Amputación y regeneración de dígitos de ratón adultos: un modelo simple para investigar la formación de Blastema de mamíferos y la osificación intramembranosa

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo de amputación de falange terminal de ratón adulto para investigar la formación de blastema de mamíferos y la osificación intramembranosa, analizada por inmunohistoquímica fluorescente y tomografía microcomputada secuencial in vivo.

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo de amputación de falange terminal distal de ratón adulto (P3), un modelo de regeneración epimórfica de mamíferos procedimentalmente simple y reproducible, que implica la formación de blastema y la osificación intrammal inmunohistoquímica de fluorescencia y microtomografía microcomputada secuencial en vivo (CT). La regeneración de mamíferos se limita a las amputaciones que transectan la región distal de la falange terminal (P3); dígitos amputados a niveles más proximales no se regeneran y se someten a curación fibrosa y formación de cicatrices. La respuesta de regeneración está mediada por la formación de un blastema proliferativo, seguido de la regeneración ósea a través de la osificación intramembranosa para restaurar la longitud esquelética amputada. La amputación P3 es un modelo preclínico para investigar la regeneración epimórfica en mamíferos, y es una poderosa herramienta para el diseño de estrategias terapéuticas para reemplazar la curación fibrosa con una respuesta regenerativa exitosa. Nuestro protocolo utiliza inmunohistoquímica de fluorescencia a 1) identificar poblaciones de células blastema tempranas y tardías, 2) estudiar la revascularización en el contexto de la regeneración, y 3) investigar la osificación intramembranosa sin necesidad de hueso complejo dispositivos de estabilización. También demostramos el uso de imágenes secuenciales in vivo-CT para crear imágenes de alta resolución para examinar los cambios morfológicos después de la amputación, así como cuantificar los cambios de volumen y longitud en el mismo dígito en el transcurso de la regeneración. Creemos que este protocolo ofrece una enorme utilidad para investigar las respuestas regenerativas tanto epimórficas como tisulares en mamíferos.

Introducción

Los mamíferos, incluidos los humanos y los ratones, tienen la capacidad de regenerar las puntas de sus dígitos después de la amputación distal de la falange terminal (P3)^1,2,3. En ratones, la respuesta de regeneración depende del nivel de amputación; las amputaciones de dígitos cada vez más proximales muestran una respuesta regenerativa progresivamente atenuada hasta que el fallo regenerativo completo en las amputaciones transectantes y proximal a la matriz de uñas P3^{4,5,6 ,}

Protocolo

Todos los usos y técnicas de los animales estaban en cumplimiento con los procedimientos operativos estándar del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad A&M de Texas.

1. Adult Mouse Hind Limb Distal P3 Amputación

1. Anestetizar un ratón CD-1 de 8 a 12 semanas (Tablade Materiales)usando gas isoflurano en oxígeno; inicialmente anestesiar al 3% en una cámara, seguido de un 2% de isoflurano suministrado por un nosecone durante la duración de la cirugía. Aplique pomada oftálmica en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
   NOTA: Los estudios adultos de....

Resultados

Ratón adulto que regenera los dígitos P3 a 6/7 DPA (Figura2A-D), 9 DPA (Figura2E-H)y 10 DPA (Figura2I-L) fueron inmunomanchados con anticuerpos a Runx2, OSX y PCNA para visualizar hueso intrammalembranous regeneración e inmunostecadas con anticuerpos contra CXCR4 y vWF para visualizar la formación de blastema. Las representaciones representativas de los dígitos escaneados antes de l.......

Discusión

Este protocolo describe un procedimiento estandarizado de amputación disal de P3 de ratón adulto, tinción inmunohistoquímica fluorescente para visualizar e investigar la formación de blastema y la osificación intramembranosa, y escaneo secuencial en vivoCT para identificar los cambios morfológicos, de volumen y longitud óseas después de la amputación. La amputación P3 es un modelo único, procedimentalmente simple y reproducible para analizar un entorno de heridas pro-regenerativo que desencadena la formación de blastema........

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Protein Block Serum	Free DAKO	X0909	Listo para usar
Anticuerpo anti-PCNA de ratón	Abcam	ab29	dilución 1:2000
Rata anticuerpo anti-CXCR4	R& D Systems	MAB21651	dilución 1:500
Anticuerpo anti-humano vWF XIII	de conejo DAKO	A0082	Dilución 1:800
Anti-osterix de conejo, anticuerpo SP7	Abcam	ab22552	dilución 1:400
Anticuerpo anti-Runx2 de conejo	Sigma-Aldrich Co.	HPA022040	dilución 1:250
Alexa Fluor 647 conjugada cabra anti-ratón IgG (H+L)	Invitrogen	A21235	1:500
Alexa Fluor 488-conjugada cabra anti-conejo IgG (H+L)	Invitrogen	A11008	1:500
dilución Alexa Fluor 568-cabra conjugada anti-rata IgG (H+L)	Invitrogen	A11077	dilución 1:500
Reactivo	antidecoloración Prolong GoldInvitrogen	P36930	Listo para usar
Surgipath Decalicificador 1	Leica Biosystems	3800400	Listo para usar
Z-Fix, Fijador acuoso tamponado de formalina de zinc	Anatech LTD	174	Listo para usar
CD-1 Ratón Hembra	Envigo ICR	(CD-1)	8-12 semanas
vivaCT 40	SCANCO Medical

dilución