Artículo de método

Un soporte de muestra todo en uno para cristalografía de rayos X macromolecular con dispersión mínima de fondo

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DOI:

10.3791/59722

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6 de julio de 2019

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1Macromolecular Crystallography (HZB-MX), Helmholtz-Zentrum Berlin, 2Department Sample Environment, Helmholtz-Zentrum Berlin

En este artículo

Resumen

Se presenta un nuevo portamuestras para cristalografía de rayos X macromolecular junto con un protocolo de manipulación adecuado. El sistema permite el crecimiento de cristales, el remojo de cristales y la recopilación de datos de difracción in situ a temperatura ambiente y criogénica sin necesidad de manipulación o montaje de cristales.

Resumen

La cristalografía de rayos X macromolecular (MX) es el método más destacado para obtener conocimientos tridimensionales de alta resolución de macromoléculas biológicas. Un requisito previo para el método es que la muestra cristalina altamente ordenada debe ser cultivada a partir de la macromolécula a estudiar, que luego necesita ser preparada para el experimento de difracción. Este procedimiento de preparación normalmente implica la eliminación del cristal de la solución, en la que se cultivaba, el remojo del cristal en solución de ligando o solución crio-protectora y luego inmovilizar el cristal en un soporte adecuado para el experimento. Un problema grave para este procedimiento es que los cristales macromoleculares son a menudo mecánicamente inestables y bastante frágiles. En consecuencia, el manejo de estos cristales frágiles puede convertirse fácilmente en un cuello de botella en un intento de determinación de la estructura. Cualquier fuerza mecánica aplicada a tales cristales delicados puede perturbar el embalaje regular de las moléculas y puede conducir a una pérdida de poder de difracción de los cristales. Aquí, presentamos un nuevo soporte de muestra todo en uno, que ha sido desarrollado con el fin de minimizar los pasos de manejo de los cristales y, por lo tanto, para maximizar la tasa de éxito del experimento de determinación de la estructura. El soporte de muestra admite la configuración de gotas de cristal reemplazando los resbalones de la cubierta del microscopio de uso común. Además, permite la manipulación in situ del cristal, como el remojo de ligandos, la crioprotección y la formación compleja sin ninguna abertura de la cavidad de cristalización y sin manipulación de cristales. Por último, el portamuestras ha sido diseñado para permitir la recopilación de datos de difracción de rayos X in situ a temperatura ambiente y criogénica. Mediante el uso de este soporte de muestra, las posibilidades de dañar el cristal en su camino de la cristalización a la recopilación de datos de difracción se reducen considerablemente, ya que ya no se requiere el manejo directo del cristal.

Introducción

El conocimiento de la estructura tridimensional de las macromoléculas biológicas constituye una piedra angular importante en todas las investigaciones biológicas, bioquímicas y biomédicas básicas. Esto incluso se extiende a ciertos aspectos traslacionales de tales investigaciones, como por ejemplo el descubrimiento de fármacos. Entre todos los métodos para obtener dicha información tridimensional en la cristalografía de rayos X de resolución atómica se encuentra el más potente y el más prominente como lo demuestra el hecho de que el 90% de toda la información estructural disponible es aportada por los rayos X cristalografía1. El principal requisito previo de la cristalografía de rayos X, que es al mismo tiempo su principal limitación, es que los cristales de calidad difracción tienen que ser producidos y preparados para el experimento de difracción. Este paso sigue constituyendo uno de los principales cuellos de botella del método.

Históricamente, los datos de difracción de los cristales proteicos se recogieron a temperatura ambiente. Los cristales individuales se transfirieron cuidadosamente a los capilares de vidrio o cuarzo antes de la recogida dedatos, se añadió licor de madre a los capilares para que los cristales no se secaran y los capilares se sellaran 2,3, 4. Desde la década de 1980, se hizo cada vez más evidente que debido a las propiedades ionizantes de la radiación X y la inminente sensibilidad a la radiación de los cristales macromoleculares, la recolección de datos a temperatura ambiente plantea severas limitaciones en el método. En consecuencia, se desarrollaron enfoques para mitigar los efectos de los daños por radiación mediante el enfriamiento de cristales macromoleculares de hasta 100 K y para recopilar datos de difracción a tan baja temperatura5,6. Para trabajar a bajas temperaturas, el montaje de las muestras en capilares se volvió poco práctico debido a la baja tasa de transferencia de calor. A pesar de esto, hay esfuerzos en curso para utilizar también capilares, en particular de experimentos de cristalización de contradifusión, para trabajos de difracción a baja temperatura7,8, pero, independientemente de eso, se convirtió en el estándar enfoque en la cristalografía macromolecular para montar cristales macromoleculares sostenidos por una película delgada de licor madre dentro de un bucle delgado con cable9,10. A pesar de que una serie de mejoras (por ejemplo, la introducción de bucles litográficos y estructuras similares11)se han hecho a lo largo del tiempo a este montaje basado en bucle, los principios básicos que se desarrollaron a principios de la década de 1990 todavía están en uso hoy en día. Se puede afirmar con seguridad que la mayoría de las colecciones de datos de difracción en cristales macromoleculares hoy en día todavía se basan en este enfoque5.

Con el tiempo, hubo algunos nuevos desarrollos y modificaciones interesantes del método de montaje basado en bucles, pero estos enfoques hasta ahora no han sido ampliamente adoptados en la comunidad. Uno es el llamado montaje sin bucle de cristales, que fue desarrollado para lograr una dispersión de fondo más baja12,13,14. Otro es el uso de vainas de grafeno para envolver las muestras cristalinas y protegerlas del secado. El grafeno es un material adecuado en ese sentido debido a su muy bajo fondo de dispersión de rayos X15.

Más recientemente, los desarrollos en el campo de los soportes de muestra se centraron principalmente en la estandarización de los soportes con el objetivo de aumentar el rendimiento de la muestra16 o en el diseño de soportes, que pueden contener más de una muestra17,como por ejemplo membranas estampadas sobre un marco de silicio, que son capaces de contener cientos de pequeños cristales principalmente en el campo de la cristalografía en serie18,19,20,21,22.

Todos los métodos de montaje de muestras discutidos hasta ahora todavía requieren cierto grado de intervención manual, lo que significa que existe un peligro inherente de causar daños mecánicos a la muestra. Por lo tanto, se están buscando enfoques novedosos mediante la ingeniería del entorno de la muestra, de tal forma que los datos de difracción de los cristales puedan ser recogidos dentro de su entorno de crecimiento. Uno de estos métodos se denomina in situ o de detección de placas23,24 y ya se ha implementado en una serie de líneas de haz de cristalografía macromolecular en diversas fuentes de sincrotrón en todo el mundo25. Sin embargo, el uso de este método está limitado por los parámetros geométricos de la placa de cristal y el espacio disponible alrededor del punto de muestra del instrumento.

Sin embargo, otro enfoque se realiza en el llamado sistema CrystalDirect26. Aquí, las gotas de cristalización enteras se cosechan automáticamente. Las láminas sobre las que se han cultivado los cristales se cortan a medida con un láser y se utilizan directamente como portamuestras27.

En el trabajo descrito aquí, el objetivo era desarrollar un portamuestras, que permitiera al usuario mover la muestra cristalina de su cámara de crecimiento al dispositivo de recopilación de datos sin tocarlo y que permitiera al usuario manipular la muestra fácilmente. Dado que muchos investigadores en el campo de la cristalografía macromolecular todavía están utilizando el formato de cristalización de 24 pozos para optimizar el crecimiento de cristales mediante la modificación de las condiciones identificadas en grandes campañas de cribado, el nuevo portamuestras fue diseñado para ser compatible con este formato. A continuación, se describirá el diseño del nuevo portamuestras y se demostrará el manejo y el rendimiento del portamuestras para la recopilación de datos in situ y el remojo de ligandos. Por último, se discutirá la idoneidad de este nuevo portamuestras, así como sus limitaciones para las diversas etapas de trabajo.

Protocolo

ADVERTENCIA: Para todos los trabajos posteriores, es muy importante que la lámina de poliimida de color amarillo no se toque con los dedos sin protección, debido a posibles contaminaciones en el soporte de la muestra. Además, se recomienda encarecidamente el uso de fórceps protegidos.

1. El portamuestras

  1. Utilice uno de los tres tipos de soporte de muestra.
    NOTA: En la Figura 1se muestran tres versiones diferentes del nuevo portamuestras desarrollado. Todos ellos contienen una estructura de soporte de plástico negro, una lámina COC hermética en el exterior y una lámina de poliimida estructurada microporosa en el interior. El tipo 1 (figura1A) contiene un anillo de plástico exterior fijo, mientras que para los tipos 2 y 3 (figura1B,1C) el anillo exterior se puede romper mecánicamente en los puntos de interrupción respectivos designados para su uso en sistemas automatizados de transferencia de muestras (véase rojo flechas en la Figura 1B). El diseño de los portamuestras permite la configuración de múltiples gotas de cristalización en la lámina de poliimida amarilla. No compromete la supervisión del experimento de cristalización, ya que el material es altamente transparente para la luz visible. La lámina de poliimida de 21 m de espesor también cuenta con poros de 5 m, lo que permite una manipulación simple del cristal empapando más adelante. Dado que la transmisión de rayos X es cercana a 1,0 en absoluto las energías de recolección de datos de difracción comúnmente utilizadas en la cristalografía macromolecular, la contribución de la lámina a la dispersión de fondo en un experimento de difracción es insignificante28.

2. Configuración de gotas de cristalización

  1. Cree una superficie limpia y libre de polvo con un paño húmedo y libre de pelusas. Tome un portamuestras de su caja y colóquelo suavemente, papel de aluminio amarillo hacia arriba, sobre la superficie limpia para evitar daños o perforaciones no deseadas de la lámina COC de la parte posterior.
  2. Configure las gotas de cristalización con un volumen máximo recomendado de 2 l en la lámina amarilla, ya que se haría en diapositivas de cubierta de uso común. Coloque las gotas suavemente para evitar cualquier rotura o perforación de la lámina con una pipeta. En un soporte de muestra de tipo 1 (Figura2A) se pueden colocar hasta tres gotas, mientras que en los soportes de muestra de tipo 2 y 3 dos gotas son el máximo recomendado (Figura2C).
  3. Voltee el soporte de muestra y colóquelo en una cavidad preengrasada de una placa de estilo Linbro de 24 pocillos. Utilice las ayudas de posicionamiento (ver flechas rojas en la Figura 1A)del soporte de muestra para guiarlo a su posición óptima.
  4. Asegurar la posición correcta del portamuestras para evitar la evaporación no deseada (Figura2A).

3. Observación del crecimiento de los cristales

  1. Colocando la placa de cristalización bajo un microscopio de luz de transmisión, con o sin polarizadores, monitorizar el crecimiento del cristal sin ninguna perturbación del experimento (Figura4).
  2. Cuando utilice los portamuestras más pequeños de 18 mm de tipo 3 (Figura1C),que fueron diseñados para su uso en placas de huella SBS, utilice un robot de imágenes capaz de manipular placas de huella SBS para monitorear el crecimiento del cristal de una manera más automatizada.

4. Manipulación de cristal

NOTA: Se recomienda realizar todos los pasos posteriores bajo un microscopio de luz de transmisión.

  1. Cryo-protection
    1. Perfore suavemente la lámina exterior del COC con una cánula fina. Asegúrese de que la lámina amarilla interior permanezca intacta. La punción debe estar justo al lado de la caída que se va a manipular (Figura3A,3C).
    2. Utilice una mecha de papel fino e insértela en el orificio asomiado. Empuje con cuidado la mecha hacia adelante hasta que toque la lámina de poliimida amarilla. Mantenga la mecha en contacto con la lámina perforada. La mecha chupará todo el exceso de solución. El tiempo necesario para la eliminación completa del líquido depende de la viscosidad de las soluciones y de la composición del licor materno (Figura3B).
    3. Después de que todo el líquido se succione, retraiga suavemente la mecha de papel. Recuerde la posición de la gota, ya que puede no ser visible después de la eliminación del licor madre.
    4. Tome una pipeta estándar para aplicar un pequeño volumen de solución crioprotectora, máx. 3 l, utilizando una punta extruida (p. ej., una punta de carga de gel) a través del mismo orificio. Una vez dispensado el líquido, retraiga la punta. La porosidad de la lámina amarilla permite la difusión a través de la lámina. El tiempo para lograr la crio-protección de sus cristales depende en gran medida de la solución empleada y sus componentes.
    5. Para volver a sellar la lámina de COC autocurable, coloque suavemente un dedo protegido en el orificio durante aproximadamente 1 s y deslícelo a través de la punción. La ligera presión en combinación con la temperatura elevada promoverá el resellado de pinchazos, que no son demasiado grandes.
  2. Empapado de ligando

    NOTA: El exceso de licor materno se puede eliminar antes de remojar el ligando. Para ello, siga los pasos descritos en 4.1.1 a 4.1.3.
    1. Disolver el ligando en licor madre en la concentración deseada en un tubo de reacción.
    2. Gire la solución durante 10 minutos a 12.000 x g para eliminar partículas insolubles. Utilice una centrífuga con temperatura controlada si es necesario.
    3. Coloque suavemente un volumen de máx. 3 l de ligando que contiene solución en el espacio entre la lámina COC y la película de poliimida utilizando una punta de pipeta larga y extruida. Retira la punta.
    4. Para volver a sellar la lámina DE COC autocurable, coloque suavemente un dedo protegido en el orificio durante aproximadamente 1 s y deslícelo a través de la punción (véase también 4.1.5).
    5. Incubar el experimento durante algún tiempo para permitir la difusión a través de la membrana. El tiempo de remojo depende en gran medida de la viscosidad de la solución difusora y sus componentes29.
    6. Repita los pasos 4.2.1 a 4.2.5 varias veces para empapar posteriormente diferentes ligandos.

5. Recopilación in situ de datos de difracción a temperatura ambiente

NOTA: Para minimizar la dispersión de disolventes, elimine el exceso de solución antes de la recopilación de datos.

  1. Asegurar un ambiente de haz controlado por humedad estable con condiciones preestablecidas30.
  2. Levante suavemente la lámina CO transparente en el punto designado con fórceps y quítela como si una quitara la tapa de una taza de yogur (Figura 6B).
  3. Levante suavemente el soporte de muestra de su cavidad e insértelo inmediatamente en una base de soporte de muestra magnética pre-preparada. No se requiere pegamento para este paso (Figura6B).
  4. Aplique una presión suave para asegurar el posicionamiento correcto del soporte de la muestra dentro de la base.
  5. Monte el soporte de muestra en un goniómetro de línea de haz y asegúrese de que el soporte se ajuste correctamente. Dependiendo de la geometría del goniómetro, el soporte de muestra se puede girar hasta 160o sin causar sombras durante el experimento de difracción.
  6. Use una mecha de papel y toque suavemente el papel de poliimida amarillo de la parte posterior para eliminar el exceso de licor materno. Tenga en cuenta que en esa etapa el empapado de ligando o la crioprotección se puede realizar igual de bien. El ejemplo ya está listo para centrar y disuajar datos.
  7. Cuando utilice un portamuestras con anillo exterior extraíble, aplique una presión suave sosteniendo el anillo exterior y rompa en los puntos de rotura designados (Figura6C). El ejemplo ya está listo para centrar y disuajar datos.

6. Recopilación in situ de datos de difracción a temperatura criogénica

NOTA: Se recomienda eliminar el licor madre residual de la muestra realizando los pasos 4.1.1. a 4.1.3. antes de continuar con los siguientes pasos para minimizar la dispersión del disolvente. La mayoría de las muestras pueden transferirse a nitrógeno líquido sin una crioprotección previa31. Si se necesita crioprotección, consulte los pasos 4.1.1. a 4.1.5.

  1. Levante suavemente la lámina COC en el punto designado con un fórceps y quítela (consulte el paso 5.1.2) (Figura 6A).
  2. Saque el soporte de muestra de la cavidad y móntelo en una base de soporte de muestra magnética. Se puede aplicar una presión suave para garantizar un ajuste correcto y ajustado (ver paso 5.1.5, Figura 6B).
    NOTA: Los puntos de rotura designados simétricamente permiten una simple eliminación del anillo exterior del portamuestras aplicando una presión suave (véase el paso 5.1.8., Figura 6C). Ahora, el soporte de la muestra está listo y se puede sumergir en nitrógeno líquido. La geometría de los tipos de soporte de muestra 2 y 3 (Figura1B,1C) permite su transferencia a viales de muestra SPINE estándar, que se pueden utilizar para el montaje asistido por robot de muestras (Figura6D).

Resultados

El soporte de muestra tipo 1 ha sido diseñado para que se ajuste a un pozo de una placa de estilo Linbro de 24 pocillos. Cada soporte de muestra individual contiene ayudas de posicionamiento a ambos lados de la llanta exterior para garantizar un posicionamiento óptimo en el borde del pozo (Figura1A, Figura 2A). Se pueden colocar hasta tres gotas de cristalización individuales de volumen máximo de 2 l cada una sobre la lámina de poliimida amarilla (Figura2B). Para los portamuestras de los tipos 2 y 3, se recomienda establecer un máximo de dos gotas de volumen máximo de 2 l cada una. Se pueden instalar 24 portamuestras en una placa Linbro de 24 pocillos (Figura3D).

Se estableció un experimento de cristalización en una placa Linbro de 24 pocillos utilizando un soporte de muestra tipo 1. Se mezcló 1 l de solución de liszima de huevo blanco (15 mg/ml) con 1 l de licor materno que comprende 50 mM de NaAc pH 4,7, 500 mM de NaCl y 25% (p/v) PEG-6000 en la lámina de poliimida amarilla en el soporte de la muestra (Tabla 1). La caída se equilibra a 293 K contra 500 l de licor materno y se observaron cristales de la talla 40-50 m después de 5 horas (Figura4). El crecimiento del cristal se puede observar utilizando un microscopio de luz de transmisión (Figura4) con o sin un polarizador. Las películas de alta transparencia garantizan la mejor observación y monitorización de las condiciones de cultivo de cristalutilizante utilizando ambos, un microscopio de luz convencional o un sistema automatizado de imágenes de cristal. No se probó la observación del crecimiento del cristal con luz UV.

Después de retirar el licor materno de alrededor de los cristales, se tomó de la placa de cristalización un portamuestras con cristales de lisozima blanca de huevo de gallina y se colocó en una corriente de aire controlada por humedad en la línea de haz HZB-MX 14.332. Los datos de difracción se recopilaron a temperatura ambiente en incrementos de 1o utilizando un haz de 150 m a 13,8 keV de energía con 4 x 1010 fotones/s y un tiempo de exposición de 5 s por imagen. En la Figura 5se muestra una imagen de difracción típica. No se puede detectar dispersión de fondo elevada en la imagen de difracción. En el Cuadro 2se enumeran otros detalles experimentales, así como las estadísticas de tratamiento de datos asociadas.

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Figura 1 : Vista esquemática de los nuevos portamuestras. Los portamuestras consisten en un soporte de plástico negro, que está cubierto en el lado exterior con una lámina de copolímero de olefina cíclica amorfo (COC). Esta lámina (coloreada en azul) es altamente transparente y autorreparada. También garantiza la estanqueidad del gas del experimento. La lámina interna (coloreada en amarillo) está hecha de poliimida bio-inerte, que es altamente transparente para los rayos X. En este papel de aluminio, se pueden colocar las gotas de cristalización. El borde exterior del portamuestras contiene dos ayudas de posicionamiento indicadas por la flecha roja (panel A), que permite la colocación precisa del portamuestras en la cavidad preengrasada individual de la placa de cristalización. (A) Soporte de muestra (tipo 1) con diámetro de 22 mm con un anillo de soporte externo fijo. (B) Soporte de muestra (tipo 2) con diámetro de 22 mm con anillo de soporte externo extraíble. (C) Soporte de muestra (tipo 3) con diámetro de 18 mm con anillo de soporte externo extraíble. Estos dos últimos han sido desarrollados para usarlos de alto rendimiento con robots de montaje de muestras automatizados que utilizan el estándar SPINE. Los puntos de interrupción designados se resaltan con las flechas rojas del panel B. La flecha negra del panel C indica el marcador de posicionamiento. Los pasadores salientes en el perímetro exterior de la lámina amarilla son necesarios para alinear la lámina de poliimida durante el proceso de producción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2 : El soporte de muestra se puede utilizar en una placa Linbro de 24 pocillos de la misma manera que la cubierta del microscopio de uso común. Sella la cavidad hermética. Las ayudas de posicionamiento garantizan el posicionamiento correcto del portamuestras en la cavidad (flechas rojas en el panel A). Se pueden colocar hasta tres gotas individuales en un soporte de muestra de tipo 1 (panel B), mientras que el número máximo recomendado de gotas colocadas en un soporte de muestra de tipo 2 o 3 es de dos. El volumen máximo recomendado para cada caída es de 2 l. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3 : 24 soportes de muestra tipo 1 caben en una placa de 24 pocillos. Los portamuestras se pueden colocar en dos orientaciones en la placa de 24 pocillos indicada (panel D). Una cánula se utiliza para perforar la lámina posterior de COC con el fin de eliminar el exceso de licor de una gota de cristalización (paneles A y C) mediante el uso de una mecha de papel insertada suavemente en el mismo agujero (panel B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4 : Imagen de cristales de liszima de color blanco de huevo de gallina observada a través de un microscopio de transmisión equipado con un polarizador. Los cristales individuales se discriminan fácilmente de la solución proteica precipitada. Los cristales de esta imagen tienen un tamaño medio de 40 ám x 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

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Figura 5 : Una imagen típica de difracción de rayos X de un cristal de lisozima cultivado en el portamuestras. Antes de la exposición a las radiografías, todo el exceso de licor materno se eliminaba alrededor del cristal. Los datos de difracción se recogieron a temperatura ambiente en BL14.3 en el anillo de almacenamiento de electrones BESSY II32 utilizando un ambiente de muestra controlado por humedad con 97,5% de humedad relativa. No se puede observar ningún fondo elevado debido a los portamuestras. Las líneas discontinuas de la imagen indican los anillos de resolución. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6 : El portamuestras está preparado para la recopilación de datos de difracción. En primer lugar, la película COC se levanta suavemente mediante el uso de un fórceps y luego se despega (panel A). Posteriormente, el soporte de la muestra se retira de la cavidad y se inserta en el orificio central de una base magnética hasta que se indica mediante el marcador (panel B). Al aferrarse a la parte central, se aplica una presión suave al anillo exterior para liberar la parte central utilizando los puntos de interrupción designados dispuestos simétricamente (panel C). Después de la extracción, el portamuestras puede sumergirse en nitrógeno líquido y transferirse a viales SPINE estándar. Colocados, por ejemplo, en discos pueden ser transportados a sitios de sincrotron donde los robots automatizados de montaje de muestras los reconocen como muestras regulares (panel D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Detalles de cristalización
MétodoGota colgante, método de difusión de vapor
Tipo de placaPlacas SuperClear
Temperatura (K)293
Concentración de proteínas (mg mL-1)15
Composición de la solución del depósito50 mM NaAc pH 4,7, 500 mM NaCl, 25 % (p/v) PEG-6000
Volumen y relación de caída2 l en total, proporción de 1:1 (proteína : licor materno
Volumen del embalse500 l
Tiempo de incubación12 horas

Tabla 1: Detalles experimentales del experimento de cristalización descrito.

Recopilación y procesamiento de datos
Longitud de onda (a)0.89429
Temperatura (K)293
DetectorRayonix MX225 CCD
Distancia del detector de cristal (mm)120
Rango de rotación por imagen (o)0.5
Rango de rotación total (o)120
Tiempo de exposición por imagen (s)5
Grupo espacialP43212
Parámetros de celda de unidad (o)a 79,01, b a 79,01, c a 37,95
Mosacity (o)0.07
Intervalo de resolución (o)39.50 - 1.35 (1.37 - 1.35)
Número total de reflexiones191940 (8932)
Número de reflexiones únicas27020 (1292)
Completitud (%)99.88 (99.20)
Multiplicidad7.1 (6.9)
I/o/o de I/O medio (I)15,0 (1,9)
Rmeas35 (%)6.3 (107.0)
Rpim36 (%)2.4 (40.4)
CC1/237 99,9 (68,5)
ISa38 16.1
Factor B de Wilson (n.o2)17.0

Tabla 2: Estadísticas de recopilación y procesamiento de datos de difracción.

Discusión

Adecuación para experimentos de cristalización. Los nuevos portamuestras se pueden utilizar para experimentos de cristalización de gotas colgantes estándar utilizando placas de tipo Linbro de 24 pocillos (tipos 1 y 2), o placas de huella SBS de 24 pocillos en las que cada pocal tiene un diámetro de 18 mm (tipo 3). Se pueden utilizar en lugar de los resbalones de la cubierta del microscopio estándar. La lámina CÓrceca amorfa garantiza la estanqueidad del sistema. El monitoreo del experimento de cristalización es posible utilizando un microscopio de luz de transmisión, debido al uso de láminas de alta claridad. Hasta nuestro conocimiento, no existen otros portamuestras para placas de cristalización de 24 pocillos, lo que permitiría experimentos de manipulación o difracción de cristal, sin quitar mecánicamente el cristal de la gota, en el que se cultiva. Esto es de particular importancia, ya que muchos investigadores en el campo todavía confían en tales placas para la optimización de cristal, debido al hecho de que los volúmenes de gota más grandes se pueden utilizar en comparación con las placas de caída de 96 pocillos. Con estos volúmenes de caída más grandes, se pueden obtener cristales más grandes.

Adecuación para manipulación decristales. Debido a las propiedades de autorreparación de la lámina exterior de COC y la estructura microporosa de la lámina de poliimida amarilla interna, el entorno cristalino es accesible y los cristales se pueden manipular sin transferirlos mecánicamente a otros recipientes. Esto hace que los portamuestras sean muy convenientes. El único otro sistema que conocemos, que permite este acceso indirecto y suave al cristal, es el sistema CrystalDirect26. Sin embargo, CrystalDirect es menos flexible ya que se deben utilizar placas especiales de cristalización de 96 pocillos. La lámina, en la que los cristales están creciendo, es la misma que sella el experimento de cristalización y no es auto-curación. Esto significa que una abertura que ha sido perforada en la lámina por ablación láser para la entrega de ligando o crio-protector a los cristales permanecerá abierta, aumentando la posibilidad de evaporación líquida. Esto contrasta con nuestro diseño, donde los cristales no se expondrán directamente al medio ambiente, incluso si la lámina COC se perfora varias veces.

Adecuación para experimentos de difracción in situ a temperatura ambiente. El soporte de muestra se puede retirar de la placa de cristalización de una manera directa, pegado a una base magnética y poner en un goniómetro de línea de haz. Para un experimento de difracción a temperatura ambiente, es aconsejable poner la muestra en una corriente de aire de humedad definida33. El licor madre alrededor del cristal se puede retirar antes de poner el soporte de la muestra en el goniómetro con el fin de reducir la dispersión del fondo. Tal configuración es estable durante horas.

Adecuación del material utilizado para operación y almacenamiento a 100K. Ni el material utilizado para la producción del portamuestras ni la película de poliimida se ven afectados negativamente por enfriarlos a bajas temperaturas34. Por lo tanto, trabajar con el portamuestras a baja temperatura (por ejemplo, 100 K) no plantea un problema grave.

Adecuación para experimentos de difracción in situ a 100K. Para la recolección de datos a 100 K en una corriente de nitrógeno, el soporte de la muestra debe retirarse de la placa de cristalización como en el párrafo anterior, pegarse a una base magnética y colocarse en una corriente de nitrógeno gaseoso a 100 K en un goniómetro de línea de haz. Si se desea, la muestra también puede estar protegida contra crio, aunque es probable que para muestras desnudas esto no sea necesario en la mayoría de los casos31. Para experimentos a 100 K, los portamuestras tipo 2 y 3 son más adecuados porque el anillo de plástico exterior se puede quitar. Por lo tanto, son de menor tamaño y por lo tanto deben ser menos propensos a la guinda. Sin embargo, incluso se puede utilizar un portamuestras de tipo 1. Dada una humedad no demasiado alta en la cabaña experimental y una guinda del sistema crio-correcto del soporte no es realmente un problema.

Limitaciones. La geometría del portamuestras permite la recopilación de datos de difracción sin obstáculos mediante el método de rotación en un rango de rotación total de 160o. Esto es suficiente para que se puedan obtener conjuntos de datos de difracción completos para la mayoría de los sistemas de cristal. En los casos en que esto no sea posible, los datos de más de cristal deben fusionarse. Cuando los cristales se cultivan juntos, puede ser posible ajustar el tamaño del haz de rayos X incidente para que solo se expongan partes de cristales individuales. En casos extremos, es posible que sea necesario recurrir a una estrategia de recopilación de datos similar al enfoque35de MeshAndCollect. En resumen, si bien hay ciertas limitaciones asociadas con los tomadores de muestras, estas pueden superarse en la mayoría de los casos. Por supuesto, siempre es posible que se encuentren situaciones, en las que nada de esto es posible. En tales casos, uno puede necesitar recurrir a otros métodos de montaje de cristal.

Hemos descrito un novedoso tipo de portamuestras para la cristalografía macromolecular y hemos demostrado la idoneidad de los portamuestras para diversas aplicaciones. Teniendo en cuenta el manejo sencillo y reproducible de los cristales proteicos, así como las propiedades únicas de los portamuestras, creemos que estos portamuestras resultarán ser una adición valiosa al arsenal de portamuestras para los portamuestras Cristalografía.

Divulgaciones

Las solicitudes de patente relativas al titular de la muestra notificado han sido presentadas por Helmholtz-Zentrum Berlin con los siguientes números de registro y fechas de registro ante la Oficina Alemana de Patentes y Marcas: DE 10 2018 129 125.6, fecha de registro 20 de noviembre th, 2018; DE 10 2018 125 129.7,fecha de inscripción 11 de octubre de 2018; DE 10 2017 129 761.8, fecha de inscripción 13dediciembre de 2017. Se ha presentado una solicitud internacional de patente posterior por la vía del PCT, utilizando la prioridad de DE 10 2017 129 761.8, PCT/DE2018/101007. El registro de un modelo de utilidad con el número DE 20 2018106 955.1 se presentó el 6 de diciembre de 2018. El portamuestras ha sido puesto a disposición comercial bajo los nombres comerciales XtalTool y XtalTool/HT por Jena Bioscience, Jena, Alemania.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a BESSY II, operado por Helmholtz-Zentrum Berlin por el acceso y soporte de tiempo de haz, y a los departamentos de Sample Environment and Technical Design por su ayuda con el diseño y la construcción y el acceso a las instalaciones de impresoras 3D.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AF SatetissRS Components101-5738papel sin pelusa, distribuidor múltiple
CánulaDispomed Neoject25 G 5/8" 0.5 x 16, Ref:10026distribuidor múltiple
lámina COCHJ-Bioanalytik GmbH900360
Placa combinadaGreiner Bio-one / Jena Bioscience662050 / CPL-131placa preengrasada, distribuidor múltiple
Cryo VialesJena BioscienceCV-100
Eppendorf Research Plus Eppendorf31230000120.1 - 2.5 y micro; L volumen
Eppendorf TubosEppendorf 301251501,5 mL g-Safe Eppendorf Quality, número de referencia del fabricante
Pinzas UsbeckFisherScientific10750313
GELoader Eppendorf QualityEppendorf30001222extruidas  puntas (0,2 - 20 µ L), número de referencia del fabricante
CryoVialsmagnéticos Dimensión molecularMD7-402
Microfuge ThermoThermoFisher ScientificR21
Mechas de papeldental200064460Juego de mechas de papel, distribuidor múltiple
Rotiprotect Nitril-eco Carl RothTC14.1sin polvo, múltiple minorista SuperClear
PlatesJena BioscienceCPL-132placa preengrasada
UHU super glueUHU GmbH & Co KG45545número de referencia del fabricante, distribuidor múltiple
VeroBlackPlusAlphacamOBJ-40963 número dereferencia del fabricante
XtalTool Jena BioscienceX-XT-101juego de portamuestras
XtalTool HTJena BioscienceX-XT-103 / X-XT-104SPINE juego de portamuestras compatible
XtalToolBases JenaBioscienceX-XT-105 Juego debases de portamuestras magnético

Referencias

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