El siguiente procedimiento describe un método para el control espacial y temporal del inicio del tumor melanocítico en la piel dorsal murina, utilizando un modelo de ratón modificado genéticamente. Este protocolo describe el inicio de melanoma cutáneo macroscópico y microscópico.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Control espacial y temporal de la iniciación del melanoma murino a partir de células madre de melanocitos mutantes
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El melanoma cutáneo es bien conocido como el cáncer de piel más agresivo. Aunque los factores de riesgo y las principales alteraciones genéticas continúan documentándose con una profundidad cada vez mayor, la tasa de incidencia del melanoma cutáneo ha mostrado un aumento rápido y continuo durante las últimas décadas. Con el fin de encontrar métodos preventivos efectivos, es importante entender los primeros pasos de iniciación del melanoma en la piel. Los datos anteriores han demostrado que las células madre foliculares de melanocito (MCSC) en los tejidos de la piel adulta pueden actuar como células del melanoma de origen al expresar mutaciones oncogénicas y alteraciones genéticas. La tumorigénesis derivada de los MCSC propensos al melanoma puede inducirse cuando la MCSCs se transición de un estado inactivo al activo. Esta transición en MCSCs propenso al melanoma puede ser promovida por la modulación del estado de actividad de las células madre del folículo piloso o a través de factores ambientales extrínsecos como el ultravioleta-B (UV-B). Estos factores pueden ser manipulados artificialmente en el laboratorio por depilación química, lo que provoca la transición de las células madre del folículo piloso y MCSC de un estado inactivo a activo, y por la exposición UV-B usando una luz de sobremesa. Estos métodos proporcionan un control espacial y temporal exitoso del inicio del melanoma cutáneo en la piel dorsal murina. Por lo tanto, estos sistemas modelo in vivo serán valiosos para definir los primeros pasos del inicio del melanoma cutáneo y podrían utilizarse para probar métodos potenciales para la prevención de tumores.
Introducción
El melanoma, la forma maligna de los tumores melanocíticos, es el cáncer más agresivo en la piel con melanoma cutáneo responsable de la mayoría de las muertes por cáncer de piel1. En los Estados Unidos, el melanoma es comúnmente diagnosticado; se proyecta que es el tipo de cáncer más común de 5 a 6 entre los nuevos casos de cáncer estimados en 20182. Además, si bien las incidencias generales del cáncer han mostrado la tendencia de reducción gradual en las últimas décadas, las tasas de incidencia de melanoma cutáneo durante las últimas décadas demuestran un aumento continuo y rápido en ambos sexos
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los procedimientos en animales se realizan de acuerdo con el Comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad Cornell (IACUC).
1. preparación
-
Recoja los clips de la cola de los ratones postnatales de 12 días y digárelos en 400 μL de 0,05 N NaOH a 95 ° c durante 1 h. vórtice y añada 32 μL de Tris-HCl de 1 M, pH 7. Ratones de genotipo según protocolos de PCR proporcionados a través del laboratorio de Jackson e identifican ratones con genotipo de interés6.
- Tyr-pública – hemicigotos (+/CreER)
- LSL-BRAFV600E – heterocigotos (+/LSL-V....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El inicio del melanoma cutáneo inducido por depilación química
El procedimiento de depilación química se muestra en la figura 2. Cuando los ratones son de 7 semanas después del parto, su piel dorsal está en telógeno. Durante el telógeno, se sabe que las células madre del folículo piloso y los MCSC están en estado de reposo. La piel no debe mostrar un crecimiento significativo del ve.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Las alteraciones genéticas distintivas que se encuentran frecuentemente en tumores de melanoma cutáneo han sido bien descritas13. La mutación del conductor más dominante es BRAFV600E, y un modelo de ratón genéticamente diseñado para el melanoma de BRAFV600Emediado fue generado por el grupo Bosenberg14 y depositado en el laboratorio Jackson. Con este modelo de ratón, nuestro estudio reciente demostró el requisito de la activación celul.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no declaran ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la oficina del Subsecretario de defensa para asuntos de salud, a través del programa de investigación de cáncer de Peer revisado bajo el premio W81XWH-16-1-0272. Las opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones son las de los autores y no están necesariamente respaldadas por el Departamento de defensa. Este trabajo también fue apoyado por una subvención de semillas del programa de células madre de Cornell a A.C. White. H. Moon fue apoyada por el Cornell Center para el programa académico de genómica de vertebrados.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tamoxifeno | Sigma | T5648-1G | Para inyección sistémica |
| Tamoxifeno | Cayman Chemical | 13258 | Para inyección sistémica |
| Aceite de maíz | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
| 4OH-tamoxifeno | Sigma | H7904-25MG | Para tratamiento tópico |
| 26 G 1/2 "agujas | varias | Grado veterinario | |
| Jeringa de 1 mL | varios | Grado veterinario | |
| Recortadora de pelo para mascotas | Wahl | 09990-502 | |
| Crema depilatoria | Nair | n/a | Disponible en la mayoría |
| de las farmacias Hisopos de algodón | varios | ||
| Bombilla de luz ultravioleta | UVP | 95-0042-08 | modelo XX-15M Lámpara UV de rango medio |
| 200 prueba de etanol | varios | etanol puro | |
| Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | pellets de parafina |
| Formalina tamponada neutra, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | sustituto de xileno |
| O.C.T. Compound | Thermo 23730571 | ||
| Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | para Procesamiento FFPE |
| Criomoldes | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
| Molde de metal FFPE | Leica 3803082 | 24 mm x 24 mm | |
| Isoflurano | varios | ||
| de inhalación de anestesia | grado veterinario | varios | |
| Tijera | fina FST | 14085-09 | Recto, afilado/afilado |
| Tijera fina | FST | 14558-09 | Pinza recta, afilada/afilada |
| Metzenbaum | FST | 14018-13 | Pinza recta, roma/roma |
| FST | 11252-00 | Dumont #5 | |
| Pinza | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
| Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
| LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
| Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGA GTGATGAG | |
| Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAA ATCAGTGCG | |
| Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTTTTTTGTGGCAACTGC | |
| Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
| Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT AAGTCTGCA | |
| Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACT GTAGA | |
| Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
| Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
| Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
| tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
| tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
| tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
| tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |
Referencias
- Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force. The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
