Se describe un método enzimático eficaz para el aislamiento de las células endoteliales aórticas porcinas primarias (pAEC) de los cerdos en miniatura. Los pAEC primarios aislados se pueden utilizar para investigar la respuesta inmunitaria y de la coagulación en el xenotrasplante.
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Artículo de método
Aislamiento y cultivo de células endoteliales aórticas primarias de cerdos en miniatura
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Resumen
Resumen
El xenotrasplante es una forma prometedora de resolver la escasez de órganos humanos para los pacientes con insuficiencia orgánica terminal, y el cerdo se considera como una fuente de órganos adecuada. El rechazo inmune y la coagulación son dos obstáculos importantes para el éxito del xenotrasplante. La lesión y la disfunción de la célula endotelial vascular (EC) son importantes para el desarrollo de las respuestas de inflamación y coagulación en xenotrasplante. Por lo tanto, el aislamiento de las células endoteliales aórticas porcinas (PAECs) es necesario para investigar el rechazo inmune y las respuestas de coagulación. Aquí, hemos desarrollado un enfoque enzimático simple para el aislamiento, caracterización y expansión de pAECs altamente purificados de cerdos en miniatura. En primer lugar, el cerdo en miniatura fue anestesiado con ketamina, y se extirpado una longitud de aorta. En segundo lugar, la superficie endotelial de la aorta fue expuesta a 0.005% solución digestiva de colágeno IV durante 15 min. En tercer lugar, la superficie endotelial de la aorta fue raspada en una sola dirección con un rascador celular (<10 veces), y no se comprimió durante el proceso de Raspado. Finalmente, los pAEC aislados del Día 3, y después del paso 1 y el pasaje 2, fueron identificados por citometría de flujo con un anticuerpo anti-CD31. Los porcentajes de células cd31 positivas fueron del 97,4% al 1,2%, del 94,4 % al 1,1% y del 92,4% al 1,7% (media de SD), respectivamente. La concentración de Colagenasa IV, el tiempo digestivo, la dirección y la frecuencia e intensidad del raspado son fundamentales para disminuir la contaminación por fibroblastos y obtener alta pureza y un gran número de CE. En conclusión, nuestro método enzimático es un método altamente eficaz para aislar las EF de la aorta de cerdo en miniatura, y las células se pueden ampliar in vitro para investigar las respuestas inmunitarias y de coagulación en el xenotrasplante.
Introducción
La escasez de órganos disponibles para trasplantes es un problema pendiente en todo el mundo1. Según la Cruz Roja de China, sólo un pequeño número de pacientes con insuficiencia orgánica en etapa terminal recibieron un órgano adecuado en China en 2018.
El xenotrasplante es una forma prometedora de resolver el problema de la escasez de órganos. Los órganos de cerdo son considerados los órganos másadecuados para los seres humanos debido a las similitudes anatómicas y fisiológicas 2,3. El fracaso de un xenoinjerto de cerdo está en gran medida relacionado con el rechazo inmune de primates y las respuestas de coagulación. Las células endoteliales porcinas (ECs) son críticas ya que estas células son las primeras en interactuar con el sistema inmunitario de primates, que incluye anticuerpos, complementos, citoquinas y células inmunitarias (por ejemplo, células T, células B y macrófagos)4,5. Las CE porcinas desempeñan un papel vital en el órgano de cerdo y el islotes xenotrasplante6,7. Por lo tanto, las CE son células importantes para investigar las respuestas de rechazo y coagulación a un injerto de cerdo. Se requiere aislamiento de eCs porcinas de alta calidad para la investigación de xenotrasplantes.
En intentos de aislar los ECs de diferentes órganos (por ejemplo, corazón, riñón, hígado y aorta), se han notificado varios protocolos en un entorno de xenotrasplante8,9,10,11,12. Sin embargo, mantener una cultura ultrapura de CE aislados es un problema excepcional en los protocolos estándar. El aumento de la concentración de la solución digerida, el tiempo dedigestión inapropiado y la intensidad del raspado pueden contribuir al aumento de la contaminación por fibroblastos en los estudios actuales 8,10,13. Además, el método de pAECs aislados de cerdos en miniatura está menos estudiado. Aquí, describimos un método enzimático optimizado para aislar pAEC altamente purificados de cerdos en miniatura (Wuzhishan o Bama). Se han diseñado varios pasos en el protocolo para reducir la contaminación por fibroblastos y obtener eCs de alta pureza.
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Protocolo
El uso de animales fue aprobado por el Comité de Revisión de La Etica del Shenzhen Segundo Hospital del Pueblo, de acuerdo con los principios del bienestar animal.
1. Preparación de animales, medianos y tampones
- Prepara el cerdo en miniatura.
NOTA: Todos los cerdos en miniatura eran cerdos chinos Wuzhishan o Bama (macho). La edad y el peso de los cerdos fueron de 100 días a 8 días y 5,7 kg a 1,0 kg (media de SD, n a 3), respectivamente. - Preparar el medio de cultivo: medio celular endotelial (ECM) complementado con 10% (v/v) suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), 1% (v/v) penicilina/estreptomicina (P/S) y 1% (v/v) suplemento de crecimiento de células endoteliales (ECGS).
- Preparar el tampón de lavado: 1 solución PBS (pH 7.4) con 1% (v/v) P/S.
- Preparar una solución digestiva iv de la colagenasa 0.005%: 1 mg de polvo de colagenasa IV en 20 ml de solución de PBS. Precalentar la solución digestiva de la colagenasa a 37 oC antes de la digestión.
- Preparar el tampón de parada: El medio de eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 10% de FBS inactivado por calor y 1% P/S.
2. Cirugía y preparación para el aislamiento de células endoteliales aórticas porcinas
- Desinfección del quirófano con luz UV durante 1 h y desinfectante médico 84 líquido (el contenido de cloro disponible es 4.0% - 5.0%, Tabla de Materiales)antes de realizar la cirugía.
- Después de que el cerdo en miniatura recibió una inyección intramuscular formada por 15 mg/kg de ketamina, 15 mg/kg de clorhidrato de xilazina y 0,05 mg/kg de clorhidrato de fenacetina ( Volúmenes: 100 oL/kg, Tabla de materiales) (Figura1A), confirman el estado de la anestesia con la comprobación del estímulo doloroso porcina (por ejemplo, pellizcar un oído o sacudir una extremidad anterior) y el índice fisiológico (por ejemplo, presión arterial, corazón y frecuencia respiratoria).
NOTA: Se podría administrar otra media inyección de dosis al cerdo si muestra los signos de despertar. - Cortar el abdomen con un bisturí, exponer la vena cava inferior y, en consecuencia, inyectar heparina sódica (5.000 U, Mesa de Materiales)en la vena cava inferior con jeringa de 5 ml.
- Cinco minutos más tarde, inserte un catéter en la aorta abdominal en la sangre, corte la piel del pecho e incise el diafragma con un bisturí y, posteriormente, corte el ventrículo izquierdo.
NOTA: Asegúrese de que el cerdo esté eutanasiado comprobando el pulso aórtico después de ensangrentar y cortando el corazón. - Exmarche las costillas con fórceps óseos (Tablade Materiales)y exponga el corazón y los pulmones. Encuentra la aorta posterior al corazón y los pulmones y sujeta los dos extremos. Lave la aorta una vez con tampón de lavado preenfriado (Figura1B,C).
- Corte la aorta con tijeras y mantenga la aorta sujeta en cada extremo. Exbote el exceso de tejido alrededor de la aorta con fórceps estériles y tijeras. Poner la aorta en un tubo centrífugo de 50 ml, lavar la aorta con tampón de lavado pre-enfriado 3x (30 ml por lavado) y transferir la aorta al laboratorio (Figura1D).
3. Aislamiento de células endoteliales aórticas porcinas
- En condiciones asépticas, retire la aorta de cerdo del tampón de lavado y colóquela en una placa Petri de 150 mm (Figura2A).
- Cortar suavemente los dos extremos de la aorta e extirpar el exceso de tejido alrededor de la aorta con fórceps estériles y tijeras de nuevo (Figura2B). Lavar el exterior y el interior de la aorta (sobre el plato de cultivo a temperatura ambiente) con 20 x 50 ml de tampón de lavado.
NOTA: Trate de cortar sólo el área donde se colocaron las abrazaderas durante la cirugía, ya que algunas UNIDAD de transporte cardioverses se dañaron en esta zona, y eliminar el exceso de tejidos y ramas laterales arteriales. - Pasar una sutura quirúrgica a través de la aorta y luego atar un extremo de la aorta usando la sutura quirúrgica (5-0, 90cm, Tabla de Materiales). Mantener la sutura quirúrgica en el interior de la aorta (Figura2C,D).
- Fije suavemente la aorta cerca del extremo atado con fórceps, y luego tire de la sutura quirúrgica lentamente para revertir la aorta hasta que la superficie endotelial de la aorta se exponga (Figura2E-G).
NOTA: Asegúrese de fijar la aorta cerca del extremo atado y no fijar la aorta firmemente, o de lo contrario la aorta no se puede revertir tirando de la sutura quirúrgica. - Lavar la superficie endotelial de la aorta con tampón de lavado 3x (10 mL por lavado) y luego deseche esta solución. Colocar la aorta en un tubo centrífugo de 15 ml y cubrir la aorta con 10 ml de 0,005% de solución digestiva de la colagenasa IV en el tubo (Figura2H).
NOTA: Precalentar la solución digestiva iv de la colagenasa al 0,005% a 37 oC antes de la digestión. - Incubar a 37 oC durante 15 minutos. Colocar la aorta digerida y la solución digestiva en un plato de cultivo de 100 mm y detener los efectos de la colatasa IV al añadir 10 a 15 ml de tampón de parada preenfriado.
NOTA: El tiempo de digestión recomendado es de entre 10 y 20 minutos. Asegúrese de que la superficie endotelial de la aorta esté cubierta por el tampón de parada. - Raspar suavemente los pAECs de la superficie interior de la aorta usando un rascador de celdas (Figura 2I). Lavar la aorta raspada 3x con tampón de lavado (5 ml por vez). Coloque la solución del plato de cultivo en un tubo centrífugo de 50 ml. Lave la parte inferior del plato de cultivo 2x con tampón de lavado (5 ml por vez) y vuelva a colocar la solución en un tubo centrífugo de 50 ml.
NOTA: Rasque suavemente en una dirección y no comprima. No toque el tejido cerca de los bordes y agujeros. Se recomienda raspar 5 a 8x. - Centrifugar el tubo a 600 x g durante 6 min a 4oC. Deseche el sobrenadante y deje 10 ml de solución en la parte inferior de un tubo centrífugo de 50 ml. Añadir 20 ml de tampón de lavado al tubo centrífugo de 50 ml y resuspender los pellets. Evite las burbujas durante este paso.
- Centrífuga a 600 x g durante 6 min a 4oC. Descarta lentamente el sobrenadante. Resuspender los pellets celulares con 1 ml de medio de cultivo y mezclar bien.
NOTA: El número medio obtenido de ECs por cm aorta es de 1,9 x 105 x 1,4 x 104 (media de SD, n a 3). - Cuente las celdas con un contador de celdas. Placa y cultivo de las células en un recipiente sin recubrimiento de ningún material de acuerdo con el número de celda. Si el número de celda es menor o igual que 1,0 x 106, las células de cultivo en un matraz de 25 cm2. Si el número de celda es mayor que 1,0 x 106, las células de cultivo en varios matraces de 25 cm2 (1,0 x 106 celdas por matraz). Colocar el matraz en una incubadora (sin agitar) a 37oC con 5% de CO2 y sustituir el medio cada 2 x 3 días.
NOTA: Algunas células están dañadas por el rascador de células. Un ensayo de viabilidad celular encontró que el porcentaje de células vivas era 95,7% a 1,7% (media de SD, n a 3). El tiempo de duplicación de las células aisladas es de aproximadamente 1 a 2 días.
4. Cosecha y caracterización de células endoteliales puras
- Deje que las células crezcan durante unos 4 a 5 días. Cuando las células alcancen el 80% de confluencia (Figura3A),digiere las células con 0.25% de trippsina y pasaje las células. Luego, recoja algunas de las células aisladas (Día 3, Pasaje 1 y Pasaje 2) e identifique por citometría de flujo (con un anticuerpo anti-CD31).
- Etiquetar pAEC aislados (número de celda: 1 x 105) (Día 3, Pasaje 1 y Pasaje 2) con anticuerpo conjugado anti-porcino CD31-fluoresceina isotiocianato (FITC) (10 l anticuerpo para por células de 100 l, manchado durante 30 min a 4 oC) para el análisis de citometría de flujo.
- Población de células vivas total escalonada con una gráfica dispersa hacia adelante, muestra sin mancha como un control negativo. A continuación, presente las celdas positivas CD31 de las celdas cerradas con histograma.
NOTA: La eficacia de las células con cm. con femhayación es del 97,4 % a 1,2 % (día 3), del 94,4 % al 1,1 % (P1) y del 92,4 % al 1,7 % (P2) (media de SD), respectivamente (figura 3B), respectivamente (figura3B).
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Resultados
Nuestro método tiene como objetivo proporcionar una manera eficaz de aislar los CO altamente purificados de las aortas de los cerdos en miniatura. El proceso de cirugía de aorta se muestra en la Figura1. El primer paso es que toda la aorta se extirpan del cerdo. La prevención de la contaminación bacteriana o celular es muy importante. Por lo tanto, no lesione otros órganos o tejidos en caso de que las células o bacterias no dirigidas contaminen la aorta, y lave la aorta con tampón de lavado ...
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Discusión
Las células endoteliales se utilizan comúnmente en la investigación de la disfunción vascular, diabetes, regeneración de tejidos, trasplante, y cánceres14,15,16,17,18. Para comprender y caracterizar la biología y la función de las CE en estas enfermedades, se han notificado numerosos métodos para aislar las CE de diferentes órganos o tejidos enfermos
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Guangdong, Número de Subvención/Premio: 2016A030313028; Fundación de Investigación Científica Médica de la Provincia de Guangdong, Número de Subvención/Premio: B2018003; Shenzhen Foundation of Science and Technology, Número de subvención/premio: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY2016029204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 y JCYJ201604281420409945; Shenzhen Longhua District Foundation of Science and Technology, Número de Subvención/Premio: 2017013; Programa Nacional Clave de I+D de China, Número de Subvención/Premio: 2017YFC1103704; Sanming Project of Medicine en Shenzhen, Número de subvención/premio: SZSM201412020; Fondos Especiales para la Construcción de Hospitales de Alto Nivel en la Provincia de Guangdong (2019); Fondo para la construcción de disciplina médica de alto nivel de Shenzhen, número de subvención/premio: 2016031638; Comisión de La Fundación de Salud y Planificación Familiar de Shenzhen, Número de Subvención/Premio: SZXJ2017021 y SZXJ2018059. Agradecemos a Hancheng Zhang y Zhicheng Zou de la Universidad de Shenzhen por ayudar en la preparación del manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO., Ltd. China | HL-YGQ | |
| Jeringa desechable BOON (10 ml) | Jiangsu Yile artículo médico Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC anticuerpo | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Raspador de células | Corning | 3010 # | |
| Colagenasa IV | Sigma-Aldrich | C5138 # -1G | |
| Inyección de ketamina compuesta | Fábrica farmacéutica veterinaria de Shenyang, China | Clorhidrato de ketamina ?0.3g / 2ml,Clorhidrato de xilacina:0.3g / 2ml, clorhidrato de fenacetina?1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052 # | |
| Microtubo Eppendorf Snap-Cap (1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Placa de cultivo celular | Corning | 353003# | |
| Suero fetal bovino | GIBCO | 10270-106# | |
| Pinzas Flowjo v10.0 | |||
| ShangHai instrumentos médicos Co., Ltd.China | |||
| Heparina sódica | Jiangsu WanBang biofarmacéutica Co., Ltd.China | ||
| Tintura de yodo | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Cerdo en miniatura (Bama o Wuzhishan) | Kang Yi Agricultura ecológica Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscopio | Guangzhou Tecnología de Micro-disparo Co., Ltd. | M152 | |
| (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicilina/Estreptomicina | Life Technologies | 15070063# | |
| Matraz de cultivo celular de cuello inclinado rectangular con tapa de ventilación ? ¿T25? | Corning | 3289# | |
| Tijeras | ShangHai instrumentos médicos Co.,Ltd.China | ||
| Pipetas de transferencia serológica (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Pipeta estéril Pasteur GeneBrick | GY0025# | ||
| Filtro de jeringa estéril (0.22µ m) | Millipore | SLGV033RS # | |
| Bisturí quirúrgico | ShangHai instrumentos médicos Co., Ltd.China | 22 # | |
| Sutura quirúrgica | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0 # | |
| Jeringa?5 ml? | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), rojo fenol | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Alcohol medicinal | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x solución de PBS (pH 7.4, libre de nucleasas) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Desinfectante médico 84 líquido | Provincia de Sichuan Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/botella |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
