El objetivo de este protocolo es describir una cámara de flujo de placa paralela modificada para su uso en la investigación de la activación en tiempo real de canales iónicos sensibles al mecano sensible por tensión de cizallamiento.
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Artículo de método
Grabaciones electrofisiológicas de corrientes de iones de una sola célula bajo estrés de cizallamiento bien definido
En este artículo
Resumen
Resumen
Se sabe que la tensión de cizallamiento fluido desempeña un papel importante en la función endotelial. En la mayoría de los lechos vasculares, el estrés de cizallamiento elevado por aumentos agudos en el flujo sanguíneo desencadena una cascada de señalización que resulta en vasodilatación, aliviando así el estrés mecánico en la pared vascular. El patrón de estrés por cizallamiento también es bien conocido por ser un factor crítico en el desarrollo de la aterosclerosis con el estrés de cizallamiento laminar siendo ateroprotector y perturbado estrés de cizallamiento siendo pro-aterogénico. Si bien tenemos una comprensión detallada de las diversas vías de señalización de células intermedias, los receptores que primero traducen el estímulo mecánico en mediadores químicos no se entienden completamente. Los canales iónicos sensibles al mecano sensible son críticos para la respuesta a la cizalladura y regulan la señalización celular inducida por cizallamiento, controlando así la producción de mediadores vasoactivos. Estos canales se encuentran entre los primeros componentes de señalización activados para cortar y se han relacionado con vasodilatación inducida por cizallamiento mediante la promoción de la producción de óxido nítrico (por ejemplo, rectificación interna de K+ [Kir] y potencial de receptor transitorio [TRP] (p. ej., canales K+ [KCa] activados por Kir y calcio) y vasoconstricción inducida por cizallamiento a través de un mecanismo indeterminado que implica canales piezoeléctricos. Comprender el mecanismo biofísico por el cual estos canales son activados por fuerzas cortantes (es decir, directamente o a través de un receptor mecano primario) podría proporcionar posibles nuevos objetivos para resolver la fisiopatología asociada con la disfunción endotelial y la atrogénesis. Sigue siendo un desafío importante para registrar la activación inducida por el flujo de canales iónicos en tiempo real utilizando la electrofisiología. Los métodos estándar para exponer las células a tensión de cizallamiento bien definida, como el reómetro de cono y placa y la cámara de flujo de placa paralela cerrada no permiten el estudio en tiempo real de la activación del canal iónico. El objetivo de este protocolo es describir una cámara de flujo de placa paralela modificada que permite el registro electrofisiológico en tiempo real de canales iónicos sensibles a la tensión de cizallamiento bien definido.
Introducción
Las fuerzas hemodinámicas generadas por el flujo sanguíneo son bien conocidas por desempeñar un papel importante en la función endotelial y vascular1,2. También es bien sabido que varios tipos de canales iónicos responden agudamente a los cambios en la tensión de cizallamiento3,4,5 lo que lleva a la hipótesis de que los canales iónicos pueden ser sensores de tensión de cizallamiento primarios. Más recientemente, nosotros y otros mostramos que los canales iónicos mecanosensitive desempeñan un papel crítico en varias fu....
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Protocolo
El uso de animales en nuestros estudios está aprobado por el Comité de Cuidado animal de la Universidad de Illinois en Chicago (#16-183).
1. Montaje de la Cámara de Flujo de Placas Paralelas Modificadas
NOTA: Consulte la Tabla 1 y la Figura 1 para los iDE de piezas de cámara de flujo MPP. Consulte la Figura 1 para obtener un esquema que detalla la orientación de las piezas de la cámara para el montaje.
- Para adherir el vidrio de la cubierta rectangular, pieza D, a la parte inferior de la pieza C, primero haga la....
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Resultados
En la Figura 1se muestran varias fotografías que muestran diferentes vistas de la cámara de flujo MPP en la etapa del microscopio (panel superior) y una representación esquemática de la cámara de flujo MPP (panel inferior). El esquema detalla las dimensiones de todo el dispositivo y la cámara de flujo. La Figura 2 muestra una fotografía del sistema de perfusión por gravedad a la cámara de flujo MPP en nuestro laboratorio (panel s.......
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Discusión
El sistema vascular está constantemente expuesto a fuerzas hemodinámicas activas, que activan los canales iónicos mecanosensibles3,22, pero las funciones fisiológicas de estos canales en la mecanotransducción inducida por el estrés de cizallamiento es sólo empezando a emerger4,6,8. Los mecanismos responsables de la mecanosensibilidad de los canales activados por tensión .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y Sangre (R01 HL073965, IL) y (T32 HL007829-24, ISF). Los autores también quieren reconocer a la Tienda de Máquinas Científicas de la Universidad de Illinois en Chicago por generar nuestras últimas cámaras de flujo MPP.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,2 y micro; m filtros de jeringa estériles | VWR | 28145-501 | Se utiliza para filtrar la solución de pipeta electrofisiogótica |
| pinzas de 5 grados | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Se utiliza para transferir las arterias digeridas a una solución fresca |
| Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | utiliza para interrumpir mecánicamente las arterias digeridas y transferir células endohteliales recién aisladas |
| Círculos de cubreobjetos de 12 mm de diámetro | Fisher Scientifc | 12-545-80 | Para uso con estudios con células cultivadas y tratamientos múltiples. Las células adheridas al cubreobjetos se utilizan para los análisis de pinzas de parche |
| 24 mm x 40 mm Cubreobjetos rectagluar | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cubreobjetos que se añaden a las piezas de la cámara de flujo MPP C (Figura 1) |
| 24 mm x 50 mm Cubreobjetos rectangulares | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cubreobjetos que se añaden a la cámara de caudal MPP E (Figura 1) |
| Agujas de jeringa de 20 G | Becton Dickinson and Co | 305175 | Para uso en la disrupción mecánica de las arterias mesentéricas digeridas |
| Placa de Petri de 35 mm | Genesee Scientific | 32-103 | Para uso en la disrupción mecánica de las arterias mesentéricas digeridas |
| Anfotericina B solubilizada | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Se utiliza para generar la configuración de parche de célula completa perforada. |
| Colagenasa, tipo I | Worthington Biochemical | 100 mg - LS004194 | Enzima utilizada en nuestro laboratorio como una breve digestión después del cóctel inicial de proteasa neutra y elastasa |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvente para anfotericina B utilizada en pinza de parche perforada de célula entera |
| Elastasa, liofilizada | Worthington Biochemical | 25 mg - LS002290 | Enzima utilizada en nuestro laboratorio en un cóctel con proteasa neutra/dispasa para iniciar la digestión de las arterias para el aislamiento de células endoteliales. |
| Placa de cultivo de tejidos Falcon, 6 pocillos, fondo plano con tapa de baja evaporación | Corning | 353046 | Para su uso con estudios que involucran células cultivadas y múltiples tratamientos |
| Proteasa neutra/dispasa | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg - LS02104 | Enzima utilizada en nuestro laboratorio en un cóctel con elastasa para iniciar la digestión de las arterias para el aislamiento de células endoteliales |
| SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Elastómero de silicona para adherir el deslizamiento de la cubierta rectangular a las piezas C y E de la cámara de flujo MPP (Figura 1) |
| Tubo Tygon ND 10-80 | Tubo de microdiámetro | AAQ04133 ID: 0,05 pulgadas, diámetro exterior: 0,09 pulgadas, tubo de perfusión de entrada para administrar el flujo a la cámara |
Referencias
- Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli. Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).
- Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G.
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Reimpresiones y permisos
