOSC se amplió para incluir un núcleo de C. elegans y un segundo núcleo de pez cebra (ambos en la Universidad de Washington en St. Louis) para la Fase II (2018-2022) de la UDN.

Este manuscrito describe un protocolo de estudio funcional in vivo que se utiliza activamente en el núcleo de Drosophila UDN MOSC para determinar si las variantes de mala detección tienen consecuencias funcionales en la proteína de interés utilizando moscas transgénicas que expresan Proteínas. El objetivo de este protocolo es ayudar a los investigadores de MO a trabajar en colaboración con grupos de investigación clínica para proporcionar evidencia experimental de que una variante candidata en un gen de interés tiene consecuencias funcionales, facilitando así el diagnóstico clínico. Este protocolo es más útil en un escenario en el que un investigador de Drosophila es abordado por un investigador clínico que tiene un paciente de enfermedad rara con una variante candidata específica en un gen de interés.

Este protocolo se puede dividir en tres elementos: (1) recopilar información para evaluar la probabilidad de que la variante de interés sea responsable del fenotipo del paciente y la viabilidad de un estudio funcional en Drosophila,(2) herramientas genéticas existentes y el establecimiento de otras nuevas, y (3) realizar estudios funcionales in vivo. El tercer elemento se puede subdividir en dos subelementos en función de cómo se puede evaluar la función de una variante de interés (experimento de rescate o estrategias basadas en sobreexpresión). Es importante tener en cuenta que este protocolo puede adaptarse y optimizarse a muchos escenarios fuera de la investigación de enfermedades monogénicas raras (por ejemplo, enfermedades comunes, interacciones gene-ambiente y pantallas farmacológicas/genéticas para identificar dianas terapéuticas). La capacidad de determinar la funcionalidad y la patogenicidad de las variantes no sólo beneficiará al paciente de interés al proporcionar un diagnóstico molecular preciso, sino que también tendrá impactos más amplios en la investigación científica tanto traslacional como básica.

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Protocolo

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1. Recopilación de información humana y MO para evaluar: Probabilidad de que una variante de interés sea responsable de los fenotipos de enfermedades y viabilidad de estudios funcionales en Drosophila

  1. Realizar extensas búsquedas de bases de datos y literatura para determinar si los genes y variantes de interés específicos son buenos candidatos para explicar el fenotipo del paciente de interés. Específicamente, recopile la siguiente información.
    1. Evaluar si el gen de interés ha estado implicado previamente en otros trastornos genéticos (expansión fenotípica del gen de la enfermedad conocida) o se trata de un gen candidato a enfermedad completamente nuevo [variante genética de significación incierta (GVUS)].
    2. Evaluar la frecuencia del alelo de la variante de interés en las bases de datos de enfermedades o de control de la población.
    3. Evaluar si hay variaciones del número de copia (CNV) que incluyen este gen en las bases de datos de enfermedades o controlar las poblaciones.
    4. Evalúe cuáles son los genes ortólogos en diferentes especies de MO, incluyendo ratón, pez cebra, Drosophila, C. elegans, y levadura, luego investigue más a fondo las funciones conocidas y los patrones de expresión de estos genes ortologous.
    5. Evaluar si la variante de interés está presente en un dominio funcional de la proteína y si el aminoácido de interés se conserva evolutivamente.
      NOTA: Las respuestas a estas cinco preguntas (pasos 1.1.1-1.1.5) se pueden obtener accediendo a una serie de bases de datos humanas y MO individualmente o utilizando el recurso web MARRVEL (Model organism Aggregated Resources for Rare Variant Exploration) (véase la Tabla de 1 para los recursos en línea)30, que se describe en profundidad en un artículo31adjunto. Consulte la sección de resultados representativos para obtener ejemplos específicos. El sitio web32 de Monarch Initiative y Gene2Function33 también proporcionan información útil.
  2. Recopile información adicional para evaluar más a fondo si la variante es un buen candidato a la enfermedad desde el punto de vista de la estructura y la función proteica.
    1. Evalúe si se prevé que la variante de interés sea perjudicial en función de los algoritmos de predicción de sislicos.
      NOTA: Los algoritmos de patogenicidad variante han sido desarrollados por muchos grupos de investigación en los últimos 15 años, y algunos también se muestran en los resultados de búsqueda de MARRVEL. Los programas más recientes, incluidos los dos enumerados a continuación, combinan algoritmos de redicción de patogenicidad de múltiples variantes y enfoques de aprendizaje automático para generar una puntuación de patogenicidad. Para obtener más información sobre los algoritmos de predicción de variantes y su rendimiento, consulte Ghosh, et al.8. (i) CADD (agotamiento combinado dependiente de la anotación): herramienta de anotación integrativa construida a partir de más de 60 características genómicas, que proporciona puntuaciones para SNV humanos, así como inserciones y eliminaciones cortas11. (ii) REVEL (aprendiz de conjunto de variantes de exoma raros): combina múltiples algoritmos de patogenicidad variante (MutPred, FATHMM, VEST, PolyPhen, SIFT, PROVEAN, MutationAssessor, MutationTaster, LRT, GERP, SiPhy, phyloP y phastCons) para proporcionar una puntuación integrada para todas las posibles variantes de mala sensatez humana34.
    2. Determinar si se ha demostrado que el gen/proteína humana de interés o sus ortologos MO interactúan genética o físicamente con genes/proteínas previamente vinculados a enfermedades genéticas. Si es así, evalúe si el paciente de interés presenta fenotipos superpuestos con estos trastornos.
      NOTA: Se han desarrollado varias herramientas para analizar las interacciones genéticas y proteínas-proteínas basadas en publicaciones de MO, así como proteómicaa a gran escala de múltiples pantallas de especies. STRING (herramienta de búsqueda para instancias recurrentes de genes vecinos)35: una base de datos para interacciones proteína-proteína conocidas y predichas. Integra conjuntos de datos de interacción genética y coexpresión, así como herramientas de extracción de texto para identificar genes y proteínas que pueden funcionar juntos en una variedad de organismos. MIST (herramienta de búsqueda de interacción molecular)36: una base de datos que integra datos genéticos y de interacción proteína-proteína de MA genéticas básicas (levadura, C. elegans, Drosophila,pez cebra, rana, rata, ratón) y humanos. También se muestra la predicción de interacciones inferidas a partir de genes/proteínas ortologos (interlogs).
    3. Determinar si la estructura 3D de la proteína de interés se ha resuelto o modelado. Si es así, determine dónde se asigna la variante de interés en relación con los dominios funcionales clave.
      NOTA: Las estructuras proteicas resueltas por cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear (RMN) y microscopía crioelectrónica se pueden encontrar en bases de datos públicas, incluyendo el PDB (banco de datos de proteínas) y EMDatabank37. Aunque no existe una base de datos única para estructuras proteicas predichas/modeladas, haydisponibles para quelos usuarios realicen el modelado de proteínas.
  3. Comunicarse con colaboradores clínicos para discutir la información recopilada de los análisis informáticos en las secciones 1.1-1.2. Si los colaboradores clínicos también sienten que la variante y el gen de interés son buenos candidatos para explicar los fenotipos observados en el paciente, proceda a la sección 2. Si hay preguntas específicas sobre el genotipo y el fenotipo del paciente, discuta con los colaboradores clínicos antes de seguir adelante.
    NOTA: Si se considera que es poco probable que la variante de interés explique el fenotipo de interés (por ejemplo, una variante idéntica que se encuentra en alta frecuencia en la población de control), discuta esto con los colaboradores clínicos para determinar si la variante es una buena candidato, ya que puede no haber la experiencia adecuada para interpretar fenotipos clínicos.

2. Reunir herramientas genéticas existentes y establecer nuevos reactivos para estudiar una variante específica de interés

NOTA: Una vez que la variante de interés se ha determinado un buen candidato para perseguir experimentalmente, reunir o generar reactivos para realizar estudios funcionales in vivo. Para los estudios funcionales descritos en este protocolo, se necesitan algunos reactivos clave de Drosophila melanogaster: 1) cepas transgénicas de ADN humanas reguladas por secuencia de activación ascendente que llevan la secuencia de referencia o variante, 2) una pérdida de función alelo de un gen de mosca de interés, y 3) una línea GAL4 que se puede utilizar para experimentos de rescate.

  1. Generación de construcciones de ADNc humanos de la UAS y moscas transgénicas
    1. Identificar y obtener las construcciones humanas apropiadas. Muchos clones están disponibles en la MGC (colección de genes de mamíferos)43 y se pueden comprar en vendedores seleccionados. Para los genes que se empalman alternativamente, compruebe qué adNC isoforme corresponde al uso de Ensembl o RefSeq.
      NOTA: Muchos cDNA están disponibles en reactivos compatibles con el sistema de clonación mediados por recombinación44,lo que simplifica el paso de subclonación. Los cDNA pueden venir en un formato "abierto (sin stop codon)" o "cerrado (con codón de parada endógeno o artificial)". Mientras que los clones abiertos permiten el etiquetado C'de proteínas que son útiles para bioquímicos (por ejemplo, mancha occidental) y ensayos biológicos celulares (por ejemplo, inmunomanchado) para monitorear la expresión de la proteína de interés, puede interferir con la función proteica en algunos casos.
    2. Subclone la referencia y la variante cDNA en el vector transgénico Drosophila. Utilice el sistema de transgénesis mediado por C31, ya que esto permite que los CDNA de referencia y variante se integren en la misma ubicación en el genoma45. Para este proyecto, el NÚCLEO drosophila MOSC utiliza rutinariamente el vector pGW-HA.attB46.
      NOTA: Si el ADNc humano está en vectores compatibles con el sistema de clonación mediado por recombinas (por ejemplo, pDONR221, pENTR221), vaya a la sección 2.1.4, que explica las reacciones LR para subclonar los CDNA en pGW-HA.attB.
      1. Si el ADNc humano no está en un plásmido compatible con un sistema de clonación mediado por recombinas, subclone los CDNAs humanos en un vector de entrada Gateway utilizando técnicas biológicas moleculares estándar (un ejemplo de dicho protocolo se documenta a continuación).
        1. Realice un PCR de voladizo para introducir los brazos attB1 y attB2. La imprimación directa debe tener la secuencia attB1 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAGCAGGCTTCACC-3' seguida de los primeros 22 nucleótidos del ADNC objetivo. La imprimación inversa debe tener la secuencia attB2 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTA-3' seguida del complemento inverso de los últimos 25 nucleótidos del ADNc de interés. Excluya el codón de parada del ADNc, luego agregue una etiqueta C' si desea "abrir" un clon, o agregue un codón stop para "cerrar" un clon.
        2. Preparar una mezcla de PCR de alta fidelidad de 100 ml que consista en 50 l de mezcla maestra de PCR de alta fidelidad, 36 ml de agua destilada, 5 l de cada imprimación delantera e inversa enumerada en el paso 2.1.2.1.1 diluido a 10 oM, y 4 l de ADNc objetivo (150 ng/L).
        3. Realice PCR utilizando el protocolo de mutagénesis estándar para agregar brazos attB1 y attB2 al ADNc de interés. Las condiciones variarán dependiendo de la construcción y las variantes de interés.
        4. Aísle el ADNc objetivo con brazos de homología añadidos a través de electroforesis de gel y extracción de gel. Crear 1% gel de agarosa y realizar electroforesis utilizando métodos estándar. Infórmele la banda que corresponde al tamaño del ADNc más la longitud adicional de los brazos de homología. Extraer ADN del gel a través de los métodos estándar95. Los kits de extracción de gel comercial están disponibles en varias empresas.
        5. Realizar una reacción de recombinación in vitro basada en el protocolo de clonación mediada por recombinas de acuerdo con el sistema que se utiliza.
        6. Transforme la mezcla de reacción BP en células de E. coli químicamente competentes. Las celdas competentes se pueden hacer internamente o comprar a proveedores comerciales. Cultivo de las células transformadas durante la noche en una placa LB que contiene antibióticos apropiados para la selección de colonias. Al día siguiente, seleccione varias colonias y cultivarlas en cultivos líquidos independientes durante la noche.
        7. Aislar el ADN de los cultivos nocturnos a través de miniprep. Sanger secuencia los clones positivos para asegurarse de que el ADNc tiene la secuencia correcta96. Mantener las células de los cultivos que son positivos para la secuencia deseada en 25% glicerol almacenado a -80 oC.
    3. Realice la mutagénesis dirigida por el sitio para introducir la variante de interés en el plásmido Gateway con el ADNC humano de referencia97. Un protocolo detallado para este método se puede encontrar en el sitio web del proveedor48,49. Validar la presencia de la variante en el plásmido mutado a través de la secuenciación de Sanger de todo el marco de lectura abierto (ORF) para asegurarse de que no hay variantes adicionales introducidas a través de este paso de mutagénesis.
    4. Subclone los CDNAs humanos de referencia y variante en el plásmido del donante (plásmidos de puerta de enlace con sitios attL1 y attL2) en el plásmido transgénico (por ejemplo, pGW-HA.attB con sitios attR1 y attR2) a través de una reacción de LR clonase.
      NOTA: Hay vectores UAS-C31 diseñados para la subclonación basada en enzimas de restricción convencional (por ejemplo, pUAST.attB50) si se prefiere subclonar cDNas humanos a través de métodos de enzimas de restricción.
    5. Seleccione los sitios de acoplamiento C31 en los que integrar los transgenes de ADNc humanos UAS. Varios laboratorios han generado varios centros de atraque y están disponibles públicamente en los centros de stock50,52,53.
      NOTA: Dado que es conveniente tener el transgén humano en un cromosoma que no contiene el ortolog mosca del gen de interés, se recomienda utilizar un segundo sitio de acoplamiento de cromosomas [VK37 (BDSC stock #24872] cuando el ortolog de la mosca está en la X , cromosomas terceros o cuartos, y utilizar un tercer sitio de acoplamiento de cromosomas [VK33 (BDSC stock #24871] cuando el ortolog de mosca está en el segundo cromosoma.
    6. Inyectar construcciones de ADNc humanos de la UAS en moscas que expresen una integrasa de C31 en su línea germinal (p. ej., vas-C31, nos-C31).
      NOTA: La microinyección se puede realizar internamente o enviarse a instalaciones centrales o entidades comerciales para la transgénesis. El protocolo detallado para generar moscas transgénicas se puede encontrar en el libro citado capítulo51.
    7. Establecer cepas transgénicas estables de los embriones inyectados. Inyectar 100-200 embriones por construcción94. En la Figura 1Ase muestra un esquema de cruce representativo para una inserción transgénica en un segundo sitio de acoplamiento cromosómico (VK37). Consulte los libros citados54,55 para obtener información básica sobre la genética Drosophila.
  2. Obtener o generar una línea T2A-GAL4 que facilite ensayos funcionales basados en rescates (véase la Figura 2 y la sección 3.1).
    NOTA: Esta línea servirá para dos propósitos. En primer lugar, la mayoría de las líneas T2A-GAL4 probadas se comportan como alelos LOF fuertes al funcionar como un alelo de trampa genética. En segundo lugar, las líneas T2A-GAL4 funcionan como un controlador GAL4 que permite la expresión de construcciones UAS (por ejemplo, UAS-GFP, CDNAs humanos UAS) bajo los elementos de regulación endógena del gen de interés56,57 (Figura2A-C).
    1. Busque en las colecciones de acciones públicas las líneas T2A-GAL4 disponibles, incluido el Proyecto de Disrupción Genética drosophila (PIB)58, en el que se han generado59líneas T2A-GAL4. Estas cepas están actualmente disponibles en el Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) y se pueden buscar a través de los sitios web del PIB y BDSC.
    2. Si no hay disponible una línea T2A-GAL4 para el gen de interés fly, compruebe si hay disponible una línea MiMIC (cassette de integración mediada porMinos)adecuada para su conversión en una línea T2A-GAL4 mediante el intercambio de casetes mediados por recombinas (RMCE) )60 (Figura 2A).
      NOTA: RMCE permite que los elementos Intronic MiMIC que se encuentran entre dos exons de codificación se conviertan en una línea T2A-GAL4 a través de la microinyección de una construcción de donante (un ejemplo de un esquema de cruce se muestra en la Figura 1B)o en la serie de cruces, como se describe en detalle57,59.
    3. Si una línea T2A-GAL4 no está disponible y no existe un MiMIC intrónico de codificación adecuado, explore la posibilidad de generar una línea T2A-GAL4 a través del sistema CRIMIC (cassette de integración mediado por CRISPR)59.
      NOTA: Esta metodología utiliza la escisión de ADN mediada por CRISPR y la reparación dirigida por homología (HDR) para integrar un casete similar a MiMIC en un intrón de codificación en un gen de interés.
    4. Si el gen de interés carece de un intrón grande (>150 bp) o no tiene intrones, intente llamar a un transgén GAL4 en el gen de la mosca con el sistema CRISPR/Cas9 utilizando HDR como se describe20,61,62.
      NOTA: Si la generación de un alelo de knock-in T2A-GAL4 o GAL4 es difícil, intente realizar experimentos de rescate utilizando estos alelos preexistentes o líneas RNAi y controladores GAL4 ubicuos o específicos de tejido como se describe92 (REF).

3. Realización de Análisis Funcional de La Variante Humana de Interés In Vivo en Drosophila

NOTA: Realizar un análisis basado en el rescate (sección 3.1) así como estudios de sobreexpresión (sección 3.2) utilizando las herramientas recogidas o generadas en la sección 2 para evaluar las consecuencias de la variante de interés in vivo en Drosophila. Considere la posibilidad de utilizar ambos enfoques, ya que los dos son complementarios.

  1. Realización de análisis funcionales a través de experimentos basados en rescate
    Nota: Experimentos heterotemos basados en rescates enDrosophilael uso de proteínas humanas determina si la función molecular de los dos genes ortoxólogos se han conservado a lo largo de 500 millones de años de evolución. También evalúan la función de la variante en el contexto de la proteína humana63. Aunque no se ha notificado un análisis sistemático que estudia cientos de pares de genes, varias docenas de genes humanos y mamíferos (por ejemplo, ratones) son capaces de reemplazar la función deDrosophilaGenes13.
    1. En el enfoque basado en el rescate, primero determine si hay fenotipos obvios, escorables y reproducibles en mutantes LOF en el ortolog de la mosca antes de evaluar las funciones de las variantes.
      NOTA: La literatura anterior sobre el gen de la mosca es un buen lugar para la mina de datos primero, y se puede encontrar utilizando bases de datos como FlyBase y PubMed. Bases de datos adicionales como MARRVEL, Monarch Initiative y Gene2Funcion también son útiles para recopilar esta información.
    2. Realizar un estudio global de fenotipos escorables en alelo homocigoto y hemizygous (alelo T2A-GAL4 sobre un animal con deficiencia cromosómica definida molecularmente, especialmente si el alelo T2A-GAL4 es la primera mutación que se caracteriza por un gen específico. Evaluar fenotipos como la letalidad, la esterilidad, la longevidad, morfológico (por ejemplo, el tamaño y la morfología del ojo) y el comportamiento (por ejemplo, cortejo, vuelo, escalada y defectos de sensibilidad a la explosión).
      NOTA: Si no hay fenotipos principales identificados en esta pantalla primaria, se pueden utilizar fenotipos más sutiles como defectos neurológicos medidos por grabaciones electrofisiológicas si son altamente reproducibles y específicos. Por ejemplo, los estudios funcionales con electroretinograma (ERG) se describen en el paso 3.2.3. Si no se detecta ningún fenotipo que se puede escorar, vaya a la sección 3.2 y realice el estudio funcional basado en sobreexpresión.
    3. Una vez que se identifica un fenotipo scorable en el mutante LOF mosca, pruebe si el ADNC humano de referencia puede reemplazar la función del ortolog mosca al intentar usar ADNc humano para rescatar la línea de mosca mutante. El ensayo fenotípico que se realizará aquí depende de los resultados del paso 3.1.2 y será específico del gen que se está estudiando.
      NOTA: Si la "humanización" del gen de la mosca tiene éxito, ahora hay una plataforma para comparar la eficiencia del rescate para la variante de interés en comparación con la contraparte de referencia. El rescate visto con ADNc humano de referencia no tiene que ser perfecto. El rescate parcial del fenotipo mutante mosca utilizando un ADNC humano todavía proporciona un punto de referencia para realizar estudios comparativos utilizando la cepa de ADNC humano variante.
    4. Usando el sistema de ensayo seleccionado en el paso 3.1.2, compare el rescate observado con el ADNc humano de referencia con el rescate observado con la variante de ADNC humano para determinar si la variante de interés tiene consecuencias en el gen de interés.
      NOTA: Si la variante de ADNC humano funciona peor que el alelo de referencia, esto sugiere que la variante de interés es perjudicial para la función proteica. Si la variante y la referencia no se pueden distinguir funcionalmente, entonces 1) el alelo puede ser un isomorfo (una variante que no afecta a la función proteica) o 2) el ensayo no es lo suficientemente sensible como para detectar diferencias sutiles.
    5. Si se encuentra que la variante es un alelo nocivo, evalúe más la expresión y la localización intracelular de las proteínas de referencia y variante de interés in vivo a través de la mancha occidental, la tinción de inmunofluorescencia u otros métodos93.
      NOTA: Si el ADNC humano UAS se genera a partir de un clon abierto en un vector pGW-HA.attB, utilice un anticuerpo anti-HA para realizar estos ensayos bioquímicos y celulares. Si el clon original es un clon cerrado, pruebe si se pueden utilizar anticuerpos comerciales contra las proteínas humanas para estos ensayos. Una diferencia en los niveles de expresión y la localización intracelular puede revelar cómo la variante de interés afecta la función proteica.
  2. Realización de análisis funcionales a través de estudios de sobreexpresión
    NOTA: La sobreexpresión ubicua o específica del tejido de los CDNa humanos en moscas de otro tipo salvaje puede proporcionar información que es complementaria a los experimentos basados en rescates que se tratan en la sección 3.1. Mientras que los ensayos basados en rescate están diseñados principalmente para detectar variantes LOF (amorfo, hipocófico), los ensayos basados en sobreexpresión también pueden revelar variantes de ganancia de función (GOF) que son más difíciles de evaluar (hipermórficas, antimórficas, neomórficas).
    1. Seleccione un conjunto de controladores GAL4 para sobreexpresar los CDNAs humanos de interés. Una serie de controladores GAL4 ubicuos y específicos de tejido/etapa están disponibles en los centros de valores públicos (por ejemplo, BDSC), algunos de los cuales se utilizan con más frecuencia que otros. Primero se centran en los conductores ubicuos y fenotipos fácilmente quelables (letalidad, esterilidad, fenotipos morfológicos), luego pasar a los factores específicos del tejido y fenotipos más específicos.
      NOTA: Valide la expresión de controladores GAL4 con una línea de reportera (por ejemplo, UAS-GFP) para confirmar patrones de expresión antes de su uso en los experimentos.
    2. Expresar los CDNAs humanos de referencia y variante utilizando el mismo conductor bajo la misma condición (por ejemplo, temperatura) cruzando 3-5 hembras vírgenes de la línea GAL4 (por ejemplo, ey-GAL4 para la expresión de disco imaginaal ocular) con 3-5 moscas macho de las líneas UAS [por ejemplo, UAS-TBX2(+) o UAS-TBX2(p.R305H) para el ejemplo mostrado en la sección 4.2] en un solo vial.
      1. Transfiera las cruces cada 2-3 días para que muchos animales se edivinen de una sola cruz.
    3. Examine la progenie y detecte cualquier diferencia entre las cepas de referencia y variantes (por ejemplo, morfología ocular) bajo un microscopio de disección. Imagen de las moscas usando una cámara conectada a un microscopio de disección para documentar el fenotipo.
      NOTA: Si un fenotipo sólo se ve en la referencia pero no en la línea variante, entonces la variante puede ser un amorfo o un alelo hipomórfico fuerte. Si el fenotipo se ve en ambos genotipos pero la referencia causa un defecto más fuerte, entonces la variante puede ser un alelos hipomórfico de leve a débil. Si la referencia no muestra un fenotipo o sólo exhibe un fenotipo débil pero la variante muestra un defecto fuerte, entonces la variante puede ser un alelo GOF.
    4. Si un fenotipo no se ve en condiciones de cultivo estándar (RT o a 25 oC, establezca las cruces a diferentes temperaturas que ostan entre 18 y 29 oC, ya que se sabe que el sistema UAS/GAL4 es sensible a la temperatura64,65). Típicamente, la expresión de los transgenes UAS es mayor a temperaturas más altas.
  3. Realizar estudios funcionales adicionales relacionados con los genes y la proteína de interés.
    Nota: Además de examinar defectos generales, se puede seleccionar un sistema de ensayo para sondear las funciones moleculares del gen y la variante. En un ejemplo discutido en los resultados representativos (TBX2registros ERG se utilizaron para determinar los efectos de la variante en la función del fotorreceptor, ya que el gen de la mosca de interés (bifid) se ha estudiado extensamente en el contexto del desarrollo del sistema visual. Protocolos detallados para ERG enDrosophilase pueden encontrar como se publicó anteriormente66,67,68.
    1. Generar moscas para probar defectos funcionales en el sistema visual. Hembras vírgenes cruzadas de la línea Rhodopsin 1 (Rh1)-GAL4 a machos con transgenes cDNA humanos UAS de referencia o variante para expresar las proteínas humanas de interés en los fotorreceptores R1-R6.
      NOTA: Cruzar 3-5 hembras vírgenes a 3-5 moscas macho en un solo vial y transferir las cruces cada 2-3 días para tener muchos animales que econtean de una sola cruz. Todos los cruces deben mantenerse en una incubadora a la temperatura experimental para obtener resultados consistentes.
    2. Una vez que las moscas comiencen a cerrar (a 25 oC, 10 días después de establecer la cruz inicial), recopile la progenie (Rh1-GAL4/+; UAS-humano cDNA/+) en viales frescos y colocarlos de nuevo en el conjunto de la incubadora a la temperatura experimental durante 3 días adicionales para que el sistema visual madure.
      NOTA: Aunque ERG se puede realizar en moscas de 1-2 días de edad, las moscas recién cerradas pueden tener grandes fluctuaciones en su señal ERG. Si se desea examinar un fenotipo dependiente de la edad, estas moscas pueden envejecer durante varias semanas siempre y cuando se transfieran regularmente (por ejemplo, cada 5 días) a un vial nuevo para evitar ahogarse en alimentos húmedos.
    3. Preparar las moscas para la grabación ERG anestesiando primero las moscas usando CO2 o colocándolas en un vial sobre hielo. Pegue suavemente un lado de la mosca en un portaobjetos de microscopio de vidrio para inmovilizarlos.
      NOTA: Múltiples moscas de referencia y variantes se pueden pegar en una sola diapositiva. Coloque todas las moscas aproximadamente en la misma orientación con un ojo accesible para el electrodo de grabación. Tenga cuidado de no poner pegamento en el ojo y dejar la probóscía libre.
    4. Prepare los electrodos de grabación y de referencia. Coloque un capilar de vidrio de 1,2 mm en un tirador de agujay actívelo. Romper el tubo capilar para obtener dos electrodos cónicos afilados. Los electrodos resultantes deben ser huecos y tener diámetros finales de <0,5 mm.
    5. Llenar los capilares con solución salina (100 mM NaCl), asegurándose de que no haya burbujas de aire. Deslice los capilares de vidrio sobre el electrodo de alambre de plata (tanto el electrodo de grabación como el electrodo de referencia, consulte la Figura4) y fije los capilares en su lugar.
    6. Configure el estimulador y el amplificador. Una configuración detallada se puede encontrar en Lauwers, et al.67. La configuración de UDN Drosophila MOSC consta de equipos enumerados en la sección de materiales.
      1. Ajuste el amplificador a filtro de paso alto de 0,1 Hz, filtro de paso bajo de 300 Hz y ganancia de 100.
      2. Ajuste el estimulador a 1 s de período, 500 ms de ancho de pulso, retardo de pulso de 500 ms, modo de funcionamiento y 7 amperios.
      3. Prepare la fuente de luz para la fotoestimulación. Utilice una fuente de luz halógena para activar los fotorreceptores de mosca.
      4. Prepare el software de grabación en un ordenador conectado a la configuración de ERG. Cree un protocolo de estimulación con el modelo de adquisición "eventos de longitud fija" y 20 s de duración.
    7. Aclimatar las moscas a la oscuridad completa antes de iniciar grabaciones ERG. Coloque las moscas en completa oscuridad durante al menos 10 minutos antes de comenzar el experimento.
      NOTA: Dado que las moscas no pueden detectar la luz roja, utilice una fuente de luz roja durante el período de habituación oscura.
    8. Coloque la corredera que contiene las moscas en el aparato de grabación y mueva los micromanipuladores que llevan los electrodos de referencia y de grabación a un punto cercano a la mosca de interés en la diapositiva. Observe la punta del electrodo y coloque cuidadosamente el electrodo de referencia en el tórax de la mosca (penetrar en la cutícula). Una vez insertado el electrodo de referencia de forma estable, coloque el electrodo de grabación en la superficie del ojo.
      NOTA: La posición exacta de este electrodo de referencia no tiene un impacto importante en la señal ERG. El electrodo de grabación debe colocarse en la superficie del ojo ya que ERG es una grabación potencial de campo en lugar de una grabación intracelular. La cantidad adecuada de presión aplicada al electrodo de registro causa un pequeño hoyuelo sin penetrar en el ojo.
    9. Apague todas las luces durante otros 3 minutos para aclimatar las moscas al entorno oscuro.
    10. Configure el software de grabación e inicie la grabación de la señal. Si utiliza una fuente de luz halógena con obturador manual, encienda la fuente de luz con el obturador cerrado. Comience a grabar la señal.
    11. Exponga los ojos de la mosca a la luz abriendo y cerrando el obturador cada 1 s durante los 20 s de duración de una sola carrera.
      NOTA: El encendido/apagado de la fuente de luz halógena se puede controlar manualmente o programar para automatizarse mediante una fuente de luz LED blanca. El ERG más robusto y fiable se puede obtener mediante el uso de una fuente de luz halógena en comparación con un LED de luz blanca, probablemente debido al espectro de luz más amplio emitido por la fuente de luz halógena.
    12. Registre los ERG de todas las moscas que se montan en el portaobjetos de vidrio. Realizar ERGs de 15 moscas por genotipo por condición.
      NOTA: Algunos parámetros que se pueden modificar para encontrar una condición que muestre diferencias sólidas entre los CDNa de referencia y las variantes pueden incluir temperatura, edad o condiciones ambientales (por ejemplo, criados en ciclos de luz oscura o luz/oscuridad constantes).
    13. Realizar análisis de datos: compare los ERG de la referencia, la variante y los controles para determinar si hay diferencias. Evalúe los datos ERG en busca de cambios en los transitorios, la despolorización, los off-transients y la repolarización69 (Figura4B).
      NOTA: La despolarización y la repolarización reflejan la activación e inactivación de la cascada de fototransducción dentro de los fotorreceptores, mientras que las actividades de las células postsinápticas que reciben señales de los fotorreceptores. La disminución de la amplitud y la cinética alterada de la repolarización a menudo se asocian en defectos con la función y la salud del fotorreceptor, mientras que los defectos en los transitorios y de encendido se encuentran en mutantes con desarrollo, función o mantenimiento de sinapsis defectuosa 70.
    14. Tras la identificación de las diferencias en los fenotipos ERG con sobreexpresión de referencia frente a cDNa humanos variante, determinar si este fenotipo electrofisiológico está asociado con defectos estructurales y ultraestructurales en los fotorreceptores y sus sinapsis mediante la realización de análisis histológicos y microscopía electrónica de transmisión.
      NOTA: Se ha descrito previamente 69 se ha descrito previamente un debate adicional sobre la interpretación de los defectos del ERG y el análisis estructural/ultraestructural69.

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Resultados

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Estudio funcional de la variante de novo Missense en EBF3 Vinculado a Fenotipos de Neurodesarrollo
En un hombre de 7 años con fenotipos de neurodesarrollo incluyendo hipotonía, ataxia, retraso del desarrollo global y trastorno expresivo del habla, médicos y genetistas humanos en el Proyecto de Institutos Nacionales de Enfermedades No Diagnosticadas de Salud (UDP) identificó una variante de olfato de novo (p.R163Q) en EBF3 (Early B-Cell Factor 3)15, un...

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Discusión

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Los estudios experimentales con Drosophila melanogaster proporcionan un sistema de ensayo robusto para evaluar las consecuencias de las variantes humanas asociadas a la enfermedad. Esto se debe a la gran cantidad de conocimiento y diversas herramientas genéticas que han sido generadas por muchos investigadores en el campo de la mosca durante el siglopasado 89. Al igual que cualquier otro sistema experimental, sin embargo, es importante reconocer las advertencias y limitaciones que existen...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos a José Salazar, Julia Wang y a la Dra. Karen Schulze por la lectura crítica del manuscrito. Reconocemos a los Doctores Ning Liu y Xi Luo por la caracterización funcional de las variantes TBX2 discutidas aquí. El Centro de Detección de Organismos Modelo de la Red de Enfermedades No Diagnosticadas fue apoyado a través del Fondo Común de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (U54 NS093793). H. T. C. fue apoyado además por el NIH[CNCDP-K12 y NINDS (1K12 NS098482)], American Academy of Neurology (Neuroscience Research grant), Burroughs Wellcome Fund (Career Award for Medical Scientists), Child Neurology Society and Child Neurology Foundation ( PERF Elterman), y el Premio de La Independencia Temprana del Director de los NIH (DP5 OD026426). M. F. W. fue apoyado por la Fundación Simons (Premio SFARI: 368479). S. Y. fue apoyado además por el NIH (R01 DC014932), la Simons Foundation (Premio SFARI: 368479), la Asociación de Alzheimer (New Investigator Research Grant: 15-364099), Naman Family Fund for Basic Research, y Caroline Wiess Law Fund for Research in in Medicina Molecular. La microscopía confocal de BCM es apoyada en parte por NIH Grant U54HD083092 al Núcleo de Neurovisualización del Centro de Investigación de Discapacidades Intelectuales y del Desarrollo (IDDRC).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Drosophila Stocks para la transgénesis de ADNc UAS-humanoinyección
para la transgénesis (D. melanogaster)BDSC#24871Reactivo específico: VK33 (3er cromosoma) Línea de inyección
Cepas de inyección para la transgénesis (D. melanogaster)BDSC#24872Reactivo específico: VK37 (2º cromosoma) Línea de inyección
<> < vector >
clonaciónThermo Fisher#12536-017Reactivo específico: pDONR221
Drosophila vector de transgénesisRegalo de los Dres. Johannes Bischof y Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS)Reactivo específico: pGW-HA.attB
Kits y reactivos de biología molecular
AgaroseSigma-Aldrich#A2790Reactivo específico: Agarosa (grado de biología molecular)
Células químicamente competentes (E. coli)Thermo Fisher#18265017Reactivo específico: DH5α
Kit de extracción de gel de ADNReactivoespecífico #K210012: Kit de extracción de gel PureLink
Kit de aislamiento y purificación de ADNQiagen#27104Reactivo específico: QIAprep Spin Miniprep Kit
de polimerasa de alta fidelidadNEB#M0491Reactivo específico: Q5 Kit de polimerasa
Sistema de clonación mediado por recombinasaThermo Fisher#11789020Reactivo específico: Kit de clonasa Gateway BP
de clonación mediado por recombinasaThermo Fisher#11791100Reactivo específico: Kit de enzimas Gateway LR Clonasa II
Kit de mutagénesis dirigida al sitioAgilent#200523Reactivo específico: Kit de mutagénesis Quick Change
II electrorretinograma fuerte >
ERGDispositivos molecularesN/AReactivo específico: Axon pCLAMP 10 Data Paquete de software Recopilación
datos ERGLabX#R150358Reactivo específico: Amplificador biológico aislado ISO-DAM
Estimulador ERGAstro-Med#S48Reactivo específico: Estimulador de pulso cuadrado
fuerte fuerte Thermo Fisher Sistema fuerte de

Referencias

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