Method Article

Medición de la actividad transcripcional impulsada por la región de control no codificante BK-polioomavirus a través de la citometría de flujo

DOI:

10.3791/59755

⸱

July 13th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, University of Duisburg-Essen, University Hospital Essen, 2Institute for Virology, University of Duisburg-Essen, University Hospital Essen, 3Center for Translational Medicine, Medical Department I, Marien Hospital Herne, University Hospital of the Ruhr-University of Bochum, 4Department of Infectious Diseases, University of Duisburg-Essen, University Hospital Essen Hufelandstr

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este manuscrito, se presenta un protocolo para realizar la medición basada en FACS de la actividad transcripcional BK-polioomavirus mediante el uso de células HEK293T transcritas con un plásmido reportero bidireccional que expresa tdTomato y eGFP. Este método permite además determinar cuantitativamente la influencia de nuevos compuestos en la transcripción viral.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los poliomavirus, como el BK-poliomavirus (BKPyV), pueden causar patologías graves en pacientes inmunocomprometidos. Sin embargo, dado que actualmente no se dispone de antivirales altamente eficaces, se requieren métodos que midan el impacto de posibles agentes antivirales. Aquí, se construyó un reportero de doble fluorescencia que permite el análisis de la región de control no codificante BKPyV (NCCR) impulsada por la actividad promotora temprana y tardía para cuantificar el impacto de los posibles medicamentos antivirales en la expresión génica viral a través de tdTomato y eGFP Expresión. Además, mediante la clonación de los amplicones BKPyV-NCCR que en este protocolo se han obtenido ejemplarmente del ADN derivado de la sangre de pacientes trasplantados renales inmunocomprometidos, se puede determinar el impacto de los reordenamientos del NCCR en la expresión génica viral. Tras la clonación de los amplicons derivados del paciente, las células HEK293T fueron transinfectadas con los plásmidos del reportero y tratadas con posibles agentes antivirales. Posteriormente, las células fueron sometidas a análisis FACS para medir intensidades medias de fluorescencia 72 h después de la transfección. Para probar también el análisis de fármacos que tienen un potencial efecto inhibidor del ciclo celular, sólo se utilizan células transinfectadas y por lo tanto fluorescentes. Dado que este ensayo se realiza en células grandes que expresan el antígeno T, el impacto de la expresión temprana y tardía se puede analizar de una manera mutuamente independiente.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los poliomavirus representan una familia independiente de pequeños virus de ADN de doble cadena (ADN DSDNA) con el virus Simian 40 (SV40) como especie prototipo. La infección primaria ocurre principalmente durante la infancia, que generalmente procede nacones sin síntomas de la enfermedad y generalmente causan infecciones latentes en huéspedes inmunes competentes. El BK-polioomavirus (BKPyV) persiste principalmente en las células de los túbulos renales sin causar nefropatías, sin embargo, en caso de deterioro de la competencia inmunitaria después del trasplante renal, el virus puede reactivarse y causar daños graves e insuficiencia del injerto función al alcanzar una viremia alta (1 x 104 copias de ADN BKPyV/ml)1,2. En aproximadamente el 10% de los receptores de trasplante de riñón, la reactivación del BK-poliomavirus (BKPyV) da como resultado una nefropatía asociada al poliomavirus (PyVAN), que se asoció hasta un 80% con un alto riesgo de fallos de aloinjerto renal3,4 . Dado que no se dispone de agentes antivirales aprobados, el tratamiento actual se basa en la reducción de la inmunosupresión. Curiosamente, inhibidores de mTOR parecen tener un efecto antiviral; por lo tanto, cambiar la terapia inmunosupresora a la inmunosupresión basada en mTOR podría representar un enfoque alternativo para prevenir la progresión de la viremia BKPyV5,6,7. Sin embargo, el mecanismo antiviral basado en mTOR todavía se entiende incompletamente. Por lo tanto, se requieren métodos que midan el impacto de posibles agentes antivirales en concentraciones clínicamente relevantes.

El genoma circular del BKPyV consiste en aproximadamente 5 kb que albergan una región de control no codificante (NCCR) que sirve como origen de la replicación y concomitantemente un promotor bidireccional que impulsa la expresión de transcripciones de ARNm de fase temprana y tardía. Dado que los reordenamientos, deleciones y duplicaciones del NCCR de origen espontáneo se encuentran en el BKPyV8 patógeno y se acumulan significativamente en pacientes que sufren de PVAN 5,9, una comparación de arquetípicos (wt) y re-arreglado (rr) Las actividades del NCCR son útiles para caracterizar la aptitud replicativa viral.

Como se resume en la Figura 1, este protocolo describe un método comúnmente utilizado para medir la actividad transcripcional BKPyV NCCR cuantificando la fluorescencia de dos fluoróforos tdTomato y eGFP expresadas a partir de un reportero plásmido5, 9,10,11. El procedimiento se realiza en presencia del antígeno T grande SV40 (lTAg), que permite analizar el impacto de los posibles agentes antivirales en la actividad temprana y tardía del NCCR por separado5. Este ensayo analiza más a fondo el impacto de los reordenamientos en la actividad del NCCR y la comparación con los WT-NCCRs5,9. El plásmido reportero alberga la señal de poliadenilación tardía SV40 aguas abajo de cada marco de lectura abierto de fluoróforo para asegurar un procesamiento comparable y eficiente de ambas transcripciones para tdTomato y eGFP, respectivamente. En comparación con los métodos basados en qRT-PCR5,12, este enfoque basado en FACS representa una alternativa compatible de bajo costo y alto rendimiento, ya que no hay protocolos de extracción complicados para el cultivo celular infectado y no costoso se necesitan anticuerpos para la tinción de fluorescencia inmune. Además, dado que una cantidad definida de células fluorescentes se analizan a través de la citometría de flujo, el análisis de los agentes inhibidores del ciclo celular también es posible de manera cuantitativa.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo sigue las directrices de la investigación humana aprobadas por el comité ético de la facultad de medicina de la Universidad de Duisburg-Essen (14-6028-BO).

1. Recolección de muestras de sangre u orina y aislamiento del ADN del poliomavirus

  1. Recoger al menos 3 ml de sangre en tubos EDTA u orina en tubos de adquisición.
  2. Centrifugar la muestra a 2.500 x g durante 15 min. Si es necesario, pipetee el plasma en un tubo nuevo y almacene las muestras de plasma a 4 oC durante varios días o congele a -20 oC para un almacenamiento más largo.
  3. Preparar 40 ml de proteinasa K en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añadir 400 ml de plasma mediante pipeteo.
  4. Lijar la muestra añadiendo 400 s l de tampón de lisis, vórtice durante 15 s e incubar durante 10 min a 56 oC.
  5. Aísle el ADN utilizando un kit de extracción de sangre de ADN como se describe en las instrucciones del fabricante. Brevemente, agregue alcohol y cargue los lysates en una columna de espín que contenga una membrana a base de sílice de unión al ADN. Lave las columnas varias veces para producir ADN puro.
  6. Eluye el ADN producido en 30-50 l de tampón te.

2. Amplificación de la región de control no codificante (NCCR)

  1. Realice el siguiente procedimiento en salas separadas físicamente. Utilice una sala aislada para preparar los reactivos y distribuir la mezcla a los tubos PCR.
  2. Prepare la mezcla maestra para el pre-PCR utilizando el par de imprimación A (Tabla 1) en un volumen total de 50 l y utilice el ADN previamente aislado del paso 1.6. El esquema de pipeteo para preparar la mezcla maestra para el PCR pre y anidado se imprime en el Cuadro2.
  3. Distribuya 45 s de la mezcla maestra en los tubos PCR.
  4. Añadir 5 l de ADN aislado en los tubos de PCR.
    NOTA: Utilice otra habitación distinta a la de la preparación de la mezcla maestra para evitar la contaminación.
  5. Ejecute el PCR con las condiciones de reacción como se ilustra en el Cuadro3. Repetir la desnaturalización, recocido y extensión en 35 ciclos.
  6. Para la amplificación anidada utilice el par de imprimación B que alberga los sitios de restricción para AgeI y SpeI (Tabla1).
  7. Ejecute el PCR anidado con las condiciones de reacción como se describe en los pasos 2.2 a 2.5 utilizando 5 l de la pre-PCR.
  8. Mezclar 10 l del producto PCR con 2 ml de tinte de carga de gel 6x. Cargue 10 ml de la mezcla en un gel de agarosa del 1,5% y ejecute el gel durante 30 min a 60 mA.
  9. Visualice el gel utilizando un sistema de documentación UV adecuado.
    NOTA: Se espera que el tamaño del amplificador esté entre 300-500 bp dependiendo de si se produjeron reorganizaciones (eliminaciones, inserciones o duplicaciones) (Figura2C).
  10. Purificar los amplicons PCR utilizando un kit de purificación de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Elule los amplicons PCR en 30 l de búfer de elución.
  11. Envíe los amplicons para la secuenciación de Sanger utilizando el par de imprimación B.

3. Clonación del NCCR en el reportero de doble fluorescencia

  1. Digerir los amplicons purificados (paso 2.10) con AgeI y SpeI durante 2 h a 37oC, tal como se describe en la Tabla4.
  2. Repita el paso 2.10 y purifique los amplicons digeridos.
  3. Paralelamente, también digiere la columna vertebral del plásmido (1,5 g) con AgeI y SpeI durante 2 h a 37oC, tal como se describe en la Tabla5. Este paso solo debe realizarse una vez. Para reacciones posteriores, congele la digestión a -20 oC.
  4. Analizar la columna vertebral del plásmido digerido en un gel de agarosa baja de fusión de 0.8%.
    NOTA: No ejecute el gel con una corriente superior a 40 mA. La plaquita esperada de la región espaciadora originalmente derivada del plásmido pEX-K4 2-LTR CD313 es de 128 bp (Figura2C).
  5. Visualice fragmentos de ADN utilizando luz UV de onda larga (320 nm) y corte la banda troncal usando un bisturí limpio. Transfiera el fragmento de gel de fusión baja a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Evite largos tiempos de exposición a los rayos UV para evitar daños en el ADN.
    NOTA: Dado que se utiliza agarosa de fusión baja, no es necesario purificar el ADN antes de la ligadura.
  6. Calentar la columna vertebral que contiene la pieza de agarosa de fusión baja durante 10 minutos a 65 oC para derretir la pieza de gel y mezclar cada 2 minutos mediante un suave vórtice. El gel fundido se puede utilizar directamente para la ligadura.
  7. Ligar la columna vertebral y el amplicon digerido utilizando ligasa de ADN T4 durante la noche a 16 oC utilizando el esquema que se muestra en la Tabla 6.
  8. Realizar la transformación en E. coli utilizando el método de choque térmico, bacterias de placas en placas de amplificador de LB, y el cultivo a 37 oC durante la noche.
  9. Al día siguiente, seleccione tres clones positivos y prepare cultivos de E. coli durante la noche (5 ml de LB-Amp) y cultivo a 37 oC.
  10. Aislar el plásmido-ADN utilizando protocolos estándar como se describe en otros lugares14,realizar la digestión AgeI y SpeI para comprobar si hay clones positivos y visualizar fragmentos cortados en un gel de agarosa del 1%. La banda espaciadora (128 bp) será reemplazada por la secuencia NCCR más grande (300-500 bp, véase arriba).
  11. Envíe el plásmido para la secuenciación de Sanger utilizando imprimación EGFP-N o par de imprimación B (Tabla 1).
  12. Dado que las mutaciones pueden ocurrir espontáneamente, compare los resultados de la secuenciación con los resultados de secuenciación obtenidos con el amplicon. Utilice únicamente los clones que contengan secuencias idénticas en comparación con el amplificador.
  13. Utilice un software de banco de trabajo molecular (por ejemplo, freeware GENtle 1.9.4 u otros programas de edición de secuencias) para alinear y editar las secuencias obtenidas (Figura3).
  14. Inicie GENtle 1.9.4 e importe las secuencias de ADN haciendo clic en el botón Importar (flecha verde hacia abajo).
  15. A continuación, haga clic en Herramienta y seleccione Alineación en el menú (Usar Ctrl+G como acceso directo) y elija las secuencias de ADN para la alineación.
  16. Agregue una secuencia a la alineación haciendo clic en Agregar o quitar una secuencia haciendo clic en Eliminar. Incluir una secuencia de consenso arquetípica NCCR como JN19243815, no utilice la secuencia NCCR de la Comúnmente utilizada Dunlop-strain16, ya que alberga reordenamientos y duplicaciones otros que el arquetípico BKPyV Cepas.
    NOTA: El NCCR ya contiene el codón de inicio traslacional (Figura3).
  17. Elija un método para la alineación haciendo clic en Algoritmo en la barra de herramientas y elija clustal W. Establezca los parámetros de alineación para que coincidan con 2; penalización de extensión de brecha -1; penalización de brecha -2 y haga clic en Aceptar para ejecutar la alineación.

4. Transfectar transitoriamente las células HEK293T con el plásmido reportero y el tratamiento con posibles agentes antivirales

  1. Para preparar cantidades suficientes de ADN plásmido para experimentos de transfección posteriores preparar un cultivo nocturno de 150 ml. Aísle el ADN plásmido utilizando un kit de aislamiento plásmido. Alternativamente, se pueden utilizar otros kits de purificación de plásmidos.
  2. Semilla 1 x 105 HEK293T células en DMEM que contienen 10% FCS, penicilina y estreptomicina (1x) por pozo de una placa de 12 pocillos 24 h antes de la transfección e incubar durante la noche a 37 oC y 5% CO2 para mantener la proliferación activa durante la transfección.
    NOTA: Las células deben ser aproximadamente un 80% de confluente en la transfección.
  3. Coloque 250 ml de medios séricos reducidos en un tubo estéril y agregue 1 g de ADN de plásmido de cada reportero y mezcle suavemente pipeteando.
  4. Añadir 3 l del reactivo de transfección a la mezcla de ADN, mezclar suavemente pipeteando e incubar durante 15 min. Precaliente el reactivo de transfección a la temperatura ambiente de 22 oC y vórtice suavemente antes de usarlo.
  5. Agregue la mezcla en cuanto a los pozos y distribuya suavemente al pozo.
  6. Después de 4 h, reemplace el sobrenadante por un medio fresco que contenga los agentes de ensayo y el control del disolvente. Incubar a 37oC hasta su análisis. En este ejemplo, se utilizaron los inhibidores mTOR INK128 (100 ng/ml) y rapamicina (100 ng/ml).

5. Microscopía de fluorescencia y citometría de flujo

  1. Compruebe las células para la fluorescencia roja y verde bajo el microscopio de fluorescencia (Figura 4).
    NOTA: La fluorescencia roja y verde corresponde a la expresión génica BKPyV temprana y tardía, respectivamente.
  2. Después de 72 h después de la transfección, aspirar el sobrenadante y lavar las células dos veces con 1 mL de PBS frío.
  3. Agregue suavemente 500 s de trippsina y gire ligeramente la placa para evitar el desprendimiento prematuro de las células. Este paso es importante para evitar los dobletes celulares.
  4. Después de la adición, retire la trippsina directamente con la misma punta de pipeta.
  5. Incubar las células durante al menos 5 min a 37 oC.
  6. Resuspenda las células trippsinizadas con 1 ml de PBS que contengan 3% de FCS y transfiera la suspensión en tubos FACS preetiquetados.
  7. Agregue DAPI (1 g/ml) antes del análisis FACS.
  8. Analice las celdas utilizando un catómetro de flujo. Para cada muestra, mida al menos 10.000 células vivas, que son negativas para la tinción de DAPI.

6. Análisis de datos

  1. Importe los datos al software de análisis de citometría de flujo y agregue muestras haciendo clic y arrastrar al espacio de trabajo.
  2. Haga doble clic en el archivo importado y cree un gráfico. Elija FSC-A frente a SSC-A haciendo clic en el eje X e Y. Atraviese la población de células principales haciendo clic en Polígono en la barra de herramientas y enmarcando la población celular (Figura5). Asigne un nombre a la población de celdas elegida según sea necesario (por ejemplo, "células individuales"). Las "células individuales" aparecerán como un nuevo espacio de trabajo.
  3. Continúe con las "células únicas" para DAPI negativa (es decir, "células vivas"). Para identificar las células vivas, compare la población celular con y sin tinción de DAPI. En ambas parcelas elija FSC-A versus pacific-blue-A.
  4. Haga clic en el rectángulo y elija la población de celdas negativas de DAPI, asigne a la población de celdas elegida "células vivas" y cree una nueva gráfica de puntos que muestre FITC (eGFP) frente a PE (tdTomato) como se describió anteriormente.
  5. Agregue cuadrantes en "células vivientes" eligiendo Quad en la barra de herramientas. Atraviese la población arrastrando el centro del cuadrante hasta el borde de cada población. Los cuadrantes representan 1) eGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOM+, 3) eGFP+tdTOM-, 4) eGFP+tdTOM+.
    NOTA: Debido a la superposición espectral de espectros de emisión entre FITC y PE, la compensación inicial es esencial para distinguir entre señales rojas y verdes y para lograr resultados precisos.
  6. Determine las intensidades medias de fluorescencia (IMF) haciendo clic con el botón derecho en el cuadrante y seleccionando Añadir estadísticas. Elija Media y haga clic en Aceptar. La IMF media se muestra ahora por debajo de la población en la sección "estadísticas". Los cuadrantes 2 y 4 corresponden a la expresión temprana, mientras que los cuadrantes 3 y 4 representan la expresión tardía.
  7. Agregue réplicas adicionales de la misma manera para la potencia estadística.
  8. Para la interpretación de datos, los valores de MFI de inicio y de retraso en una gráfica de barras:
  9. Para comparar las actividades del NCCR obtenidas de diferentes donantes o cepas de virus, agregue un control arquetípico o la cepa Dunlop16 y establezca sus IMF relativas en 100%, y calcule los valores de IMF relativos. Repita con cada réplica y determine la media y la desviación estándar.
  10. Para evaluar un efecto de los compuestos potenciales en la actividad transcripcional, establezca el control de disolvente en 100% y trace la IMF de las células tratadas.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este experimento representativo, la actividad transcripcional impulsada por la región de control no codificante BK-polioomavirus se midió a través de la citometría de flujo. Además, se probó la inhibición de la expresión génica temprana viral para tratar a los pacientes después de la reactivación del BKPyV. Con este fin, se utilizó un ensayo de doble fluorescencia-reportero como publicado anteriormente5. El esquema de flujo de trabajo general de la configuración...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este artículo, se presenta un método comúnmente utilizado que permite el análisis de la actividad de promotor estinúo no codificante (NCCR) impulsada por la actividad temprana y tardía del promotor. La actividad del NCCR se puede medir simultáneamente y no necesita lisis de las células transinfectadas. Además, se puede analizar un número relativamente grande de células y no es necesario la co-transfección de marcadores adicionales para la normalización de los valores de fluorescencia.

Una p...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Johannes Korth ha recibido subvenciones por honorarios de oradores y gastos de viaje de Astellas y Novartis. Marek Widera ha recibido honorarios de consultoría de Novartis. Oliver Witzke ha recibido subvenciones para estudios clínicos, honorarios de oradores, honorarios y gastos de viaje de Amgen, Alexion, Astellas, Basilea, Biotest, Bristol-Myers-Squibb, Correvio, Chiesi, Gilead, Hexal, Janssen, Dr. F. K-hler Chemie, MSD, Novartis, Roche, Pfizer, Sanofi y TEVA.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen a Barbara Bleekmann por su excelente asistencia técnica. Estos estudios fueron apoyados por el programa IFORES de la Facultad de Medicina de la Universidad de Duisburg-Essen y el programa RIMUR de la Alianza Universitaria Ruhr y Mercator Research Center Ruhr (MERCUR). Los autores agradecen a los J. Manchot-Stiftung por la beca de doctorado de Helene Sertznig y el apoyo constante. La recolección y el uso de material para pacientes ha sido aprobado por el comité de ética de la facultad de medicina de la Universidad Duisburg-Essen (14-6028-BO).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Escalera de 100 bpNEBN3231Cualquier escalera con un alcance de hasta 1 kb puede ser sustituida por
escalera de 2 troncosNEBN0550Cualquier escalera con un alcance de hasta 10 kb puede ser sustituida
Agar-Agar, Kobe ICarl Roth5210.3
AgeI-HFNEBR3552
Ampicilina Natriumsalz CellpureCarl RothHP62.1
Aqua ad iniectabiliaBbraun 2351744puede ser sustituido por cualquier fabricante
BD FACSCanto™ IIBD Biosciences
BD FACSDivaBD Biosciences
DAPISigma 10236276001
DFC450C módulo de cámaraLeicaCualquier cámara puede ser utilizada
DMEMGibco41966-029puede ser sustituida por cualquier fabricante
Microscopio DMIL LEDLeicaCualquier microscopio de fluorescencia se puede utilizar
DNA Blood Mini KitQiagen51104puede ser sustituido por cualquier fabricante
E.coli DH5alpha Células CompetentesThermo Scientific18258012
FBS SuperiorMerckMillipore50615Cualquier FBS puede ser utilizado
FlowJo v10.5.3FlowJo, LLCCualquier software de citometría de flujo FBS puede ser utilizado
Tinte de carga de gel, púrpura (6X) NEBB7024Cualquier colorante de carga 6x puede ser sustituido
HEK293T célulasATCC11268Estas células expresan constitutivamente el antígeno T grande del virus del simio 40 (SV40), y el clon 17 fue seleccionado específicamente por su alta transfectabilidad.
La incubadora de CO2 HERAcell® 240iThermo Scientificpuede ser sustituida por cualquier fabricante
Kit de PCR HotStarQiagen203203
Intas GelIntasSe puede utilizar cualquier sistema de visualización para geles de agarosa que contienen ADN teñido
Melt Biozym850081puede ser sustituido por cualquier fabricante
Opti-MEMInvitrogen31985070puede ser sustituido por cualquier fabricante
pBKV (34-2)ATCC45025Plásmido que alberga el genoma completo de la cepa BKPyV Dunlop; se utilizó como control positivo; DNA Seq. Acc.: KP412983
PBSGibco14190-136
PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal CyclerBio-Radproducto descontinuadoCualquier termociclador puede ser utilizado
PCR Nucleotide Mix, 10 mMPromega#C1145puede ser sustituido por cualquier fabricante
PCR1 y PCR2 Primersmetabionno aplicableDesalado. Diluir a (10 µ M) con agua de grado PCR
PenStrep (100x)Gibco15140-122puede ser sustituido por cualquier fabricante
Roti®-GelStainCarl Roth3865A tinción basada en fluorescencia para medir la concentración de dsDNA
SpeI-HFNEBR3133
T4-DNA LigaseNEBM0202
TransIT LT1MirusMIR2300
Tripsina 0.05% - EDTAGibco25300-054puede ser sustituido por cualquier fabricante
ZymoPURE II Plásmido KitZymoD4201puede ser sustituido por cualquier fabricante
Sistema de documentación Low

References

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