Las interacciones de los factores de transcripción (TO) con el ARN polimerasa generalmente se estudian mediante ensayos desplegables. Aplicamos una tecnología Biolayer Interferometry (BLI) para caracterizar la interacción de GrgA con el ARN polimeraso clamítico. En comparación con los ensayos desplegables, BLI detecta la asociación y disociación en tiempo real, ofrece una mayor sensibilidad y es altamente cuantitativa.
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Artículo de método
Aplicación de la interferometría de Biolayer (BLI) para el estudio de las interacciones proteínas y proteínas en la transcripción
En este artículo
Resumen
Resumen
Un factor de transcripción (TF) es una proteína que regula la expresión génica mediante la interacción con el ARN polimerasa, otro TF y/o el ADN de la plantilla. GrgA es un nuevo activador de transcripción que se encuentra específicamente en el patógeno bacteriano intracelular obligatorio Clamydia. Los ensayos de extracción de proteínas con cuentas de afinidad han revelado que GrgA une dos factores de los mismos, a saber,66 y28,que reconocen diferentes conjuntos de promotores de genes cuyos productos son necesarios diferencialmente en las etapas del desarrollo. Hemos utilizado BLI para confirmar y caracterizar aún más las interacciones. BLI demuestra varias ventajas sobre el desplegable: 1) Revela asociación en tiempo real y disociación entre socios de unión, 2) Genera parámetros cinéticos cuantitativos, y 3) Puede detectar enlaces que los ensayos desplegables a menudo no detectan. Estas características nos han permitido deducir las funciones fisiológicas de la GrgA en la regulación de la expresión génica en la clamidia,y los posibles mecanismos de interacción detallados. Prevemos que esta tecnología relativamente asequible puede ser extremadamente útil para estudiar la transcripción y otros procesos biológicos.
Introducción
La transcripción, que produce moléculas de ARN utilizando el ADN como plantilla, es el primer paso de la expresión génica. La síntesis de ARN bacteriano comienza después de la unión de la holoenzima de ARN polimerasa (RNAP) a un promotor objetivo1,2. La holoenzima RNAP (RNAPholo) se compone de un núcleo catalítico multisubunidad (RNAPcore) y un factor de -, que es necesario para reconocer la secuencia promotora. Los activadores y represores de transcripción, llamados colectivamente TF, regulan la expresión génica a través de los componentes de unión del ARNPcore, los factores y/o el ADN. Dependiendo del organi....
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Protocolo
1. Preparación de proteínas
- Utilice una bolsa de diálisis (con un tamaño de corte adecuado) para dializar cada proteína que se utilizará para ensayos BLI (incluyendo el ligando con etiqueta His y el analito) contra 1.000 volúmenes del búfer BLI (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 10 mM MgCl2 , TDT de 0,1 mM, pH 8,0, preenfriado a 4oC) a 4oC durante 4 h.
NOTA: Los ensayos BLI requieren que el ligando esté presente en concentraciones que saturan los sitios de unión en el biosensor y el analito para ser altamente purificados de modo que se conozcan las concentraciones molares del analito que reaccionan con el ligando. Las metodologías para ....
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Resultados
A través de los ensayos de BLI, previamente establecimos que la unión de GrgA a28 euros depende de una región media de 28 aminoácidos (residuos 138-165) de GrgA15. En consecuencia, en comparación con N-terminally His-tagged Full length GrgA (NH-GrgA), una construcción de eliminación de GrgA que carecía de esta región (NH-GrgA-138-165) tuvo una tasa de asociación disminuida y una tasa de disociación creciente, lo que llevó a una pérdida de 3 millones de afinidad (Tabla 1.......
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Discusión
Las interacciones proteínas-proteínas son cruciales para la regulación de la transcripción y otros procesos biológicos. Se estudian más comúnmente a través de ensayos desplegables. Aunque los ensayos desplegables son relativamente fáciles de realizar, son poco cuantitativos y pueden no detectar interacciones débiles pero biológicamente significativas. En comparación, al detectar la asociación y disociación en tiempo real entre un ligando y un analito, BLI proporciona constantes de tasa de asociación y disociación, así co.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (Grants AI122034 y AI140167) y La Fundación de La Salud de Nueva Jersey (Grant - PC 20-18).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Máquina BLItz | ForteBio | 45-5000 | |
| Tubo de diálisis membrana de celulosa | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read bandeja de biosensor de Ni-NTA | ForteBio | 18-5101 | Biosensores de Ni-NTA listos para usar para proteínas marcadas con poli-His |
| Dropholder | ForteBio | 45-5004 | |
| Tubos de PCR (0,2 mL) | Thomas Scientific | ||
| Tubos de microcentrífuga (negro) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
Referencias
- Vvedenskaya, I. O., et al. Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).
- Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A.
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Reimpresiones y permisos
