En este manuscrito, se presenta un protocolo para realizar la medición basada en FACS de la actividad transcripcional BK-polioomavirus mediante el uso de células HEK293T transcritas con un plásmido reportero bidireccional que expresa tdTomato y eGFP. Este método permite además determinar cuantitativamente la influencia de nuevos compuestos en la transcripción viral.
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Artículo de método
Medición de la actividad transcripcional impulsada por la región de control no codificante BK-polioomavirus a través de la citometría de flujo
En este artículo
Resumen
Resumen
Los poliomavirus, como el BK-poliomavirus (BKPyV), pueden causar patologías graves en pacientes inmunocomprometidos. Sin embargo, dado que actualmente no se dispone de antivirales altamente eficaces, se requieren métodos que midan el impacto de posibles agentes antivirales. Aquí, se construyó un reportero de doble fluorescencia que permite el análisis de la región de control no codificante BKPyV (NCCR) impulsada por la actividad promotora temprana y tardía para cuantificar el impacto de los posibles medicamentos antivirales en la expresión génica viral a través de tdTomato y eGFP Expresión. Además, mediante la clonación de los amplicones BKPyV-NCCR que en este protocolo se han obtenido ejemplarmente del ADN derivado de la sangre de pacientes trasplantados renales inmunocomprometidos, se puede determinar el impacto de los reordenamientos del NCCR en la expresión génica viral. Tras la clonación de los amplicons derivados del paciente, las células HEK293T fueron transinfectadas con los plásmidos del reportero y tratadas con posibles agentes antivirales. Posteriormente, las células fueron sometidas a análisis FACS para medir intensidades medias de fluorescencia 72 h después de la transfección. Para probar también el análisis de fármacos que tienen un potencial efecto inhibidor del ciclo celular, sólo se utilizan células transinfectadas y por lo tanto fluorescentes. Dado que este ensayo se realiza en células grandes que expresan el antígeno T, el impacto de la expresión temprana y tardía se puede analizar de una manera mutuamente independiente.
Introducción
Los poliomavirus representan una familia independiente de pequeños virus de ADN de doble cadena (ADN DSDNA) con el virus Simian 40 (SV40) como especie prototipo. La infección primaria ocurre principalmente durante la infancia, que generalmente procede nacones sin síntomas de la enfermedad y generalmente causan infecciones latentes en huéspedes inmunes competentes. El BK-polioomavirus (BKPyV) persiste principalmente en las células de los túbulos renales sin causar nefropatías, sin embargo, en caso de deterioro de la competencia inmunitaria después del trasplante renal, el virus puede reactivarse y causar daños graves e insuficiencia del injerto función al alcanzar una ....
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Protocolo
Este protocolo sigue las directrices de la investigación humana aprobadas por el comité ético de la facultad de medicina de la Universidad de Duisburg-Essen (14-6028-BO).
1. Recolección de muestras de sangre u orina y aislamiento del ADN del poliomavirus
- Recoger al menos 3 ml de sangre en tubos EDTA u orina en tubos de adquisición.
- Centrifugar la muestra a 2.500 x g durante 15 min. Si es necesario, pipetee el plasma en un tubo nuevo y almacene las muestras de plasma a 4 oC durante varios días o congele a -20 oC para un almacenamiento más largo.
- Preparar 40 ml de proteinasa K en un tubo de microcentrífu....
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Resultados
En este experimento representativo, la actividad transcripcional impulsada por la región de control no codificante BK-polioomavirus se midió a través de la citometría de flujo. Además, se probó la inhibición de la expresión génica temprana viral para tratar a los pacientes después de la reactivación del BKPyV. Con este fin, se utilizó un ensayo de doble fluorescencia-reportero como publicado anteriormente5. El esquema de flujo de trabajo general de la configuración.......
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Discusión
En este artículo, se presenta un método comúnmente utilizado que permite el análisis de la actividad de promotor estinúo no codificante (NCCR) impulsada por la actividad temprana y tardía del promotor. La actividad del NCCR se puede medir simultáneamente y no necesita lisis de las células transinfectadas. Además, se puede analizar un número relativamente grande de células y no es necesario la co-transfección de marcadores adicionales para la normalización de los valores de fluorescencia.
Una p.......
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Divulgaciones
Johannes Korth ha recibido subvenciones por honorarios de oradores y gastos de viaje de Astellas y Novartis. Marek Widera ha recibido honorarios de consultoría de Novartis. Oliver Witzke ha recibido subvenciones para estudios clínicos, honorarios de oradores, honorarios y gastos de viaje de Amgen, Alexion, Astellas, Basilea, Biotest, Bristol-Myers-Squibb, Correvio, Chiesi, Gilead, Hexal, Janssen, Dr. F. K-hler Chemie, MSD, Novartis, Roche, Pfizer, Sanofi y TEVA.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Barbara Bleekmann por su excelente asistencia técnica. Estos estudios fueron apoyados por el programa IFORES de la Facultad de Medicina de la Universidad de Duisburg-Essen y el programa RIMUR de la Alianza Universitaria Ruhr y Mercator Research Center Ruhr (MERCUR). Los autores agradecen a los J. Manchot-Stiftung por la beca de doctorado de Helene Sertznig y el apoyo constante. La recolección y el uso de material para pacientes ha sido aprobado por el comité de ética de la facultad de medicina de la Universidad Duisburg-Essen (14-6028-BO).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Escalera de 100 bp | NEB | N3231 | Cualquier escalera con un alcance de hasta 1 kb puede ser sustituida por |
| escalera de 2 troncos | NEB | N0550 | Cualquier escalera con un alcance de hasta 10 kb puede ser sustituida |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicilina Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun 2351744 | puede ser sustituido por cualquier fabricante | |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma 10236276001 | ||
| DFC450C módulo de cámara | Leica | Cualquier cámara puede ser utilizada | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | puede ser sustituida por cualquier fabricante |
| Microscopio DMIL LED | Leica | Cualquier microscopio de fluorescencia se puede utilizar | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | puede ser sustituido por cualquier fabricante |
| E.coli DH5alpha Células Competentes | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Cualquier FBS puede ser utilizado |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Cualquier software de citometría de flujo FBS puede ser utilizado | |
| Tinte de carga de gel, púrpura (6X) | NEB | B7024 | Cualquier colorante de carga 6x puede ser sustituido |
| HEK293T células | ATCC | 11268 | Estas células expresan constitutivamente el antígeno T grande del virus del simio 40 (SV40), y el clon 17 fue seleccionado específicamente por su alta transfectabilidad. |
| La incubadora de CO2 HERAcell® 240i | Thermo Scientific | puede ser sustituida por cualquier fabricante | |
| Kit de PCR HotStar | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel | Intas | Se puede utilizar cualquier sistema de visualización para geles de agarosa que contienen ADN teñido | |
| Melt Biozym | 850081 | puede ser sustituido por cualquier fabricante | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | puede ser sustituido por cualquier fabricante |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plásmido que alberga el genoma completo de la cepa BKPyV Dunlop; se utilizó como control positivo; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | producto descontinuado | Cualquier termociclador puede ser utilizado |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | puede ser sustituido por cualquier fabricante |
| PCR1 y PCR2 Primers | metabion | no aplicable | Desalado. Diluir a (10 µ M) con agua de grado PCR |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | puede ser sustituido por cualquier fabricante |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A tinción basada en fluorescencia para medir la concentración de dsDNA |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Tripsina 0.05% - EDTA | Gibco | 25300-054 | puede ser sustituido por cualquier fabricante |
| ZymoPURE II Plásmido Kit | Zymo | D4201 | puede ser sustituido por cualquier fabricante |
Referencias
- Drachenberg, C. B., et al. Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load. American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).
- Korth, J., et al.
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Reimpresiones y permisos
