Artículo de método

Grabaciones electrofisiológicas de corrientes de iones de una sola célula bajo estrés de cizallamiento bien definido

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DOI:

10.3791/59776

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2 de agosto de 2019

 , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary, Critical Care, Sleep and Allergy, University of Illinois at Chicago

En este artículo

Resumen

El objetivo de este protocolo es describir una cámara de flujo de placa paralela modificada para su uso en la investigación de la activación en tiempo real de canales iónicos sensibles al mecano sensible por tensión de cizallamiento.

Resumen

Se sabe que la tensión de cizallamiento fluido desempeña un papel importante en la función endotelial. En la mayoría de los lechos vasculares, el estrés de cizallamiento elevado por aumentos agudos en el flujo sanguíneo desencadena una cascada de señalización que resulta en vasodilatación, aliviando así el estrés mecánico en la pared vascular. El patrón de estrés por cizallamiento también es bien conocido por ser un factor crítico en el desarrollo de la aterosclerosis con el estrés de cizallamiento laminar siendo ateroprotector y perturbado estrés de cizallamiento siendo pro-aterogénico. Si bien tenemos una comprensión detallada de las diversas vías de señalización de células intermedias, los receptores que primero traducen el estímulo mecánico en mediadores químicos no se entienden completamente. Los canales iónicos sensibles al mecano sensible son críticos para la respuesta a la cizalladura y regulan la señalización celular inducida por cizallamiento, controlando así la producción de mediadores vasoactivos. Estos canales se encuentran entre los primeros componentes de señalización activados para cortar y se han relacionado con vasodilatación inducida por cizallamiento mediante la promoción de la producción de óxido nítrico (por ejemplo, rectificación interna de K+ [Kir] y potencial de receptor transitorio [TRP] (p. ej., canales K+ [KCa] activados por Kir y calcio) y vasoconstricción inducida por cizallamiento a través de un mecanismo indeterminado que implica canales piezoeléctricos. Comprender el mecanismo biofísico por el cual estos canales son activados por fuerzas cortantes (es decir, directamente o a través de un receptor mecano primario) podría proporcionar posibles nuevos objetivos para resolver la fisiopatología asociada con la disfunción endotelial y la atrogénesis. Sigue siendo un desafío importante para registrar la activación inducida por el flujo de canales iónicos en tiempo real utilizando la electrofisiología. Los métodos estándar para exponer las células a tensión de cizallamiento bien definida, como el reómetro de cono y placa y la cámara de flujo de placa paralela cerrada no permiten el estudio en tiempo real de la activación del canal iónico. El objetivo de este protocolo es describir una cámara de flujo de placa paralela modificada que permite el registro electrofisiológico en tiempo real de canales iónicos sensibles a la tensión de cizallamiento bien definido.

Introducción

Las fuerzas hemodinámicas generadas por el flujo sanguíneo son bien conocidas por desempeñar un papel importante en la función endotelial y vascular1,2. También es bien sabido que varios tipos de canales iónicos responden agudamente a los cambios en la tensión de cizallamiento3,4,5 lo que lleva a la hipótesis de que los canales iónicos pueden ser sensores de tensión de cizallamiento primarios. Más recientemente, nosotros y otros mostramos que los canales iónicos mecanosensitive desempeñan un papel crítico en varias funciones vasculares sensibles al estrés de cizallamiento, incluyendo la respuesta vasoactiva a la tensión de cizallamiento6,7,8 , y la angiogénesis del desarrollo9. Los mecanismos de la sensibilidad de tensión de cizallamiento de los canales iónicos, sin embargo, son casi totalmente desconocidos. Es probable que esta brecha de conocimiento se deba a la dificultad técnica de realizar grabaciones electrofisiológicas bajo tensión cortante bien definida. En este artículo, por lo tanto, proporcionamos un protocolo detallado paso a paso realizado rutinariamente en nuestro laboratorio para lograr este objetivo6,7,10,11.

El objetivo general de este método es permitir la investigación en tiempo real de la mecanoactivación del canal iónico bajo tensión de cizallamiento bien definida en el rango fisiológico. Esto se logra modificando una cámara de flujo de placa paralela estándar para permitir que una pipeta electrofisiológica se baje en la cámara y las células de acceso cultivadas en la placa inferior durante la exposición en tiempo real al flujo, proporcionando un enfoque único para lograr esto meta6,7,11. Por el contrario, las cámaras de flujo de placas paralelas estándar, descritas en publicaciones anteriores, se pueden utilizar para el análisis de imágenes en tiempo real de células expuestas a fuerzas de cizallamiento12 u otros enfoques no invasivos13,14, pero no para Electrofisiología. Del mismo modo, el aparato de cono y placa, otro enfoque poderoso para exponer las células a la tensión de cizallamiento15,16 tampoco es adecuado para grabaciones electrofisiológicas. Por lo tanto, estos dispositivos de flujo no permiten la investigación de la sensibilidad de tensión de cizallamiento de los canales iónicos. La dificultad para realizar grabaciones electrofisiológicas bajo flujo es la razón principal de la escasez de información sobre los mecanismos responsables de estos efectos cruciales.

En cuanto a los enfoques alternativos para lograr el mismo objetivo, no hay ninguno que sea tan preciso o controlado. Algunos estudios anteriores intentaron registrar la actividad del canal iónico bajo flujo exponiendo las células a una corriente de líquido procedente de otra pipeta traída a las proximidades de una célula desde más de17,18. Esto es altamente no fisiológico, ya que las fuerzas mecánicas generadas en estas condiciones tienen poco en común con los perfiles fisiológicos de tensión cortante en los vasos sanguíneos. Preocupaciones similares se aplican a los intentos de simular la tensión de cizallamiento fisiológica por perfusión de cámaras abiertas. Como se discutió en detalle en nuestro estudio anterior10, una interfaz de aire líquido abierto crea múltiples perturbaciones y recirculación, que no son fisiológicas. Para abordar todas estas preocupaciones, hemos diseñado una cámara de flujo de placa paralela modificada (MPP), también conocida como el "dispositivo de flujo mínimamente invasivo" en nuestros estudios anteriores6,7,10,11, hecho de acrílico y ampliamente utilizado en nuestro laboratorio. Sin embargo, a pesar de que la descripción original del diseño se ha publicado hace casi 20 años y es el único dispositivo de flujo que permite realizar grabaciones electrofisiológicas bajo tensión de cizallamiento bien definida, esta metodología no ha sido adoptados por otros laboratorios y sólo hay muy pocos estudios que intenten registrar corrientes bajo flujo. Creemos, por lo tanto, que proporcionar una descripción detallada para el uso de la cámara de flujo MPP será de gran ayuda para las investigaciones que están interesadas en canales iónicos mecanosensitive y biología vascular.

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Protocolo

El uso de animales en nuestros estudios está aprobado por el Comité de Cuidado animal de la Universidad de Illinois en Chicago (#16-183).

1. Montaje de la Cámara de Flujo de Placas Paralelas Modificadas

NOTA: Consulte la Tabla 1 y la Figura 1 para los iDE de piezas de cámara de flujo MPP. Consulte la Figura 1 para obtener un esquema que detalla la orientación de las piezas de la cámara para el montaje.

  1. Para adherir el vidrio de la cubierta rectangular, pieza D, a la parte inferior de la pieza C, primero haga la solución de elastómero de silicona mezclando a fondo el agente de curado de elastómero de silicona de 500 ol en 5 ml de base de elastómero de silicona.
  2. Aplique una fina capa de la solución de elastómero de silicona alrededor de los bordes del espacio rectangular de la pieza C y coloque suavemente la pieza de vidrio de cubierta rectangular D directamente sobre la solución de elastómero, de modo que la pieza D cubra completamente el espacio rectangular abierto de la pieza C. Limpie cuidadosamente el exceso de solución de elastómero de silicona.
  3. Repita el paso 1.2 para adherir el vidrio de la cubierta rectangular, pieza F, a la parte inferior de la pieza E y permita que la solución de elastómero de silicona se cure durante la noche a temperatura ambiente.
    NOTA: Una vez curado, el vidrio de la cubierta rectangular permanecerá adherido hasta seis meses antes de necesitar ser reemplazado.
  4. Comenzando con la pieza de la cámara inferior, la pieza E, ensamble la cámara de flujo MPP colocando secuencialmente cada pieza encima de la anterior en el siguiente orden: pieza E (abajo), pieza C, pieza B, pieza A (arriba).
  5. Alinee los orificios de tornillo de cada pieza en las esquinas y atornille firmemente las piezas para evitar que se produzcan fugas durante la administración del flujo a la cámara de flujo MPP.

2. Preparación celular y sembrado en la cámara de flujo MPP

NOTA: Siga los pasos 2.1-2.7 para las células endoteliales cultivadas. Siga el método detallado en los pasos 2.8 a 2.14 para aislar las células endoteliales de la arcada arterial mesentérica del ratón y la preparación de células endoteliales recién aisladas.

  1. En una placa de 6 pocillos, coloque de cuatro a cinco círculos de vidrio de 12 mm de cubierta/bien y células de semillas entre 10% y 30% de confluencia, de modo que se pueda acceder a células individuales para grabaciones electrofisiológicas.
  2. Incubar células bajo condiciones de cultivo estándar (5% CO2, 37 oC) durante no menos de 2 h para permitir que las células se adhieran y no más de 24 h como células endoteliales en la experiencia de los autores se vuelven muy planas y difíciles de parchear cuando se sembran en la subconfluencia durante más de 24 H.
  3. Retire un vaso de cubierta que contenga células adheridas de un pozo de la placa de 6 pocillos, enjuague rápidamente la solución salina con fosfato (PBS) y transfiera a una placa Petri de 35 mm que contenga una solución de baño electrofisiológico de 2 ml (Tabla2) antes de transferirla al flujo MPP Cámara.
  4. Transfiera el círculo de vidrio de la cubierta al vidrio de la cubierta rectangular, la pieza D, que se adhiere a la pieza C de la cámara de flujo MPP asegurándose de que la solución adecuada permanezca en el vidrio de la cubierta para que las células no se expongan al aire. Agregue la solución de baño deseada (250 l) a las células para que el círculo de vidrio de la cubierta y las celdas estén completamente sumergidos en la solución.
  5. Coloque el círculo de vidrio de la cubierta de tal manera que se apoye en la mitad más cercana al lado del depósito de vacío para que las células estén en línea con las aberturas de hendidura de la pieza B. Asegúrese de que el círculo de la cubierta de vidrio se adhiera a la pieza D a través de la adhesión de vidrio de solución para que la aplicación de flujo a la cámara no interrumpe la posición del círculo de vidrio de la cubierta.
  6. Ensamble la cámara de flujo MPP atornillando las piezas en el orden apropiado, como se describe en los pasos 1.4 y 1.5 y como se muestra en la Figura1. Transfiera la cámara a la etapa del microscopio y perfundie inmediatamente la cámara con solución de baño de tal forma que la solución llegue al depósito de vacío para la aspiración (10 ml).
  7. Identifique una célula sana para el experimento identificando una célula con un borde oscuro y un núcleo obvio. Evite las células que parecen estar manchando o las células que están en contacto con otras células.
    NOTA: En el laboratorio de autores, se utilizan células endoteliales aórticas humanas y células endoteliales mesentéricas de ratón primario en el cultivo. Sin embargo, cualquier otro tipo de célula adherente que sea de interés para necesidades específicas de investigación se puede utilizar de la misma manera.
  8. Lavar la arcada arterial aislada en solución de disociación (Tabla 2). Transfiera la arcada a un tubo centrífugo de 2 ml que contenga 2 ml de solución de disociación precalentada (37 oC) (receta para la solución de disociación que se muestra en la Tabla 2) que contiene proteasa neutra (0,5 mg/ml) y elastasa (0,5 mg/ml). Incubar durante 1 h a 37oC con suave agitación cada 10 min.
  9. Retire 1 ml de la solución de disociación de proteasa/elastasa neutra y añada 1 mg/ml de colagenasa tipo 1. Devolver la solución de colagenasa a la solución que contiene las arterias para una concentración final de colagenasa tipo 1 de 0,5 mg/ml. Incubar durante 2 x 3 min a 37oC.
  10. Usando 5 fórceps de grado, mueva rápidamente la arcada a una placa Petri de 35 mm de diámetro que contenga una gota de 750 ol de solución de disociación fresca y refrigerada. Disociar aún más el tejido mediante el uso de dos agujas de jeringa de 20 G para liberar mecánicamente las células endoteliales de las arterias digeridas enzimáticamente.
  11. Usando un pipeta de vidrio Pasteur desechable de 9", tritura la solución celular 10veces antes de transferir las células a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 ml usando el pipeta de vidrio.
  12. Lavar el plato de Petri con otros 750 ml de solución de disociación y transferirlo al mismo tubo. Usando la pipeta de vidrio, disperse mecánicamente las células pipeteando al menos 10 veces para crear una suspensión de una sola célula teniendo cuidado de no introducir burbujas que puedan dañar la integridad de las células endoteliales.
  13. Añadir 750 l de la suspensión de la célula endotelial (500 x 1.000 células) directamente a la pieza D de la cámara de flujo MPP en la mitad más cercana al lado de vacío del depósito. Deje que las células endoteliales se adhieran entre 45 min y 1 h a temperatura ambiente.
  14. Ensamble la cámara de flujo MPP atornillando las piezas en el orden apropiado como se describe en los pasos 1.4 y 1.5 y como se muestra en la Figura1. Transfiera la cámara a la etapa del microscopio y perfundie inmediatamente la cámara con solución de baño de tal forma que la solución alcance la aspiración al vacío (10 ml). Identificar células endoteliales accesibles por su fenotipo áspero y redondo19,20.
    NOTA: Se han utilizado diversos métodos de digestión y cócteles enzimáticos para aislar las células endoteliales de diferentes lechos arteriales. Consulte la Tabla 3 para obtener descripciones detalladas de los protocolos que han sido utilizados por una variedad de investigadores para aislar las células endoteliales para la electrofisiología de abrazadera de parche de canales iónicos mecanosensitive. Estos métodos son probablemente adecuados para su uso en combinación con la cámara de flujo MPP.

3. Control del estrés de cizallamiento a la cámara de flujo MPP para grabaciones electrofisiológicas de canales de iones mecanosensibles activados por cizallamiento

  1. Configure un sistema de perfusión por gravedad conectando un cilindro de jeringa graduado de 30 ml a un bloqueo luer de 3 vías equipado con tubo de microbore (diámetro interno: 0,05 pulgadas, diámetro exterior: 0,09 pulgadas) adecuado para la inserción en el orificio de entrada de 3 mm de diámetro de la pieza A del MPP Cámara.
  2. Fije el cilindro graduado a la cara exterior de la jaula de Faraday que rodea la plataforma de electrofisiología (Figura2) utilizando cinta adhesiva de doble cara. Antes de insertar el tubo en la cámara MPP, rellene previamente la jeringa y el tubo con solución de baño (consulte la Tabla 2 para la solución de baño utilizada para investigar la rectificación interna de los canales K+ en células endoteliales). Inserte el tubo en el orificio de entrada de la cámara de flujo MPP de la pieza A.
  3. Rellene previamente la cámara de flujo MPP con una solución tal que se retire la solución en el depósito de vacío. Detenga el flujo a la cámara y rellene el cilindro graduado hasta la marca superior. Calcule los caudales manualmente permitiendo que la solución fluya a través de la cámara y utilizando un cronómetro para calcular ml/s a una altura de cilindro de jeringa dada.
  4. Levante o baje la jeringa para alterar el flujo, y así cortar en la cámara, y continuar este proceso hasta que se encuentre el nivel deseado de tensión de cizallamiento.
  5. Calcule la tensión de cizallamiento en una cámara paralela utilizando la siguiente ecuación21:
    á 6oQ/h2w
    donde - viscosidad del fluido (g/cm-s), Q - caudal (mL/s), y anchura de la cámara de la placa paralela (w a 2,2 cm) y altura (h a 0,1 cm).
    NOTA: En el sistema de perfusión por gravedad actual, a una altura de cilindro de jeringa (medida desde la parte superior del cilindro) de 57 cm por encima de la etapa del microscopio, el caudal es de 0,3 ml/s. La cizalladura calculada en la cámara a la altura del cilindro de la jeringa y el caudal es de 0,7 dyn/cm2. También debe tenerse en cuenta que otros sistemas de perfusión, como una bomba peristáltica, se pueden utilizar para controlar el flujo a la cámara de flujo MPP. Sin embargo, estos dispositivos pueden añadir turbulencia no deseada e influir en la estabilidad de las mediciones de electrofisiología bajo flujo, por lo tanto, se recomienda el uso del sistema de perfusión de gravedad descrito aquí.
  6. Transfiera una cámara montada que contenga células adheridas a la etapa del microscopio de la plataforma de electrofisiología e inserte el tubo precargado con solución de baño en el orificio de la pieza A. Llene simultáneamente la cámara y lave las células con 10 ml de solución de baño girando la cerradura luer de 3 vías de tal manera que la solución fluye a la cámara.
  7. Una vez que la configuración de parche deseada se obtiene con éxito permiten que las corrientes de canal se estabilicen en un baño estático a temperatura ambiente. Una vez que las corrientes se han estabilizado, aplique la cizalladera de manera escalonada, lo que permite que los aumentos de corriente se estabilicen antes del siguiente aumento del paso en la tensión de cizallamiento.
    NOTA: Los autores encuentran el mayor éxito con la configuración de parches perforados al estudiar canales iónicos mecanoactivados en células endoteliales. Para realizar configuraciones de parches perforados de células enteras, añada 5 ml de una anfotericina B de material de 60 mg/ml en sulfóxido de dimetil (DMSO) a 1 ml de solución de pipeta filtrada estéril de 0,2 m. Después de generar un sello giga-ohm en la configuración de celda, los parches perforados de células enteras se forman dentro de 2 x 5 min.
  8. Elimine la exposición al cizallamiento de las células deteniendo el flujo a la cámara permitiendo que las corrientes de canal sensibles al mecanosensible vuelvan a las corrientes de línea base observadas en el baño estático.
  9. Aísle las corrientes de canal iónico sensibles al mecano sensible de interés alterando la valencia de la solución (por ejemplo, 60 mM K+ en solución de baño con 0 Ca2+ en solución de pipeta para estudiar la rectificación interna de los canales K+. La Tabla 2 muestra ejemplos de recetas de solución) y/o inhibición farmacológica de fuentes de corriente potencialmente contaminantes.

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Resultados

En la Figura 1se muestran varias fotografías que muestran diferentes vistas de la cámara de flujo MPP en la etapa del microscopio (panel superior) y una representación esquemática de la cámara de flujo MPP (panel inferior). El esquema detalla las dimensiones de todo el dispositivo y la cámara de flujo. La Figura 2 muestra una fotografía del sistema de perfusión por gravedad a la cámara de flujo MPP en nuestro laboratorio (panel s...

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Discusión

El sistema vascular está constantemente expuesto a fuerzas hemodinámicas activas, que activan los canales iónicos mecanosensibles3,22, pero las funciones fisiológicas de estos canales en la mecanotransducción inducida por el estrés de cizallamiento es sólo empezando a emerger4,6,8. Los mecanismos responsables de la mecanosensibilidad de los canales activados por tensión ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y Sangre (R01 HL073965, IL) y (T32 HL007829-24, ISF). Los autores también quieren reconocer a la Tienda de Máquinas Científicas de la Universidad de Illinois en Chicago por generar nuestras últimas cámaras de flujo MPP.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,2 y micro; m filtros de jeringa estérilesVWR28145-501Se utiliza para filtrar la solución de pipeta electrofisiogótica
pinzas de 5 gradosFine Scientific Tools1252-30Se utiliza para transferir las arterias digeridas a una solución fresca
Pasteur PipetFisher Scientifc13-678-20Dutiliza para interrumpir mecánicamente las arterias digeridas y transferir células endohteliales recién aisladas 
Círculos de cubreobjetos de 12 mm de diámetroFisher Scientifc12-545-80Para uso con estudios con células cultivadas y tratamientos múltiples. Las células adheridas al cubreobjetos se utilizan para los análisis de pinzas de parche
24 mm x 40 mm Cubreobjetos rectagluarSigma-AldrichCLS2975224Cubreobjetos que se añaden a las piezas de la cámara de flujo MPP C (Figura 1)
24 mm x 50 mm Cubreobjetos rectangularesSigma-AldrichCLS2975245Cubreobjetos que se añaden a la cámara de caudal MPP E (Figura 1)
Agujas de jeringa de 20 GBecton Dickinson and Co305175Para uso en la disrupción mecánica de las arterias mesentéricas digeridas
Placa de Petri de 35 mmGenesee Scientific32-103Para uso en la disrupción mecánica de las arterias mesentéricas digeridas
Anfotericina B solubilizadaSigma-AldrichA9528-50MGSe utiliza para generar la configuración de parche de célula completa perforada.
Colagenasa, tipo IWorthington Biochemical100 mg - LS004194Enzima utilizada en nuestro laboratorio como una breve digestión después del cóctel inicial de proteasa neutra y elastasa
Dimetilsulfóxido (DMSO)Fisher Scientifc67-68-5Solvente para anfotericina B utilizada en pinza de parche perforada de célula entera
Elastasa, liofilizadaWorthington Biochemical25 mg - LS002290 Enzima utilizada en nuestro laboratorio en un cóctel con proteasa neutra/dispasa para iniciar la digestión de las arterias para el aislamiento de células endoteliales.
Placa de cultivo de tejidos Falcon, 6 pocillos, fondo plano con tapa de baja evaporación Corning353046Para su uso con estudios que involucran células cultivadas y múltiples tratamientos
Proteasa neutra/dispasaWorthington Biochemical10 mg- LS02100 50 mg - LS02104Enzima utilizada en nuestro laboratorio en un cóctel con elastasa para iniciar la digestión de las arterias para el aislamiento de células endoteliales
SylGard World Precision InstrumentsSYLG184Elastómero de silicona para adherir el deslizamiento de la cubierta rectangular a las piezas C y E de la cámara de flujo MPP (Figura 1)
Tubo Tygon ND 10-80Tubo de microdiámetroAAQ04133 ID: 0,05 pulgadas, diámetro exterior: 0,09 pulgadas, tubo de perfusión de entrada para administrar el flujo a la cámara
Se de

Referencias

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