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Artículo de método

Evaluación de la viabilidad celular y la muerte en cultivos esferoides 3D de células cancerosas

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DOI:

10.3791/59714

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16 de junio de 2019

 ,  , 
1Section for Cell Biology and Physiology, Department of Biology, Faculty of Science, University of Copenhagen

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos varios métodos simples para evaluar la viabilidad y la muerte en esferoides de células cancerosas 3D, que imitan los gradientes fisicoquímicos de los tumores in vivo mucho mejor que el cultivo 2D. El modelo esferoide, por lo tanto, permite evaluar la eficacia del fármaco oncológico con una mejor traducción a condiciones in vivo.

Resumen

Los esferoides tridimensionales de las células cancerosas son herramientas importantes tanto para las pruebas de análisis de drogas contra el cáncer como para obtener información mecanicista sobre la biología de las células cancerosas. El poder de esta preparación radica en su capacidad para imitar muchos aspectos de las condiciones in vivo de los tumores, al mismo tiempo que es lo suficientemente rápido, barato y versátil como para permitir un cribado relativamente alto. Las condiciones del cultivo esferoide pueden recapitular los gradientes fisicoquímicos en un tumor, incluyendo la creciente acidez extracelular, aumento de lactato, y disminución de la disponibilidad de glucosa y oxígeno, desde la periferia esferoide hasta su núcleo. Además, las propiedades mecánicas y las interacciones célula-células de los tumores in vivo son en parte imitadas por este modelo. Las propiedades específicas y, en consecuencia, las condiciones óptimas de crecimiento, de los esferoides 3D, difieren ampliamente entre diferentes tipos de células cancerosas. Además, la evaluación de la viabilidad celular y la muerte en esferoides 3D requiere métodos que difieran en parte de los empleados para cultivos 2D. Aquí describimos varios protocolos para la preparación de esferoides 3D de células cancerosas, y para el uso de estos cultivos para evaluar la viabilidad celular y la muerte en el contexto de la evaluación de la eficacia de los fármacos contra el cáncer.

Introducción

El uso de modelos de esferoides multicelulares en la biología del cáncer tiene varias décadas de edad1,2, pero ha ganado un impulso sustancial en los últimos años. En gran parte, esto refleja una mayor conciencia de cuán fuerte depende el fenotipo de las células cancerosas de su microambiente y de las condiciones específicas de crecimiento. El microambiente en tumores sólidos es fundamentalmente diferente del de los tejidos normales correspondientes. Esto incluye condiciones fisicoquímicas como pH, tensión de oxígeno, así como presión intersticial, gradientes de concentración de factores solubles como nutrientes, productos de desecho y compuestos de señalización secretados (factores de crecimiento, citoquinas). Además, incluye la organización de la matriz extracelular (ECM), las interacciones célula-célula y la señalización intercelular,y otros aspectos de la arquitectura tridimensional particular (3D) del tumor 3,4, 5,6. Las condiciones microambientales específicas en las que existen las células cancerosas afectan profundamente su perfil de expresión génica y sus propiedades funcionales, y está claro que, en comparación con el de las células cultivadas en 2D, el fenotipo de los esferoides 3D imita mucho más de cerca el de los tumores in vivo7,8,9,10,11. Los modelos 2D, incluso si emplean hipoxia, pH ácido y altas concentraciones de lactato para imitar aspectos conocidos del microambiente tumoral, todavía no capturan los gradientes de los parámetros fisicoquímicos que surgen dentro de los tumores, así como su tumor 3D Arquitectura. Por otro lado, los modelos animales son costosos, lentos y éticamente problemáticos, y en general, también tienen deficiencias en su capacidad para recapitular las condiciones tumorales humanas. En consecuencia, los esferoides 3D se han aplicado como modelo de complejidad intermedia enestudios de una amplia gama de propiedades de la mayoría de los cánceres sólidos 9,11,12,13, 14,15,16,17.

Un uso ampliamente empleado de esferoides 3D es en ensayos de detección de eficacia de la terapia contra el cáncer9,18,19,20. Las respuestas al tratamiento son particularmente sensibles al microambiente tumoral, lo que refleja tanto el impacto de la tortuosidad, la difusión restringida, la alta presión intersticial y el pH ambiental ácido en la administración de fármacos, como el impacto de la hipoxia y otros aspectos del microambiente en la respuesta a la muerte celular9,17. Debido a que el entorno dentro de los esferoides 3D desarrolla intrínsecamente todas estas propiedades7,8,9,10,11, el empleo de cultivos celulares 3D puede mejorar sustancialmente la traducción de los resultados a condiciones in vivo, sin embargo, permitir un cribado eficiente y asequible de alto rendimiento del crecimiento neto. Sin embargo, la gran mayoría de los estudios sobre la respuesta farmacológica de las células cancerosas todavía se llevan a cabo en condiciones 2D. Esto probablemente refleja que, mientras que algunos ensayos se pueden implementar relativamente fácilmente para cultivos celulares 3D, muchos, como ensayos de viabilidad, hincha occidental y análisis de inmunofluorescencia, se realizan mucho más convenientemente en 2D que en 3D.

El objetivo del presente trabajo es proporcionar ensayos fácilmente susceptibles y protocolos precisos para analizar el efecto del tratamiento con fármacos contra el cáncer en la viabilidad y supervivencia de las células cancerosas en un entorno de imitación de tumores 3D. Específicamente, proporcionamos y comparamos tres métodos diferentes para la formación de esferoides, seguidos de métodos para análisis cualitativos y cuantitativos de crecimiento, viabilidad y respuesta a fármacos.

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Protocolo

1. Generación de esferoides

  1. Preparación de suspensiones celulares para la formación de esferoides
    NOTA:     Diferentes líneas celulares tienen propiedades de adhesión muy diferentes y se debe establecer el protocolo de formación de esferoides más adecuado en cada caso. Hemos encontrado que las células MCF-7 y BxPC-3 son adecuadas para la formación espontánea de esferoides, mientras que MDA-MB-231, SKBr-3, Panc-1 y MiaPaCa requieren la adición de membrana de sótano reconstituida para formar con éxito esferoides. Solamente las células MDA-MB-231 y BxPC-3 se han empleado para el protocolo de caída colgante, sin embargo otras líneas celulares son ciertamente aplicables.
    1. Cultivar células como monocapa hasta 70-80% de confluencia.
    2. Lavar las células con solución salina tamponada de fosfato (1x PBS, 5 ml para un matraz de 25 cm2 o 10 ml para un matraz de 75 cm2), añadir la enzima disociación celular (0,5 ml para un 25 cm2 o 1 ml para un matraz de 75 cm2) e incubar las células durante 2-5 min a 37 oC en 5% CO2 y 95% de humedad.
    3. Compruebe el desprendimiento celular bajo un microscopio y neutralice la enzima disociación celular añadiendo medio de crecimiento (6-10% de suero dependiendo de la línea celular) a un volumen total de 5 ml en un 25 cm2 o 10 ml para un matraz de 75 cm2.
    4. Utilice una cámara de B-rker para contar las células y contar 8 cuadrados en la cámara por preparación celular para obtener una alta reproducibilidad del tamaño de los esferoides.
      NOTA: A continuación se presentan tres protocolos que describen un método diferente para la formación de esferoides. El protocolo 1.2 y 1.3 se puede utilizar para todos los protocolos analíticos posteriores presentados, mientras que el protocolo 1.4 es el más adecuado para la incrustación y los preparados de lisado. Dependiendo de la línea celular, la formación de esferoides toma 2-4 días, independientemente del método utilizado.
  2. Formación espontánea de esferoides
    1. Realice los pasos 1.1.1-1.1.4.
    2. Diluir la suspensión celular en un tubo de 15 ml para obtener 0,5-2 x 104 celdas/ml (es necesario determinar la densidad celular óptima para cada línea celular) (Figura1A (ii)).
    3. Llenar el anillo exterior de los pozos con 1x PBS o medio de crecimiento para reducir la evaporación de los pozos restantes. Transfiera la suspensión celular a un depósito estéril y, utilizando una pipeta multicanal, dispensar 200 l/bien en placas inferiores redondas de 96 pocillos (Figura1A (iii)).
    4. Incubar la placa en una incubadora a 37oC con 5% de CO2,95% de humedad.
    5. Cada 2-3 días adquieren imágenes microscópicas ligeras de los esferoides.
      NOTA: Las imágenes de este artículo se toman a 11,5x aumento, que es apropiado para la mayoría de los esferoides preparados utilizando estos protocolos.
    6. Cada 2-3 días (después de adquirir imágenes) reemplazar 100 s de medio (eliminar 100 sl del medio gastado y reemplazar con 100 s de medio fresco.
      NOTA: Para evitar la eliminación de esferoides al reemplazar el medio, es aconsejable inclinar la placa un poco mientras se retira lentamente el medio e inspeccionar el medio aspirado en las puntas en busca de esferoides visibles antes de desecharlo.
  3. Formación de esferoides mediadas por membrana del sótano reconstituido.
    NOTA:     Se utilizó la membrana de sótano reconstituida del factor de crecimiento reconstituido (rBM) libre de factor de crecimiento libre de lactosa deshidrogenasa (LDEV). rBM es sensible a la temperatura y siempre debe mantenerse en hielo, ya que coagulará si alcanza los 15 oC. Descongelar el rBM sobre hielo, ya sea durante la noche a 4 oC o 2-4 h a temperatura ambiente (RT) antes de enchapar.
    1. Descongelar rBM sobre hielo (ver Tabla de Materiales).
    2. Conservar las placas y los depósitos (si se envuelven individualmente) en hielo antes de su uso.
    3. Realice los pasos 1.1.1-1.1.4.
    4. Llenar el anillo exterior de los pozos con 1x PBS o medio de crecimiento para reducir la evaporación de los pozos restantes. Diluir la suspensión celular en un tubo de 15 ml para obtener 0,5-2 x 104 celdas/ml (es necesario determinar la densidad celular óptima para cada línea celular) (Figura1A (ii)).
    5. Coloque el tubo de 15 ml que contiene la suspensión de células diluidas sobre hielo (por ejemplo, en vaso de vidrio) (Figura1A (iia)).
    6. Transfiera las placas refrigeradas y los depósitos a la campana. Enjuague los recipientes de plástico, llénelos con hielo y transfieralos a la campana para permitir que las placas y depósitos se coloquen sobre hielo durante todo el procedimiento.
    7. Resuspenda el rBM suavemente para asegurar un gel homogéneo.
    8. Añadir 1-2% rBM (se debe determinar la concentración óptima para cada línea celular) a las suspensiones de células refrigeradas (Figura1A (iib)).
    9. Invierta el tubo de 15 ml para asegurar la mezcla adecuada de rBM y suspensión de celda antes de dispensar la suspensión en la placa.
    10. Transfiera la suspensión de la célula que contiene rBM a un depósito estéril y dispensar 200 l/bien en placas de fijación ultrabaja refrigeradas de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal (Figura1A (iii)).
      NOTA: Si se trabaja con varias suspensiones celulares (por ejemplo, más de una línea celular), es esencial dispensar cada suspensión celular inmediatamente después de la adición de rBM para prevenir el gelificación prematura.
    11. Centrifugar la placa durante 15 minutos a 750 x g utilizando "suave decente" /sin frenado (si es posible, centrifugar a 4 oC para mantener el líquido rBM más tiempo, pero no es un requisito para la formación exitosa de esferoides), para asegurar que las células se agrupan cuando el rBM se endurece, facilitando la formación de un solo esferoide.
    12. Incubar la placa en una incubadora (37oC, 5% CO2,95% de humedad).
    13. Cada 2-3 días adquiere imágenes microscópicas ligeras para evaluar el crecimiento esferoide.
    14. Cada 2-3 días reemplace 100 ml de medio (retire 100 ml y reemplácelo por 100 ml de medio fresco).
  4. Esferoides colgantes.
    1. Realice el paso 1.1.1-1.1.4.
    2. Diluir las células para obtener una dilución adecuada. Una dilución práctica es de 50.000 células/ml.
    3. Retire la tapa de un plato de cultivo celular de 10 cmy colóquelo para que esté mirando hacia arriba. Agregue 6 mL de 1x PBS al plato (Figura1B (i)).
    4. Vierta la suspensión celular en un depósito estéril y coloque cuidadosamente hasta 30 gotas de 40 s de suspensión celular en la tapa de la placa de cultivo celular utilizando una pipeta multicanal (Figura1B (ii)), lo que resulta en una concentración de 2.000 células/gota. Evite colocar las gotas demasiado cerca del borde de la tapa, ya que es más probable que estas gotas pierdan tensión superficial al invertir la tapa en el siguiente paso.
    5. Invierta la tapa en un movimiento rápido pero controlado y colóquela encima de la 1x plato de cultivo celular que contiene PBS (Figura1B (iii)).
    6. Colocar el plato en una incubadora a 37oC con 5% de CO2 y 95% de humedad sin perturbar las gotas y dejarlas crecer durante 4-6 días.
    7. Si se utiliza para los lysates proteicos o incrustaciones, esferoides de la piscina quitando la tapa e inclinándola, con el fin de lavar las gotas con 1 ml de medio calentado. Transfiera el medio resultante que contiene esferoides a un tubo de 1,5 ml y permita que se asienten en la parte inferior del tubo. Proceda como se describe en 4.4 y 6.2.2 para los lisatos proteicos y la incrustación, respectivamente.

2. Tratamiento farmacológico de esferoides

NOTA: El tratamiento farmacológico a largo plazo se puede aplicar a los esferoides con el fin de detectar los efectos de un medicamento de interés. Antes de iniciar el tratamiento farmacológico, es aconsejable realizar un experimento de respuesta a la dosis de los fármacos, con el fin de encontrar una dosis adecuada para el tratamiento experimental. Las dosis deben basarseen el IC 50 /Ki determinado de la droga y van desde alrededor de 0.2x-10x de este valor.

  1. Configurar 6-12 esferoides según la condición deseada como se describe en 1.2 o 1.3 y colocar en la incubadora (37 oC, 5% CO2, 95% de humedad) durante 2 días.
  2. El día 2, tome imágenes microscópicas ligeras de los esferoides.
  3. Preparar las primeras dosis de tratamiento (después de adquirir imágenes).
    NOTA: La primera concentración de tratamiento debe ser el doble de la concentración final deseada, ya que la solución se diluirá 1:2 ala adicional al pozo que contenga un medio de 100 ml. Intervalos de tratamiento de drogas sugeridos (dependerán de la vida media del medicamento): Día 2, 4 y 7.
  4. Con una pipeta multicanal, retire suavemente 100 ml de medio y reemplácelo por un medio que contenga 100 ml de fármaco.
  5. Vuelva a colocar la placa de 96 pocillos en la incubadora a 37oC con 5% de CO2 y 95% de humedad y repita 2,3 y 2,4 en los días de tratamiento elegidos, pero ahora sin duplicar la dosis para obtener la dosis final correcta.
  6. En el último día del programa de protocolo/tratamiento, se pueden realizar uno o varios de los siguientes ensayos.

3. Ensayo de viabilidad celular para esferoides

  1. Colocar 4-6 esferoides según la condición deseada como se describe en 1.2 o 1.3 y colocar en la incubadora a 37 oC con 5% co2 y 95% de humedad.
    NOTA: En este caso, el ensayo de viabilidad celular se realizó el día 7 o 9, después de haber monitoreado el crecimiento esferoide cada 2-3 días mediante microscopía ligera como se describió anteriormente (punto 1.2.5 y 1.3.13).
  2. Descongelar el reactivo de ensayo de viabilidad (ver Tabla de Materiales)y dejar que se equilibre a RT antes de su uso.
  3. Mezclar suavemente invirtiendo para obtener una solución homogénea.
  4. Antes de realizar el ensayo, retire el 50% del medio de cultivo de los esferoides (100 l).
  5. Añadir reactivo de viabilidad celular a cada pocal en una proporción de 1:3 a la cantidad de medio presente en el pozo (Figura2A (i)) Para una placa de 96 pocillos, añadir 50 sl de reactivo a 100 s l de medio.
  6. Mezclar el contenido vigorosamente durante 5 min para inducir la lisis celular (Figura2A (ii)).
  7. Incubar durante 25 minutos a RT para estabilizar la señal luminiscente (Figura2A (iii)).
  8. Registre la señal luminiscente (Figura2A (iv)).

4. Preparación de los lisiados proteicos para la blota occidental de cultivos esferoides 3D

NOTA: Al recoger los esferoides, es aconsejable utilizar una pipeta P200 y cortar el extremo de la punta para permitir una apertura más grande y por lo tanto una captura más fácil de los esferoides sin perturbar su estructura.

  1. Para cada condición, piscina un mínimo de 12, idealmente 18-24 esferoides (dependiendo del tamaño de los esferoides) en un tubo de 1,5 ml (evitar 2 tubos ml, ya que los siguientes pasos se volverán más difíciles debido a su fondo menos puntiagudo).
    NOTA: Si la cantidad de medio supera los 1,5 ml antes de haber recogido todos los esferoides, permita que los esferoides recogidos se asienten en la parte inferior (ocurre muy rápidamente, centrifugación no es necesaria) y deseche la mitad del volumen del tubo antes de continuar recogiendo el esferoides restantes.
  2. Coloque los tubos sobre hielo y deje que los esferoides se asienten en la parte inferior del tubo de 1,5 ml.
  3. Muévase del laboratorio de células estériles al laboratorio regular.
  4. Lave los esferoides dos veces en 1 ml de hielo frío 1x PBS. Deje que los esferoides se asienten antes de eliminar 1x PBS entre cada paso de lavado.
  5. Aspirar tanto 1x PBS como sea posible sin molestar o eliminar los esferoides.
  6. Añadir 5 l de tampón de lisis calentado (LB) con inhibidores de fosfatasa y proteasa, por esferoide (p. ej., 10 esferoides a 50 l de LB).
  7. Repetir intervalos de vórtice seguidos de girar hacia abajo hasta que se disuelvan los esferoides. Realizar un ciclo de vórtice durante 30 s seguido de centrifugación (un giro rápido usando una centrífuga de mesa es suficiente) durante 10 s durante aprox. 5-10 min dependiendo del tamaño y la compacidad de los esferoides.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Mantener los lisados a -20 oC hasta proceder con sonicación, homogeneización y determinación de proteínas como en un protocolo estándar de lisado de proteína 2D, seguido de la hincha occidental utilizando protocolos estándar.

5. Propidium Yodida (PI) Mancha de esferoides

  1. Colocar 3-6 esferoides por condición deseada como se describe en 1.2 o 1.3 y colocar en la incubadora a 37 oC con 5% co2 y 95% de humedad.
  2. En un laboratorio de cultivo celular estéril, calienta 1x PBS a 37oC.
  3. Hacer una solución de PI de 4 M diluyendo la solución de stock en 1x PBS: Diluir un stock acuoso de 1 mg/ml de PI 1:350 en 1x PBS.
    NOTA: Esta concentración se reducirá aún más a la mitad tras la adición de la solución a los pozos, dando una concentración final de 2 M. 100 l de esta solución para cada pocil que contenga un esferoide.
    PRECAUCION: El yoduro de propidium (PI) debe manipularse en una campana de humos y usar guantes. PI es sensible a la luz. Protéjase de la luz durante la manipulación.
  4. Retire 100 s del medio de cada pocal en la placa de 96 pocillos sin quitar las esferoides.
  5. Lavar el medio restante añadiendo 100 s de PBS 1x calentado a todos los pozos seguido de la eliminación de 100 ml del líquido en los pozos. Repita este paso de lavado 3 veces.
  6. Añadir 100 oC de la solución PI a cada pocal, cubrir la placa en papel de aluminio y colocarla en una incubadora a 37 oC con 5% de CO2 y 95% de humedad durante 10-15 min.
  7. Repita los 3 pasos de lavado descritos en 4.5 para lavar la solución de PI, con el fin de disminuir la señal de fondo al tomar imágenes.
  8. Utilice un microscopio de epifluorescencia para crear una imagen de los esferoides. Para evaluar la viabilidad de las células en el núcleo esferoide, tome pilas z para obtener imágenes con diferentes profundidades del esferoide.
    NOTA: Se recomienda un tamaño de paso de alrededor de 18-35 m entre cada rebanada dependiendo del tamaño de la esferoide, dando aproximadamente 11-18 pilas por esferoide. Las pilas Z se pueden procesar en ImageJ utilizando la función de proyección z, que puede combinar todas las pilas z en una imagen final, dando una visión general de la tinción en todo el esferoide (para más pautas sobre el uso de ImageJ para este propósito, ver (https://imagej.net/Z-functions).

6. Incorporación de esferoides 3D

  1. Preparar el gel de agarosa en el que están incrustados los esferoides (sólo es necesario realizar el protocolo por primera vez).
    1. Mezclar 1 g de bactoagar en 50 mL de ddH2O.
    2. Calentar lentamente en el horno microondas hasta que el bactoagar se haya disuelto y se haya formado un gel homogéneo. No deje que el gel hierva.
    3. Mantener el bactoagar caliente en un baño de agua a 60 oC.
    4. Manténgase a 4 oC entre los experimentos.
  2. Incrustación de esferoides.
    1. En el día 1, para cada condición, agrupa un mínimo de 12 esferoides en un tubo de 1,5 ml.
    2. Lavar una vez con 1 ml de hielo-frío 1x PBS.
    3. Para fijar los esferoides, agregue 1 ml de 4% de paraformaldehído.
      NOTA: El manejo del paraformaldehyde debe realizarse en una campana de humo.
    4. Déjalos incubar durante 24 h a RT.
    5. El día 2, calienta el gel de agarosa cuidadosamente colocándolo en un vaso de precipitados relleno de agua en un horno microondas. ¡Asegúrese de que el gel no hierva! Mantener caliente en una placa de calentamiento de sobremesa, a 60 oC hasta su uso.
    6. Lave los esferoides dos veces con 1 ml de hielo frío 1x PBS.
    7. Aspirar la mayor parte de los 1x PBS (dejando aproximadamente 100 l en este punto es práctico para el manejo de los esferoides).
    8. Prepare una pipeta de 20 ml cortando la punta de la pipeta en una pendiente para obtener una punta más puntiaguda con un agujero más grande (ver ilustración).
      NOTA: La siguiente parte debe hacerse rápidamente para asegurar una transferencia óptima de esferoides y para evitar la solidificación de la gota de gel. Si no hay ningún bloque de calentamiento disponible, se recomienda primero coger los esferoides y luego hacer que la agarosa caiga (es decir, cambiar el orden de los puntos 6.2.9 y 6.2.10).
    9. Haga una gota de gel de agarosa en una diapositiva del microscopio. Coloque la corredera en un bloque de calentamiento caliente para evitar que la agarosa se solidifique.
    10. Usando la punta de la pipeta modificada (ver 6.2.8), capture tantos esferoides como sea posible en un volumen de 15-20 l.
    11. Inyecte cuidadosamente el 15-20 l de esferoide que contiene 1pbS en el centro de la gota de gel de agarosa sin tocar la diapositiva del microscopio.
      NOTA: Este es un punto un poco difícil. Los esferoides se perderán si la punta de la pipeta toca la diapositiva del microscopio al inyectar los esferoides en la gota de gel. Es aconsejable practicar todo el proceso de hacer la gota de agarosa e inyectar los esferoides inyectando un líquido de color en la gota. Esto permitirá la visualización de una penetración potencial a través de la gota, ya que el líquido de color se filtrará sobre la diapositiva.
    12. Deje que el gel de agarosa se endurezca incubando durante 5-10 min a RT o a 4oC. Una vez que la gota de gel se haya solidificado un poco (pero todavía es bastante suave), empuje cuidadosamente la gota de gel del microscopio deslizarse en un casete de tejido plástico con un bisturí.
    13. Cubra los cassettes de tejido plástico en 70% de etanol.
      NOTA: En este punto, los esferoides se pueden utilizar directamente o almacenar durante meses.
    14. Incruste el esferoide incrustado en agarosa en parafina, en sección en diapositivas de capa de 2-3 m de espesor y mancha con hematoxilina y eosina o sujeto a tinción inmunohistológica.

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Resultados

Ensayos de crecimiento esferoide basados en el protocolo de formación de esferoides esquemáticamente ilustrado en la Figura 1A y la Figura 1B, se utilizaron como punto de partida para el análisis de los efectos de los tratamientos farmacológicos contra el cáncer en un tumor 3D imitando el ajuste. La facilidad con la que se forman los esferoides es específica de la línea celular, y algunas líneas celulares requieren la suplementa...

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Discusión

El uso de esferoides de células cancerosas 3D ha demostrado ser una herramienta valiosa y versátil no sólo para la detección de fármacos contra el cáncer, sino también para obtener información mecanicista sobre la regulación de la muerte de las células cancerosas y la viabilidad en condiciones que imitan a los del tumor Microambiente. Esto es particularmente crucial ya que la accesibilidad, la aceptación celular y los efectos intracelulares de los medicamentos quimioterápicos se ven profundamente afectados por las condic...

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Divulgaciones

Los autores no declaran conflicto de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos a Katrine Franklin Mark y Annette Bartels por su excelente asistencia técnica y a Asbjorn N-hr-Nielsen por realizar los experimentos en la Figura 1D. Este trabajo fue financiado por la Fundación Einar Willumsen, la Fundación Novo Nordisk y la Fundación Juchum (todas a SFP).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2-(4-amindiofenil)-1H-indol-6-carboxamidina (DAPI)Invitrogen# C10595 Para teñir núcleos
5-Fluorouracilo (5-FU)Sigma-Aldrich#F6627Componente en el tratamiento quimioterapéutico
5-(N-etil-isopropil) amilorida (EIPA)Life Technologies#E3111Inhibidor del anticuerpo NHE1
contra PARP y cPARPSeñalización celular#9542Utilizado en western blot
Anticuerpo contra Ki-67Señalización celular#9449Utilizado para IHQ
Anticuerpo contra la señalización celular p53 #2524 Se utiliza para IHC
Anticuerpo contra β-actinaSigma A5441Utilizado en Western blotting
BactoagarBD Bioscience#214010Utilizado para la preparación de gel de agarosa
Escalera de proteínas de referenciaInvitrogen#10747-012Utilizado para SDS-PAGE
Bio-Rad DC Protein Assay kitBio-Rad Laboratories500-0113, #500-0114, #500-0115   Se utiliza para la determinación de proteínas a partir de lisados
Bü cámara rkerMarienfeld610311Para el recuento de células 
Microscopio de eepifluoresión BX63OlympusSe utiliza para la obtención de imágenes fluorescentes
CellTiter-Glo 3D Cell Factability AssayPromega#G9681Se utiliza para el ensayo de viabilidad celular
CisplatinoSigma-Aldrich#P4394 Componente en el tratamiento quimioterapéutico
Microplaca esferoide Corning, 96 pocillos, negro con fondo redondo transparente,  Accesorio ultra bajo, con tapa, Cordón estéril#4520Se utiliza para el cultivo de esferoides con mediciones de luminiscencia como punto final
Pocillo Corning 96, fondo redondo transparente,  Microplaca de fijación ultrabaja, con tapa, Corning estéril#7007Suficiente para el crecimiento de esferoides sin mediciones de luminiscencia como punto final
Criterio TGX Geles prefabricadosBio-Rad5671025utilizado para SDS-PAGE
DoxorrubicinaAbcam#120629componente en el tratamiento quimioterapéutico
FLUOStar Optima Lector de microplacasBMG LabtechSe utiliza para registrar luminiscencia 
Formaldehído Productos químicos de VWR #9713.1000 Se utiliza para la fijación de células
Geltrex LDEV-Free Factor de Crecimiento Reducido Membrana Basal MatrizGibco#A1413202Mantener a 4 & grados; C para evitar la solidificación. Denominado rBM en el protocolo.
FBSSigma#F9665Suero inactivado por calor para medios de crecimiento
ImageJNIHScientific Análisis
de imágenes Casete Medim Uni-safeMedim Histotechnologie10-0114Se utiliza para el almacenamiento de esferoides incrustados Mini tabletas de
cóctel inhibidor de proteasaRoche Diagnostics GmBH # 11836153001Se utiliza para la preparación del tampón de lisis
Microscopio MZ16LeicaSe utiliza para imágenes microscópicas de luz
NuPAGE LDS 4x Sample Buffer Invitrogen#NP0007Utilizado para Western blot
Pierce ECL Western blotsubstrate Thermo scientific#32106Utilizado para Western blot
Ponceau SSigma-Aldrich#P7170-1LUtilizado para la tinción de bandas de proteínas
Prism 6.0GraphpadScientific Software gráfico y estadístico
Yoduro de propidio (solución de 1 mg/ml en agua)Invitrogen P3566Sensible a la luz 
Reservorios estériles, multicanalSPL lifesciences21002Utilizado para la siembra de células para la formación de esferoides
Superfrost Ultra-Plus Corredera de adhesión Menzel-Glä ser#J3800AMNZPortaobjetos de vidrio para microscopio utilizado para la inclusión de
TamoxifenoSigma-Aldrich#T5648Utilizado como tratamiento quimioterapéutico
Trans-blot Turbo 0.2 µ m membranas de nitrocelulosaBio-Rad#170-4159Utilizado para el Western blot
Tris/Glycine/SDS running buffer Bio-Rad #161 0732Utilizado para la solución SDS-PAGE
Trypsin-EDTASigma#T4174 Enzima de disociación celular
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Referencias

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