Caracterizar a los mutantes relacionados con enfermedades de los kinases familiares de la RAF mediante el uso de un conjunto de métodos prácticos y factibles

Resumen

En este artículo, presentamos un conjunto de métodos prácticos y factibles para caracterizar mutantes relacionados con enfermedades de quinasas familiares de la RAF, que incluyen el ensayo de quinasa in vitro, el ensayo de coactivación de la RAF y el ensayo complementario de luciferasa dividida.

Resumen

Las quinasas familiares de fibrosarcoma (RAF) aceleradas rápidamente desempeñan un papel central en la biología celular y su disfunción conduce a cánceres y trastornos del desarrollo. Una caracterización de los mutantes de la RAF relacionados con la enfermedad nos ayudará a seleccionar estrategias terapéuticas adecuadas para el tratamiento de estas enfermedades. Estudios recientes han demostrado que las quinasas familiares de la RAF tienen actividades catalíticas y alostéricas, que están estrictamente reguladas por la dmerización. Aquí, construimos un conjunto de métodos prácticos y factibles para determinar las actividades catalíticas y alostéricas y la relativa afinidad/estabilidad de la familia de la RAF y sus mutantes. En primer lugar, modificamos el ensayo clásico de quinasa in vitro reduciendo la concentración de detergente en tampones, utilizando un procedimiento de lavado rápido suave y empleando una fusión de glutatión S-transferasa (GST) para evitar que los dimers de la RAF se disocieran durante Purificación. Esto nos permite medir la actividad catalítica de los mutantes constitutivamente activos de la RAF apropiadamente. En segundo lugar, desarrollamos un nuevo ensayo de coactivación de la RAF para evaluar la actividad alostérica de los mutantes de la RAF muertos de quinasa mediante el uso de proteínas de la RAF truncadas en Terminal N, eliminando el requisito de Ras activo en los protocolos actuales y logrando así un mayor Sensibilidad. Por último, generamos un ensayo complementario único de luciferasa dividida para medir cuantitativamente la afinidad/estabilidad relativa de dimer de varios mutantes de la RAF, que es más confiable y sensible en comparación con el ensayo tradicional de coinmunoprecipitación. En resumen, estos métodos tienen las siguientes ventajas: (1) fácil de usar; 2) capaz de llevar a cabo eficazmente sin equipos avanzados; 3) rentable; (4) altamente sensible y reproducible.

Introducción

Las quinasas de la familia RAF son un componente clave de la cascada de señalización RAS/RAF/MEK/ERK, que transmiten una señal de RAS para activar la proteína quinasa activada por mitogeno (MEK)^1,2,3,4. Esta familia de quinasas juega un papel crucial en el crecimiento celular, supervivencia ydiferenciación, y sus alteraciones inducen muchas enfermedades, en particular el cáncer 5,^6,7,8. Recientemente, las secuencia....

Protocolo

1. Ensayo In Vitro Kinase para medir la actividad catalítica de los mutantes de la RAF

1. Construir vectores que codifican mutantes de la RAF (Figura1A) con la etiqueta FLAG(DYKDDDDK) en C-terminus mediante el uso de Gibson Assembly o métodos tradicionales de clonación molecular.
   1. Introducir la etiqueta FLAG y las mutaciones en las secuencias de codificación de la RAF por PCRs, y luego insertar secuencias enteras en el vector pCDNA3.1(+) utilizando el ensamblaje Gibson o la ligadura de ADN T4 y siguiendo los protocolos de la fabricación. Utilice las siguientes condiciones para las reacciones de PCR: (1) 95....

Resultados

Las quinasas de la familia RAF tienen actividades catalíticas y alostéricas, que permiten a sus mutantes relacionados con la enfermedad encender la señalización aguas abajo a través de diferentes mecanismos^{13,14,16,17 ,18}. Los mutantes constitutivamente activos de la RAF fosforilan directamente sus sustratos, mientras que los mutantes de la RAF muertos de qui.......

Discusión

En este artículo, presentamos tres métodos para caracterizar mutantes de la RAF relacionados con la enfermedad, que incluyen el ensayo de quinasa in vitro, el ensayo de coactivación de la RAF y el ensayo de luciferasa dividida de cortesía. Dado que las quinasas de la RAF tienen actividad catalítica y actividad alostérica, varios mutantes de la RAF pueden activar la señalización aguas abajo a través de dos mecanismos distintos^{13,14,16<.......}

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
anti-fosfoERK1/2	Tecnologías de señalización celular	4370
anti-fosfoMEK1/2	Tecnologías de señalización celular	9154
anti-ERK1/2	AB clonal	A0229
anti-MEK1/2	Tecnologías de señalización	9124
anti-FLAG(ratón)	Sigma-Aldrich	F3165
anti-HA	Novus Biologicals	MAB6875
anti-FLAG(Conejo)	Tecnologías de señalización celular	14793
anti-β-actina	Sigma-Aldrich	A2228
perlas anti-FLAG(M2)	Sigma-Aldrich	A4596
HRP-conjugado anti-ratón IgG	Jackson Laboratories	115-035-003
HRP-conjugado anti-conejo IgG	Jackson Laboratories	111-035-144
pcDNA3.1(+)	In vitrogen	V79020
Gibson Assembly Cloning  Kit	New England Biolabs	E5510
T4 ADN ligasa	New England Biolabs	M0202
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
Fugene 6	Roche	11 814 443 001
DMEM sin rojo de fenol	Invitrogen	21063-029
D-luciferina	GoldBio	LUCK-100
6xhis-tagged MEK1 (K97A)	preparados en nuestros estudios previos	N.A.	Referencia 15.
Sistema de detección GloMax-Multi.	Promega	E7041

celular