El artículo describe un protocolo rápido para etiquetar los vasos sanguíneos en un pez teleósteo por perfusión cardíaca de DII diluido en fijador, usando medaka (Oryzias latipes) como modelo y centrándose en el cerebro y el tejido pituitario.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Etiquetado de los vasos sanguíneos en el cerebro Teleost y la hipófisis usando perfusión cardíaca con un-fijador DiI
En este artículo
Resumen
Resumen
Los vasos sanguíneos inervan todos los tejidos en los vertebrados, lo que permite su supervivencia proporcionando los nutrientes necesarios, oxígeno, y las señales hormonales. Es uno de los primeros órganos que empiezan a funcionar durante el desarrollo. Los mecanismos de formación de los vasos sanguíneos se han convertido en un tema de alto interés científico y clínico. En los adultos sin embargo, es difícil visualizar la vasculatura en la mayoría de los animales vivos debido a su localización profunda dentro de otros tejidos. Sin embargo, la visualización de los vasos sanguíneos sigue siendo importante para varios estudios como Endocrinología y Neurobiología. Mientras que varias líneas transgénicas se han desarrollado en el pez cebra, con los vasos sanguíneos directamente visualizados a través de la expresión de proteínas fluorescentes, no existen tales herramientas para otras especies teleósteo. Usando medaka (Oryzias latipes) como modelo, el protocolo actual presenta una técnica rápida y directa para etiquetar los vasos sanguíneos en el cerebro y la hipófisis mediante el perfundiendo a través del corazón con fijador que contiene DII. Este protocolo permite mejorar nuestro entendimiento sobre cómo las células cerebrales y pituitarias interactúan con la vasculatura sanguínea en tejidos enteros o rebanadas gruesas de tejido.
Introducción
Los vasos sanguíneos desempeñan una parte esencial del cuerpo vertebrado, ya que proporcionan los nutrientes necesarios, el oxígeno y las señales hormonales a todos los órganos. También, desde el descubrimiento de su participación en el desarrollo del cáncer1, han recibido mucha atención en la investigación clínica. Aunque una serie de publicaciones han investigado los mecanismos que permiten el crecimiento de los vasos sanguíneos y la morfogénesis, y un gran número de genes importantes para su formación se han identificado2, queda mucho por entender en cuanto a la interacción entre las células o los tejidos y la sangre ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todo el manejo de los animales se realizó de acuerdo con las recomendaciones para el cuidado y el bienestar de los animales de investigación en la Universidad Noruega de Ciencias de la vida, y bajo la supervisión de los investigadores autorizados.
1. preparación de instrumentos y soluciones
- Preparar la solución de acción DiI disolver 5 mg de cristal DiI en 1,5 mL tubo de plástico con 1 mL de 96% EtOH. Vórtice durante 30 s y manténgase cubierto con papel de aluminio.
Nota: La solución de la acción DiI se puede conservar en la oscuridad a-20 ° c durante varios meses. - Preparar el soporte para peces (
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Este protocolo demuestra un procedimiento paso a paso para etiquetar los vasos sanguíneos en el cerebro de medaka y la hipófisis, y al mismo tiempo fijar el tejido. Después del etiquetado por inyección cardíaca de una solución fijadora que contiene DiI en el corazón, los vasos sanguíneos se pueden observar en rodajas usando un estereomicroscopio fluorescente (figura 4) o en tejido entero usando un microscopio confocal (figura 5). Ya sea en la rebanada de tejido .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La perfusión cardíaca con DII previamente se ha utilizado para etiquetar los vasos sanguíneos en varias especies modelo24, incluyendo el pez teleósteo13.
Como DiI es entregado directamente a la membrana de la célula endotelial por perfusión en la vasculatura, es posible aumentar la relación señal-ruido mediante el aumento de la concentración de DiI en la solución fijadora. Además, el fluoróforo proporciona una coloración intensa cuando.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Shinji Kanda la demostración de perfusión cardiaca con solución fijadora en medaka, la Sra. Lourdes Carreon G tan para obtener ayuda con la cría de medaka y el Sr. Anthony Peltier para las ilustraciones. Este trabajo fue financiado por la NMBU y por el Consejo de investigación de Noruega, concesión número 248828 (programa de vida de Noruega digital).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Paraformaldehído al 16% | Microscopía Electrónica Sciences | RT 15711 | |
| 5 mL Jeringa PP/PE sin aguja | Jeringas | Sigma | Z116866-100EA |
| Agujas de jeringa BD Precisionglide Sigma | Z118044-100EA | agujas 18G (1,20*40) | |
| Vidrio de borosilicato 10 cm de diámetro exterior 1,2 mm | instrumento sutter | BF120-94-10 | pipeta |
| de vidrioDiI (1,1′-Dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametililindocarbocianina perclorato) | Invitrogen | D-282 | |
| Tubo de LDPE O.D 1,7 mm e I.D 1,1 mm | Portex | 800/110/340/100 | cánula |
| Tampón de fosfato solución salina (PBS) | Sigma | D8537-6X500ML | |
| Extractor de pipetas | Narishige | PC-10 | |
| Placas de Petri de plástico | VWR | 391-0442 | |
| Superglue gel | loctite | c4356 | |
| Tricaine (ms-222) | sigma | E10521-50G |
Referencias
- Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. Angiogenesis in cancer. Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).
- Simon, M. C. Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks. Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).
- Magi....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
