Modelo robusto inducido por la ligatura de la periodontitis murina para la evaluación de los neutrófilos orales

La enfermedad periodontal (PD) es una afección osteolítica asociada a la morbilidad significativa del huésped y la carga económica, que se manifiesta por inflamación gingival y pérdida tanto de la unión de tejidos blandos como de soporte óseo para la dentición afectada^1,2,3,4. Este proceso se rige por interacciones entre la microbiota oral y el sistema inmunitario innato del huésped. También se asocia con la exacerbación de otras enfermedades inflamatorias sistémicas incluyendo diabetes, enfermedades cardiovasculares, y el cáncer^5,6,7,8. Históricamente, se hipotetizó que la patogénesis PD depende de grandes cantidades de bacterias específicas como Porphyromonas gingivalis⁹. Sin embargo, la evidencia reciente sugiere que el componente microbiano de la DP está mediado por el biofilm dental. El biofilm es una comunidad organizada y compleja de numerosos microorganismos que pueden existir en estados simbióticos sanos y destructivos^10,11. El biofilm oral normalmente ofrece resistencia al huésped al prevenir el establecimiento de focos de bacterias patógenas y promueve la estructura y función ideal del tejido gingival a través de la regulación de la respuesta inmune del huésped^12,13. Las perturbaciones de la relación de equilibrio entre los organismos comensales dentro de la cavidad oral y el sistema inmunitario huésped pueden dar lugar a alteraciones en la homeostasis tisular, lo que resulta en disbacteriosis y al desarrollo de las apariencias clínicas y radiográficas distintivas de PD^{5,10,12,13,14}.

Curiosamente, el establecimiento de una disbacteriosis oral, si bien es necesario para el inicio de la DP, no es suficiente para conducir la DP en todos los individuos, eludiendo hacia la capacidad de la respuesta inmune del huésped para subvertir la transición de la microbiota entre los estados simbióticos y disbióticos¹⁵. Esto pone un foco particular en los medios a través de los cuales la DP influye en uno de los principales caracteres del sistema inmunitario innato, a saber, el granulcito polimorfonuclear (PMN), o neutrófilo, desde perspectivas locales y sistémicas^16,17.

En los seres humanos, las PMN se reclutan de la circulación a una tasa de 2 x 10⁶ células/h en tejidos conectivos periodontales sanos, donde son la población predominante de leucocitos. Aquí, posteriormente son expulsados del sulcus gingival a la cavidad oral como un componente del líquido crevicular gingival. En presencia de DP, la neutrofilia se manifiesta dentro de la circulación y cavidad oral, donde estas células efectoras poseen un fenotipo hiperinflamatorio que conduce a la mencionada destrucción del periodontium^{17,18,19,20,21,22}. Por lo tanto, comprender el papel de las PMN en la DP y otras condiciones inflamatorias sistémicas es de suma importancia.

Aunque es ampliamente aceptado que las enfermedades crónicas están vinculadas recíprocamente a los datos sobre el rendimiento, los mecanismos subyacentes aún no se han aclarado, lo que contribuye a las dificultades en el manejo de estas condiciones sistémicas morbosas y potencialmente mortales. Múltiples modelos animales experimentales, cada uno con ventajas y desventajas únicas, se han utilizado para estudiar la fisiopatología de PD^23,24. Centrándose específicamente en los modelos murinos, existen una variedad de protocolos a través de los cuales se facilita el estudio de los datos sobre el rendimiento; sin embargo, poseen varias deficiencias técnicas y fisiológicas^{25,26,27,28,29,30,31}.

En primer lugar, el modelo de ratón gavage oral requiere numerosas inoculaciones orales de patógenos periodontales humanos para generar inflamación gingival y pérdida ósea. Además, generalmente está precedido por un período de tratamiento antibiótico para subvertir la flora oral commensal^25. Este modelo a menudo requiere entrenamiento especializado para realizar con seguridad el gavage oral, utiliza sólo una pequeña fracción de patógenos periodontales del microbioma oral humano más complejo, y requiere varios meses para establecer la pérdida ósea alveolar.

Por el contrario, los modelos murinos inducidos químicamente utilizan la administración oral de ácido sulfónico de trinitrobenceno (TNBS) o sulfato de dextrano sódico (DSS), agentes comúnmente utilizados en el establecimiento de modelos murinos de colitis durante un período de varios meses para inducir la pérdida ósea periodontal²⁶. Están disponibles modelos intraorales y extraorales basados en abscesos, que involucran los incisivos murinos y tejidos del dorso, así como calvario, respectivamente. En el antiguo modelo de absceso, se administran varias inyecciones de bacterias, creando múltiples abscesos gingivales y una escasez de pérdida ósea alveolar, limitando su uso en el estudio de la DP. Los últimos modelos de absceso son significativamente más aptos para estudiar la virulencia bacteriana, la inflamación y la resorción ósea en sitios fuera de la cavidad oral, lo que elimina la evaluación del periodontium y el microbioma oral^{27,28,29,30,31}.

Utilizando el modelo de periodontitis inducido por la ligadura, comúnmente se ha instalado una sutura de seda trenzada circunferencialmente alrededor del segundo molar. Como alternativa, se puede insertar un único segmento lineal de material de sutura entre el primer y segundo molares^32,33. El objetivo de la colocación de la ligadura es facilitar la acumulación bacteriana y generar disbiosis dentro del sulci gingival, lo que resulta en inflamación del tejido periodontal y destrucción de los tejidos que componen el periodontium. Más notablemente, este modelo es capaz de producir significativamente más pérdida ósea alveolar en comparación con el más comúnmente utilizado gavage oral modelo³⁴. Complicando aún más el uso del modelo de gavage oral es la resistencia natural de varias cepas de ratones (es decir, C57BL/6) al desarrollo de la pérdida ósea alveolar. Esto también es problemático, ya que esta cepa es la más utilizada en la investigación animal basada en murinos^35.

Los procedimientos existentes descritos por Marchesan et al. y Abe y Hajishengallis fueron ideados para simplificar el acto técnico de colocación de la ligadura^33,36. Desafortunadamente, el antiguo protocolo requiere equipos especializados impresos en 3D y poseen el potencial de pérdida prematura de ligaduras, aumentando así el uso de animales y los costos asociados con el tiempo adicional invertido en el quirófano. Además, ambos protocolos generan sólo pequeñas regiones del periodontium enfermo disponiblepara un estudio.

Las ventajas que se centran en esta técnica se basan en el estudio simultáneo de la disbiosis oral y la inmunología que rigen el periodontium, la utilización de animales de bajo costo con diversos orígenes genéticos, y prácticas simples de vivienda y cría. Como tal, los objetivos deben ser maximizar los volúmenes de tejido enfermo y, en los intentos de practicar los principios de reducción de la investigación animal, reducir el consumo de animales a un nivel lo más bajo posible. Esto requiere garantizar que todos los animales puedan ser incluidos en los análisis experimentales³⁷. Sin embargo, cabe señalar que no importa qué modelo animal de enfermedad periodontal se utilice, no hay un solo modelo que abarque todos los elementos de la fisiopatología humana de la PD.

Este nuevo protocolo emplea la colocación de una ligadura alrededor de múltiples dientes molares maxilares utilizando instrumentación y materiales que se encuentran en la mayoría de los laboratorios. Permite una cantidad suficiente de tiempo para instalar fácil y seguramente una ligadura que es poco probable que se avule prematuramente. Por último, a medida que las PMN coordinan la destrucción del periodontio en la DP, también se presenta una metodología novedosa para recuperar neutrófilos orales de una manera análoga a los seres humanos.

Todos los estudios murinos cumplieron con las regulaciones éticas pertinentes y fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Toronto y la Junta de ética de investigación (Protocolo 20011930).

1. Instalación de ligaduras

NOTA: Este es un procedimiento quirúrgico no estéril que se puede llevar a cabo en un quirófano estándar. El uso de animales libres de gérmenes (no cubiertos aquí) exige el manejo dentro de un gabinete de bioseguridad, el uso de instrumentos estériles, y la inoculación de la cavidad oral con patógenos periodontales para causar las manifestaciones clínicas de la periodontitis.

1. Administrar anestesia intraperitoneal a ratones C57BL/6 masculinos de 8-12 semanas de edad, que deben ser aclimatados a sus instalaciones de alojamiento, utilizando una aguja hipodérmica estéril de 0.5" 26 G y una jeringa de 1 ml de acuerdo con las pautas aprobadas del comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC).
   NOTA: Una combinación de ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) de anestésicos induce rápida y confiablemente el nivel adecuado de anestesia durante la duración del procedimiento.
2. Evaluar la profundidad anestésica antes y cada 15 minutos durante el procedimiento como lo demuestra la pérdida del reflejo del pedal.
3. Coloque el ratón sobre una plataforma quirúrgica calentada(Figura 1A). Estabilice el maxilar y la mandíbula en posición abierta utilizando bandas elásticas y apuntale el cuello con un rollo de algodón para ayudar a mantener el maxilar en una orientación más horizontal(Figura 1B). Cubra el cuerpo y la cola del animal para mitigar la pérdida de calor durante el procedimiento.
4. Coloque el microscopio quirúrgico en el aumento e iluminación deseados (si no se montan directamente en el microscopio) sobre la cavidad oral para la visualización de la dentición. Mientras que el aumento deseado depende del operador, la visualización óptima de la cavidad oral se obtiene a 16x.
5. Instale una sutura de seda trenzada 5-0 estéril alrededor de los primeros (M1) y el segundo (M2) molares maxilares dentro del sulcus gingival utilizando fórceps astillados.
   NOTA: Las suturas de seda trenzadas de un calibre más pequeño se pueden utilizar para este propósito para facilitar una instalación más rápida y reducir la posibilidad de daño de los tejidos blandos iatrogénicos.
   1. Coloque la cola distal de la sutura en el lado palatal de la dentición e inserte el segmento proximal entre el contacto de M2 y M3(Figura 2A).
   2. Envuelva la sutura alrededor de la superficie bucal de M2 e insértela entre el contacto de M1 y M2. Asegúrese de que ambos extremos de la sutura se tiren firmemente para conducir la sutura en el sulcus gingival y eliminar toda la holgura(Figura 2B).
   3. Envuelva el segmento de sutura proximal alrededor de M1, por debajo de su altura de contorno, e insértelo entre el contacto de M1 y M2. Tire de la cola proximal de la sutura firmemente para conducir la sutura en el sulcus gingival y eliminar toda la holgura(Figura 2C).
      NOTA: Si se observa resistencia al insertar la sutura entre M1 y M2 o M2 y M3, el contacto puede estar ligeramente abierto utilizando un explorador dental estándar.
   4. Ate los extremos de la sutura con el nudo de un cirujano y recorte las colas lo más cortas posible. Coloque el nudo en la abrazadera gingival entre M1 y M2 en el lado palatal de la dentición maxilar(Figura 2D).
      NOTA: Los pasos 1.4.1–1.4.4 se pueden repetir en el lado contralateral, si es necesario.
   5. Esterilice los instrumentos quirúrgicos en un esterilizador de perlas de vidrio caliente entre cada sujeto animal.
      ADVERTENCIA: Las puntas de los fórceps son extremadamente afiladas y pueden causar fácilmente traumatismos orales y sangrado significativo. Prepare pequeños segmentos de gasa para extraer sangre de la cavidad oral y aplique presión para sangrar activamente las heridas.
6. Después de la instalación de la ligadura, retire el ratón del aparato quirúrgico, colóquelo en una jaula limpia debajo de una lámpara de calor y monitoree hasta que esté completamente recuperado.
7. Almacene individualmente cada ratón con el enriquecimiento ambiental adecuado y permita el acceso ad libitum al agua filtrada y puré de comida estándar en un ambiente controlado por temperatura y humedad (12-h luz/12-h ciclo oscuro) durante 7-11 días.
   NOTA: La comida machacada disminuye las fuerzas necesarias para la masticación, lo que reduce el dolor asociado con la alimentación, y ayuda a prevenir la pérdida prematura de la ligadura instalada.

2. Recogida de muestras

1. Eutanizar ratones de acuerdo con las directrices aprobadas de la IACUC.
   NOTA: La eutanasia individual que utiliza una cámara de CO₂ seguida de la luxación cervical es el método preferido para este protocolo. Esto puede ser alterado dependiendo de los experimentos que requieren la cosecha de tejidos adicionales.
2. Con una pipeta, enjuague inmediatamente la cavidad oral con 100 ml de solución salina esterilizada de 4 oC 1x con fosfato (PBS) sin calcio y magnesio durante 10 s.
3. Repita el paso 2.2 2x y coloque cada enjuague en un único tubo de ensayo estéril de polipropileno cónico de 15 ml.
4. Transfiera el contenido a un tubo de ensayo estéril de polipropileno cónico de 50 ml ejecutándolos a través de un filtro de malla de nylon de 40 m.
5. Transfiera estos contenidos a un nuevo tubo de ensayo estéril de polipropileno cónico de 15 ml.
   NOTA: La transferencia final de la muestra a un tubo más pequeño permite una mejor visualización del pellet celular en los próximos pasos.
   1. Si lo desea, retire la ligadura(s) molar y colóquela en 300 ml de PBS esterilizado 1x (4 oC, sin calcio y magnesio) en un tubo de ensayo estéril de polipropileno cónico de 15 ml separado. Agitar suavemente y retirar la sutura del tubo. Esta muestra se trata de forma idéntica a la muestra de enjuague oral de este punto hacia adelante.
6. Añadir 33,3 l de 16% de paraformaldehído (PFA) para facilitar la fijación de la muestra.
7. Vortex las muestras inmediatamente e incubar sobre hielo durante 15 min.
8. Llene el tubo a 15 ml con 1 PBS para diluir pfa, luego centrífuga a 1000 x g y 4 oC durante 5 min.
9. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml de tampón de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) a 4 oC. Cuente las células en un hemocitómetro o contador de células automatizado.
10. Centrifugar la muestra de nuevo a 1000 RCF y 4 oC durante 5 min.
11. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en un volumen apropiado de tampón FACS para una concentración final de 0.5–1.0 x 10⁶ células/50 l de tampón FACS.

3. Tinción de anticuerpos para el análisis citométrico de flujo

NOTA: Etiquete y enfríe todos los tubos FACS necesarios antes de su uso.

1. Añadir 1 l de suero de rata y 2 l de anticuerpo antiratón IgG a 50 l de la muestra, vórtice inmediatamente y bloquear sobre hielo durante 20 min.
2. Agregue los anticuerpos apropiados a cada muestra, vórtice inmediatamente e incubar en hielo durante 30 minutos en la oscuridad.
   NOTA: La selección y los volúmenes de anticuerpos dependen de experimentos piloto de optimización previa adaptados a esta técnica específica.
3. Lavar las muestras con 1 ml de tampón FACS, vórtice brevemente y centrifugación durante 5 min a 1000 x g y 4 oC. Repita este paso 2x.
4. Resuspenda las muestras en un tampón de 250 oC, cubra los tubos con película de parafina, envuelva en papel de aluminio y sostenga a 4 oC hasta el análisis.
   NOTA: Es ideal analizar muestras en cuestión de horas después de completar el protocolo debido a la pérdida de señal fluorescente durante largos períodos de almacenamiento. Sin embargo, las muestras pueden ser analizadas 2-3 días más tarde si es absolutamente necesario.

Se proporcionan datos representativos de citometría de flujo a partir de muestras de enjuague oral de una ingenua(Figura 3A)e inflamadas(Figura 3B)cavidad oral murina secundaria a la periodontitis inducida por ligaduras. También se demuestra la recuperación de las PMN de una ligadura instalada(Figura 3C). Las tensiones de canal del citómetro de flujo se calibraron manualmente, y la compensación se realizó con perlas de compensación de un solo manchado. Los PMN se definieron como Ly6G+veF4/80-ve utilizando la estrategia de gating esbozada38. Se adquirieron un mínimo de 500 eventos de PMN cerrados de cada muestra de enjuague oral y ligadura. Se determinó que la viabilidad de la PMN era de aproximadamente el 37% mediante la tinción azul de tripa. Imágenes representativas de los niveles óseos alveolares medidos desde la cresta ósea alveolar (ABC) hasta la unión de cementoenamel (CEJ) para ratones sanos(Figura 4A)y ratones ligados(Figura 4B). Se proporcionan las diferencias relativas entre estas mediciones(Figura 4C).

Figura 1: Posicionamiento animal para ligadura molar. (A) El acceso a la cavidad oral se logra manteniendo la mandíbula en una posición deprimida colocando una tracción leve en la dentición del incisor maxilar y mandibular. (B) Gauze se coloca debajo del cráneo para evitar el movimiento de la cabeza y colocar el maxilar en una posición relativamente horizontal. El cuerpo y la cola están cubiertos para evitar la pérdida de calor antes de mover la etapa quirúrgica bajo el microscopio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Fotografía secuencial de la instalación de ligaduras. (A) La cola distal de la sutura se coloca en el lado palatal de la dentición, y el segmento proximal se inserta entre el contacto de M2 y M3. (B) La sutura se envuelve alrededor de la superficie bucal de M2 y luego se inserta entre el contacto de M1 y M2. (C) El segmento de sutura proximal se envuelve alrededor de M1 por debajo de su altura de contorno y luego se inserta entre el contacto de M1 y M2. ( D ) Losextremosde la sutura se atan con el nudo de un cirujano y se recortan lo más cerca posible del nudo. El nudo se coloca en la abrazadera gingival entre M1 y M2 en el lado palatal de la dentición maxilar. Todas las fotografías fueron adquiridas en maxilar diseccionado para registrar pasos de procedimiento con una vista despejada de la dentición molar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Gráficas REPRESENTATIVAs de FACS y estrategia de medición que demuestra la presencia de neutrófilos orales. Los neutrófilos fueron recuperados de las siguientes muestras y evaluados por citometría de flujo:(A) enjuague oral de un ratón ingenuo, (B) enjuague oral, y (C) ligaduras recuperadas de un ratón con periodontitis inducida por ligaduras (bilateralmente). Se muestran las gráficas de dispersión de estrategia de gating representativas. Singlets (SSC-H x SSC-W y FSC-H x FSC-W) y neutrófilos (Ly6G+ve/F480-ve) estaban bloqueados como se muestra. Los valores numéricos reflejan el porcentaje de celdas dentro de cada puerta. SSC-A - área de dispersión lateral; SSC-W - anchura de dispersión lateral; SSC-H - altura de dispersión lateral; FSC-A - área de dispersión hacia adelante; FSC-W - anchura de dispersión hacia delante; FSC-H - altura de dispersión hacia adelante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Diferencias de pérdida ósea alveolar entre animales de control y ligados. Fotos representativas que demuestran diferencias en la pérdida ósea alveolar entre (A) control y (B) ratones ligados. (C) Se muestran las mediciones desde la unión de cementoenamel (CEJ) hasta la cresta ósea alveolar (ABC), junto con los ángulos de línea mesiopalatal y distopalatal de M1 y M2 (media de SEM, n.o 3). Los valores P fueron determinados por ANOVA bidireccional con una prueba de LSD de Fisher post-hoc. (*p < 0.01; **p < 0.001; ***p < 0.0001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.