Artículo de método

Detección de parásitos de tripanosoma extravascular por aspiración de aguja fina

DOI:

10.3791/59798

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7 de agosto de 2019

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1Comparative Pathology Unit, Instituto de Medicina Molecular – Faculdade de Medicina de Lisboa, 2Biology of Parasitism Laboratory, Instituto de Medicina Molecular – Faculdade de Medicina de Lisboa

En este artículo

Resumen

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La aspiración de aguja fina es una técnica, mediante la que las células se obtienen de una lesión u órgano utilizando una aguja delgada. El material aspirado se frota, se tiñe y se examina bajo un microscopio para su diagnóstico o se utiliza para biología molecular, citometría o análisis in vitro. Es barato, simple, rápido y causa un trauma mínimo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La aspiración de aguja fina (FNA) es un procedimiento de diagnóstico rutinario esencial para las prácticas médicas y veterinarias. Consiste en la aspiración percutánea de células y/o microorganismos de masas palpables, órganos o derrames (acumulación de líquido en una cavidad corporal) utilizando una aguja delgada similar a la aguja regular utilizada para la punción venosa. El material recogido por FNA es en general altamente celular, y el aspirado recuperado es luego manchado, secado al aire, húmedo-fijo, manchado y observado bajo un microscopio. En el contexto clínico, FNA es una importante herramienta de diagnóstico que sirve como guía para el manejo terapéutico adecuado. Debido a que es simple, rápido, mínimamente invasivo y requiere una inversión limitada en el laboratorio y los recursos humanos, es ampliamente utilizado por los veterinarios, principalmente en domésticos, pero también en animales de granja. En estudios con modelos animales, FNA tiene la ventaja de que se puede realizar repetidamente en el mismo animal, permitiendo estudios longitudinales a través de la recolección de células de tumores y órganos / tejidos en el transcurso de la enfermedad. Además de la microscopía de rutina, el material recuperado también se puede utilizar para inmunocitoquímica, microscopía electrónica, análisis bioquímicos, citometría de flujo, biología molecular o ensayos in vitro. FNA se ha utilizado para identificar el parásito protozoario Trypanosoma brucei en las gónadas de ratones infectados, abriendo la posibilidad de un diagnóstico futuro en el ganado.

Introducción

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La aspiración de aguja fina (FNA) es ampliamente utilizada en el diagnóstico de cáncer y enfermedades no neoplásicas, tanto en animales humanos como domésticos. La técnica ha sido estandarizada a lo largode los años y se describe en numerosos libros de texto 1,2.

Consiste en gran medida en la aspiración percutánea de masas palpables, órganos o derrames con una aguja delgada instalada en una jeringa vacía, utilizando la presión negativa para extraer células o líquido de la masa1,3. Las agujas son típicamente de 22 a 25 G (medidor correspondiente al diámetro interior de la aguja), y el uso de una aguja de mayor diámetro (diámetro grande, por ejemplo, 21 G) es útil para aumentar la celularidad, aunque esto puede producir contaminación excesiva de la sangre. La longitud de la aguja dependerá de la profundidad de la masa, pero 1 o 11 x 2 pulgadas se utiliza comúnmente para masas superficiales. Las jeringas son típicamente de 5 a 10 ml, con jeringas más grandes que logran un mayor vacío, lo que a su vez aumenta el rendimiento de aspiración. También se pueden aspirar masas de asiento profundo no palpables, con agujas más largas y bajo guía por imágenes (ultrasonografía). El aspirador recuperado puede ser manchado, secado al aire, húmedo-fijo, manchado y observado bajo un microscopio para lograr un diagnóstico3 (Figura1).

Se trata de una técnica simple, económica, indolora y mínimamente invasiva utilizada principalmente en el entorno preoperatorio para lograr un diagnóstico en masas palpables y también para órganos, como ganglios linfáticos, tiroides, próstata o incluso las estructuras reproductivas masculinas externas 1.Además de ser una herramienta de diagnóstico, esta técnica se puede utilizar para la recolección de células para otros fines, a saber, citogenética, microscopía electrónica (Figura1D),caracterización citométrica de flujo4,5 ,6,7, establecimiento de cultivos celulares8. Un ejemplo común en la práctica clínica es la recuperación de espermatozoides para la fertilización in vitro9.

La aspiración se puede repetir varias veces en la misma masa para obtener múltiples frotis. En caso de una lesión heterogénea, por ejemplo, un área sólida y un espacio quístico, es importante que las células se aspiran de cada región. El material recogido por FNA es en general altamente celular, lo que en la mayoría de los casos permite el diagnóstico de enfermedades sin necesidad de una biopsia de tejido. Manchas especiales, inmunofluorescencia. inmunocitoquímica (Figura1D),y las técnicas moleculares también pueden realizarse en frotis obtenidos a través de FNA, por ejemplo, para la identificación de agentes infecciosos cuando no son reconocibles sólo por morfología10. En los cuadros 1 y 2, respectivamente, se resume un breve resumen de las aplicaciones generales y de los equipos y suministros necesarios para el FNA.

El primer informe sobre el uso de la punción de aguja con fines diagnósticos se describe en los primeros escritos de la medicina árabe, pero es a principios del siglo XX que se implementaron técnicas modernas de aspiración de agujas11. En particular, tal vez el primer informe que sugiere el uso de FNA para el diagnóstico de enfermedades infecciosas fue un estudio en 1904, donde Grieg y Gray reportaron aspiraciones de aguja de ganglios linfáticos de pacientes con enfermedad del sueño revelaron tripanosomas motiles12 . Los autores informaron de la presencia de tripanosomas en casos tempranos y avanzados, y a una densidad más alta que la que se ve en los frotis de sangre, donde estos son a menudo eventos raros12.

El diagnóstico actual de la tripanosomiasis en el ganado se basa en la observación directa de parásitos en la sangre, linfáticos o en técnicas inmunodiagnósticas13,14,15. Hemos demostrado anteriormente que en las infecciones experimentales de Trypanosoma en el ratón, Trypanosoma brucei (T. brucei) tiene un tropismo notable al tejido adiposo16 y también a algunas de las estructuras reproductivas masculinas externas, a saber, epidídilo17. Los parásitos se acumulan en el estroma de estos tejidos en grandes cantidades16.

El protocolo que se describe a continuación describe un procedimiento técnico detallado paso a paso para fNA en ratones vivos, dirigido a la aspiración de tripanosomas presentes en las estructuras reproductivas masculinas externas (testis, epidídimo y grasa epidérmica), seguido de citología convencional e inmunomancha para proteínas específicas del parásito (VSG)16,17. La aspiración se realizó 6 días después de los procedimientos de infección y seguridad que se aplican son los comúnmente establecidos para el manejo rutinario de animales experimentales. Se requieren medidas adicionales para los animales que tienen deficiencias inmunitarias (usar un vestido esterilizado al vapor, máscara, sombrero para el cabello, guantes estériles y asegurar la técnica aséptica en todo momento) para mitigar la exposición accidental a patógenos oportunistas.

Protocolo

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Todos los experimentos con animales de este protocolo se realizaron de acuerdo con la normativa de la UE y fueron aprobados por el Comité de ética animal del Instituto de Medicina Molecular (iMM), (AEC_2011_006_LF_TBrucei_IMM). La instalación animal de iMM cumple con la legislación portuguesa para el uso de animales de laboratorio (Decreto-Ley 113/2013) y sigue las directrices de la Directiva Europea 2010/63/UE y FELASA (Federación de Asociaciones Europeas de Ciencias animales de laboratorio) y las directrices FELASA (Federación de Asociaciones Europeas de Ciencias Animales de Laboratorio) y recomendaciones relativas al bienestar animal de laboratorio.

1. Aspiración de parásitos de los órganos reproductivos masculinos externos del ratón

NOTA: La aspiración con aguja fina (FNA) se realizó en ratones machos de tipo salvaje C57BL/6J, de 6 a 10 semanas de edad, infectados con T. brucei mediante inyección intraperitoneal de 200 ml de salina con 2.000 parásitos como se describió anteriormente16.

  1. Para fNA de los órganos reproductores masculinos externos, coloque el ratón en una campana de flujo laminar, anestetizar al animal con una inyección intraperitoneal de 200 l de una mezcla de 75 mg/kg de ketamina + 1 mg/kg de medetomidina en salina.
    1. Confirme la anestesia con el método de pellizcar de dedo del dedo del tiempo. Cuando el reflejo de la retracción de la pierna está ausente, coloque el ratón en la recumbencia dorsal (Figura 2A).
    2. Palpar cuidadosamente los testículos, evaluando el tamaño y la distancia de la piel superpuesta. Restringir el órgano entre el índice y el dedo medio o entre el dedo índice y el pulgar. Estire la piel superpuesta firmemente a través de la masa para inmovilizar aún más al objetivo. Limpie la superficie con toallitas de alcohol (Figura2A).
    3. Sujete la aguja de 22 G montada y la jeringa de 5 ml e inserte la punta de la aguja en el objetivo, siempre con el émbolo en el estado de reposo (Figura2B-C).
    4. Aplique la succión retrayendo el émbolo de la jeringa a la marca de 4 ml a 5 ml 2-3 veces. Redirija la aguja dentro del órgano ya sea en línea recta o a lo largo de varias tangentes diferentes para aumentar la probabilidad de una muestra representativa y de apuntar a estructuras más pequeñas como el epidídilo. Asegúrese de que este procedimiento es suave, para minimizar el daño tisular (Figura2C-D).
    5. Suelte la succión y, a continuación, retire la aguja. No vuelva a dibujar la aguja con el émbolo retraído, ya que esto conducirá a la succión del aspirado en el barril de la jeringa e impedirá su recuperación (Figura2E). Después de la retirada de la aguja, controlar cualquier sangrado mediante la aplicación de presión con una esponja de gasa esterilizada en el sitio de la punción.
    6. Desconecte la jeringa de la aguja, llénela con aire, vuelva a conectar la aguja y expulse suavemente el contenido de la aguja sobre una diapositiva. Coloque la punta de la aguja muy cerca o incluso en la diapositiva para evitar salpicaduras (Figura2F-I).
    7. Realice al menos una aspiración adicional por órgano/animal para asegurar el muestreo de réplica.
    8. Revertir la anestesia con una inyección subcutánea de 200 l de 1 mg/kg de Atipamezol en salina y devolver a los animales a su jaula doméstica para su recuperación y observar hasta la recuperación completa.

2. Preparación de frotis a partir del material aspirado

NOTA: Use guantes durante todo el procedimiento y asegúrese de que se descomaenden de forma segura las agujas y jeringas.

  1. Método de extracción de dos pasos
    1. Recoja la diapositiva que tiene la gota del aspirado usando la mano no dominante, y pellizque el extremo esmerilado entre el pulgar y el dedo índice (Figura3A).
    2. Recoge una segunda diapositiva limpia, la diapositiva del esparcidor, con la mano dominante y llévala a través de la primera diapositiva con la gota del aspirador. Coloque el borde liso y limpio de la diapositiva en la diapositiva de la muestra justo en la parte superior de la gota en un ángulo de aproximadamente 30o (Figura3B).
    3. Deslice la corredera hacia adelante con una luz, movimiento continuo y constante para obtener una película delgada (Figura3C).
    4. Descanse la corredera y permita el secado al aire completo y rápido del material (Figura3D). No fijar el calor. Etiquete el borde esmerilado de la diapositiva con un lápiz.
      NOTA: El protocolo se puede pausar en este paso y los frotis se pueden almacenar indefinidamente hasta que esté listo para ser manchado.

3. Manchado de las manchas

NOTA: Use guantes durante todo el procedimiento y asegúrese de que los pasos 3.1.4 y 3.2.9 se realicen dentro de una campana de humo.

  1. Protocolo de tinción de Giemsa
    1. Corrija los frotis secados al aire sumergiendo las diapositivas en un frasco de Coplin que contenga 100% de metanol durante 5 min (Figura3E).
    2. Transfiera la corredera en un frasco de Coplin que contenga un 20% de solución de Giemsa (diluido a 1/5 en agua destilada) durante 30 minutos, o un 10% de Giemsa durante 10 min (Figura3F).
    3. Enjuagar con agua del grifo y secar bien con papel tisú para ab.
    4. Sujete la corredera horizontalmente y aplique una gota del medio de montaje no acuoso sobre la mancha. Coloque el borde de un vidrio de cubierta en la diapositiva, atírela y presione suavemente para eliminar las burbujas de aire.
  2. Inmunocitoquímica en frotis de FNA
    1. Fije los frotis secados al aire en 100% metanol a temperatura ambiente durante 10 min.
    2. Lave la corredera durante 5 minutos en un frasco de Coplin con 1 x tampón de fosfato (PBS), repitiendo este paso 3 veces usando 1PBS fresco cada vez.
    3. Retire la diapositiva del frasco de Coplin, limpie el exceso de tampón sin tocar el frotis y dibuje un círculo alrededor del frotis con una pluma repelente al agua (Tablade materiales).
    4. Sujete la corredera horizontalmente y aplique 150 ml de solución de anticuerpos primarios diluidas en cada frotis e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.
      NOTA: El anticuerpo primario utilizado aquí es un antígeno anti-T.brucei VSG13 con suero de conejo no purificado (reactivo cruzado con muchos VSG T. brucei, producidos internamente), diluido en 1x PBS a 1:50.000. Realice controles negativos reemplazando el anticuerpo primario apropiado por suero preinmune (Tablade materiales)para permitir la evaluación de la unión no específica del anticuerpo secundario.
    5. Lave el portaobjetos durante 5 minutos en un frasco de Coplin con 1PBS, repitiendo este paso 3 veces usando 1PBS fresco cada vez.
    6. Sujete la corredera horizontalmente y aplique 150 ml de sistema de visualización de peroxidasa/DAB de rábano picante disponible en el comercialamente a cada frotis. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente (Tablade Materiales).
    7. Lavar durante 3 x durante 5 min en 1x PBS.
    8. Contramancha sumergiendo las diapositivas en un frasco de Coplin que contiene Hematoxilina Harris. Enjuagar con agua del grifo y secar bien con papel para ab.
    9. Sujete la corredera horizontalmente y aplique una gota del medio de montaje no acuoso sobre la mancha. Coloque el borde de un vidrio de cubierta en la diapositiva, atírela y presione suavemente para eliminar las burbujas de aire.

Resultados

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La FNA se realizó en los órganos reproductores masculinos externos de ratones infectados con T. brucei utilizando una aguja de 22 G acoplada a una jeringa de 5 ml, y portaobjetos de vidrio para la preparación del frotis (Figura1A-C). El método es simple pero los resultados óptimos se basan en pasos críticos: inmovilización perfecta del ratón lograda a través de anestesia general, y estabilización de los órganos a lo largo de todo el procedimiento (Figura2A-B). La succión se aplicó 2-3 veces y la aguja reorientó 1-2 veces para permitir el muestreo representativo de los órganos y tejidos más pequeños: epidídilo y grasa epidérmica. Se liberó presión negativa antes de externalizar la aguja. El aspirador contenido en el lumen y el cubo de la aguja (aproximadamente 20 l), se utilizó para producir 2 frotis (Figura3A-C). En los casos en que la aguja se retiró sin la liberación de la succión, el material se succionó en la jeringa y no se pudo recuperar. El proceso se repitió con éxito dos veces, una por cada órgano emparejado. Después del secado, se realizaron frotis fijos en húmedo e inmunocitoquímica para las proteínas de superficie de tripanosoma.

Un frotis de buena calidad (Figura4A-C)se caracterizó por una monocapa de células con buena densidad celular, en la que las células anfitrionas muestran características morfológicas preservadas, permitiendo la identificación de su tejido de origen y relativo proporción entre sí. Los parásitos fueron inmuno-teñidos, identificables y contables de manera eficiente (Figura4B). También se muestra un caso de FNA de derrame peritoneal en un ratón infectado, manchado con Giemsa para observación directa y diagnóstico (Figura3D-F y Figura 4C).

Un resultado pobre o negativo de FNA puede deberse a diferentes razones: (1) se expresa muy poco material FNA en la diapositiva y es subrepresentativo de la muestra; 2) el exceso de material FNA se expresa en una sola diapositiva, haciendo frotis demasiado gruesos y deteriorando la evaluación citológica; (3) se aplica demasiada fuerza al hacer el frotis, y las células se interrumpen, lo que resulta en una gran cantidad de núcleos desnudos y rayas de ADN (artefacto de aplastamiento); o (4) no se aplica suficiente fuerza al hacer el frotis y las células no se desagregan, lo que resulta en una capa estratificada que impide la evaluación de las características morfológicas de las células (Figura5).

Cuando comparamos la citopatología FNA con la histopatología, es decir, el análisis de las células frente a los tejidos, el puño tiene la ventaja de que la morfología celular se preserva mejor y las proporciones relativas y el recuento de células se pueden evaluar mejor (Figura6). Además, la inmunocitoquímica es más simple, rápida y fácil de optimizar que la inmunohistoquímica, que normalmente se realiza en tejido fijado en formalina y incrustado en parafina.

ObjetivoAplicacionesVentajasLimitaciones
Masa palpableMicroscopía de rutina, diagnósticoSimple, rápidoSin arquitectura de tejidos
ÓrganoImmunohistochemistryBajo costoAspiración ciega (la aguja puede perder el objetivo tangencialmente; la aspiración puede apuntar a áreas necróticas, quísticas o hemorrágicas)
EfusionesCitometría de flujoMuestreo desde múltiples sitios
CitogenéticaMorfología celular bien conservada
Microscopía electrónicaLibre de complicaciones
PCR, otras técnicas molecularesAlta precisión diagnóstica
Análisis bioquímicoAnestesia (para inmovilización)
Ensayos in vitro, cultivo celularProcedimiento no terminal

Tabla 1: Objetivo, aplicaciones generales, ventajas y limitación de la aspiración de agujafina.

Kit FNAArquetipo de aguja de aspiración y jeringa
Aspiración:Piezas de aguja:
1. Jeringas de plástico desechables (5 o 10 ml) (Figura1B) Bisel. La punta del eje de la aguja está inclinada para formar un punto, siendo la inclinación el bisel. Sólo las agujas biseladas son adecuadas para aspiraciones percutáneas.
3. Agujas de calibre 22 a 25 (diámetro); 0.75, 1.0, 1.5 pulgadas de largo, con borde de punta de aguja biselado estándar (Figura1A) El eje. Porción tubular hueca de la aguja cuya longitud puede ajustarse de acuerdo con la profundidad de la masa. El calibre de la aguja corresponde al diámetro de su agujero, que es el diámetro del interior del eje (las agujas más pequeñas tienen un calibre más alto). El uso de agujas de mayor diámetro (menos de 22 G) es útil para aumentar la celularidad, aunque esto puede producir contaminación excesiva de la sangre iatrogénica.
1. Anestesia (si es necesario). El dolor asociado con el FNA es similar al de una punción venosa, sin embargo, una buena aspiración requiere una buena inmovilización del sujeto, especialmente importante en animales de pequeño tamaño y/o para lesiones y órganos pequeños y fluctuantes. Las ratas y ratones sujetos a FNA deben ser adecuadamente retenidos pasivamente, o, cuando sea necesario, sedados o bajo anestesia general ligera. Hub. Porción de plástico de la aguja que está unida a la jeringa; debe ser transparente para permitir la visualización del material aspirado. El material aspirado obtenido durante el FNA debe recogerse en el eje de la aguja y la aspiración se detiene cuando se ve material entrando en el cubo.
FNA desprestigio e interpretación:Piezas de jeringa:
1. Diapositivas del microscopio de vidrio extremo esmerilado (Figura1C) Barril/cilindro. Parte hueca de la jeringa. A menos que se trate de lesiones quísticas o derrames, el material que se aspira al barril generalmente no se puede recuperar. El volumen ideal de aspirado para la citología FNA es de aproximadamente 5 l, correspondiente al volumen medio de aspiración que ocupa el eje y el cubo de la aguja.
2. Manchas de tipo Romanowsky (por ejemplo, Diff-Quik, Giemsa) La propina. Extremo del barril al que está unido el cubo de la aguja.
3. Microscopio (campo brillante) Plunger. Parte móvil de la jeringa que tiene un disco plano o labio en un extremo y un sello de goma en el otro extremo. Se adapta al barril y proporciona la presión para extraer las células, líquido en la aguja. Un émbolo perfectamente sellado que crea una buena presión negativa es obligatorio para obtener un buen rendimiento de aspiración.

Tabla 2: Equipo y suministros necesarios para la aspiración de agujas finas.

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Figura 1 : Herramientas y resultados para la aspiración de agujafina. (A) El diámetro ideal de la aguja para FNA es de 22 a 25 G. (B ) El volumen ideal de la jeringa para obtener un buen rendimiento de aspiración es de 5 a 10 ml. (C) Limpie, seque, libre de portaobjetos de vidrio graso con área de marcado esmerilado para escribir con lápiz y pre-revestido (si para inmunohistoquímica). (D) Ejemplo de tripanosomas observados con tinción Giemsa (punta de flecha negra), inmunomanchado para las proteínas de superficie VSG (punta de flecha blanca) y bajo microscopía electrónica de transmisión (flecha de bloque). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2 : Esquemas que muestran la aspiración con aguja fina (FNA) de los órganos reproductores masculinos externos (testículos, epidídimis y grasa epidérmica) en ratones. (A) Una vez asegurado el animal, se recoge el instrumento de aspiración previamente montado. (B-C) Inserte la punta de la aguja en el órgano objetivo. (D) Aplique la succión retirando el émbolo de la jeringa a la marca de 1 ml a 2 ml, repetidamente 3-4 veces. La punta de la aguja también se puede mover hacia adelante y hacia atrás dentro del objetivo mientras se aplica la succión, para recoger suficiente material. (E) Suelte la succión y sólo entonces retire la aguja. (F) Retire la aguja de la jeringa y (G) Tire del émbolo hacia atrás. (H) Vuelva a colocar la aguja. (I) Expulse el material sobre un portaobjetos de vidrio empujando el émbolo rápidamente a través de la jeringa. Para evitar salpicaduras, asegúrese de que la punta de la aguja se descanse muy cerca o incluso en la diapositiva. La gota de aspirado se coloca aproximadamente a 1 cm del borde del área de marcado esmerilado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3 : Preparación y tinciónde frotis. (A) Sujete un extremo de la diapositiva (área esmerilada) entre el pulgar y el dedo índice. (B) Coloque el borde limpio liso de un segundo portaobjetos (esparcidor) en el portaobjetos justo delante de la gota de material. (C) Deslice el pliego hacia adelante una vez con una velocidad moderada para obtener una película delgada. (D) Deje que la diapositiva se seque al aire y etiquete el borde esmerilado de la diapositiva con un lápiz. (E) Después de la dosis completa de secado con metanol durante 5 min. (F) Mancha con 20% giemsa solución durante 30 min (o 10% Giemsa durante 10 min). Enjuague ligeramente con agua, seque completamente, sumerja en xileno y se monte con un agente de montaje insoluble en agua. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4 : Microfotografíade frotis obtenidos de FNA de estructuras reproductoras masculinas externas en ratones infectados con T. brucei. (A) Apariencia bruta de un frotis directo de buena calidad: el material se expresaba sobre la diapositiva aproximadamente a 1 cm del borde esmerilado (punto negro), manchado y detenido 0,5 cm antes del borde de la diapositiva (líneas paralelas). (B) La inmunocitoquímica para las proteínas superficiales del parásito (VSG) se realizó para frotis obtenidos a partir de FNA de los órganos reproductores masculinos externos el día 6 de la infección. Se detectaron numerosos parásitos (cabeza de flecha) mezclados con células germinales del ratón (flecha). DAB contraatacó con Harris hematoxilina. Ampliación original: 40x (Barra de escala a 50 m). (C) La tinción de Giemsa del frotis obtenido después de la FNA de un derrame peritoneal el día 21 de la infección, mostró numerosos parásitos (cabeza de flecha) mezclados con células huésped (ratón), en este caso células inflamatorias, macrófagos (flecha) y linfocitos. Ampliación original: 40x (Barra de escala a 50 m). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5 : Frotis FNA de mala calidad. (A) Frotis celular deficiente, subrepresentativo de la masa u órgano. (B) Frotis muy grueso. (C) Artefacto triturado, con células interrumpidas, núcleos desnudos y rayas de ADN. (D) Agrega y estratifica capas de celdas. DAB contraatacó con Harris hematoxilina. Ampliación original: 20x (Barra de escala a 100 m). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6 : Comparación de citología e histología eepidímica en ratones infectados con T. brucei. (A) Microfotografías correspondientes a un frotis FNA y (B) una sección de parafina de 4 m, con el mismo aumento (20x aumento original, Barra de escala a 100 m), ambos inmunomanchados para las proteínas superficiales del parásito (VSG). El frotis mostró un gran número de parásitos (cabeza de flecha) con morfología celular bien conservada, mezclado con un número moderado de células germinales y pocos espermatozoides (flecha). La sección histológica mostró una arquitectura de tejido bien conservada, compuesta de conductos epidídimales con espermatozoides intraluminales (flecha), y la presencia de un gran número de parásitos que expanden el estroma epidérmico (cabeza de flecha). DAB contraatacó con Harris hematoxilina. Ampliación original: 20x (Barra de escala a 100 m). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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La aspiración de aguja fina (FNA) es un método ampliamente utilizado para diagnosticar enfermedades en animales humanos y domésticos. La técnica ha sido estandarizada durante muchos años1,2, que hace uso de una aguja de diámetro pequeño para aspirar células o líquido de una masa u órgano palpable1,3. El aspirador se frota típicamente en un portaobjetos de vidrio y se tiñe para la observación microscópica para lograr un diagnóstico, pero la técnica también se puede utilizar para recuperar células para otros fines4,5,6, 7 , 8 , 9.

El procedimiento es rápido (<5 min por ratón, para un investigador experimentado) y el riesgo de complicaciones es mínimo, similar al riesgo incurrido cuando se somete a una simple punción venosa. Por esta razón, para la FNA de masas palpables, la anestesia sólo es necesaria para lugares anatómicos sensibles o cuando una buena inmovilización del animal y la estabilización del órgano o masa a aspirar es extremadamente crucial para obtener resultados óptimos. Esto es frecuente para los animales de laboratorio pequeños, ya que la restricción segura y efectiva de un pequeño roedor con una mano, garantizando al mismo tiempo el mejor acceso a la zona para la aspiración con la otra mano, es difícil de lograr sin anestesia. La anestesia a corto plazo es en la mayoría de los casos suficiente, sin embargo, necesaria para un buen FNA en el ratón. Una buena inmovilización maximiza las posibilidades de obtener un aspirado que es representativo de los componentes celulares de la lesión y también minimiza las posibilidades de externalizar la punta de la aguja mientras se aplica presión negativa.

Aunque el procedimiento en sí es muy simple, la aplicación coordinada y la liberación de vacío son los pasos más críticos. Después de la inserción de la aguja, el émbolo de la jeringa se retrae para lograr un vacío controlado (succión), y la aguja sólo se puede extraer de la masa después de liberar la presión negativa al soltar el émbolo (Figura2); de lo contrario, el aspirado se aspira en el barril de la jeringa y luego es muy difícil de recuperar. Otro paso muy importante es la preparación de frotis de alta calidad. Hay varios métodos para hacer un frotis, pero independientemente del método, los frotis deben prepararse inmediatamente después de que el material se ha colocado en el vidrio. El material biológico debe extenderse suavemente para evitar artefactos de aplastamiento celular. El uso de una cubierta como esparcidor puede ayudar a prevenir estos artefactos. Sin embargo, la aplicación de demasiada fuerza al hacer el frotis romperá la cubierta. Un frotis de buena calidad normalmente tiene la mayor parte de la población celular distribuida como monocapa para que puedan transmitir fácilmente la luz. El material celular no debe quedar excesivamente atrapado en el coágulo de sangre.

El objetivo de un FNA es recoger células de una masa, tejido u órgano. El uso de agujas de mayor diámetro es útil para aumentar la celularidad, pero puede estar asociado con una contaminación excesiva de la sangre, mientras que el muestreo con agujas más pequeñas produce una mayor calidad, aunque un material menos abundante. En nuestro caso, la aspiración percutánea de las estructuras reproductivas masculinas externas en ratones infectados experimentalmente con T. brucei,se realizó con agujas de calibre 22 acopladas a una jeringa de 5 ml. Los ratones fueron anestesiados, los testículos fueron estabilizados con una mano y la punción y la aspiración guiaron y realizaron con la otra mano. Recuperamos numerosos tripanosomas mezclados con células germinales, espermatozoides, células epiteliales y células estromales, que fueron manchadas e inmunomanchadas para las proteínas superficiales de los parásitos (VSG) (Figura4).

Siempre existe el posible error de muestreo en los aspirados que producen resultados negativos porque aunque varias áreas de una lesión dada se pueden muestrear varias veces, esta es una aspiración ciega donde no visualizamos la punta de la aguja y el órgano o masa objetivo. Esto es extremadamente relevante en un entorno clínico, donde un FNA negativo de una lesión sospechosa no obvia más investigaciones, pero no es tan relevante en modelos animales de enfermedad. Por lo tanto, las limitaciones generales incluyen principalmente resultados negativos falsos, y con menos frecuencia resultados falsos positivos (por ejemplo, de contaminación de la sangre), pero la limitación más importante en el entorno de la experimentación animal es la falta de información sobre los tejidos arquitectura17,como tenemos con la histopatología, por ejemplo, el patrón de distribución de parásitos, de células inmunitarias y las características de interacción célula-célula. No obstante, las ventajas son que el FNA es un procedimiento no terminal que permite el muestreo repetido en el mismo tiempo de los animales y siempre permite una mejor conservación de la morfología celular (Figura5). Las alternativas al FNA para la recolección de células huésped, células inmunitarias o microorganismos de un ratón siempre dependen de la eutanasia del ratón para recoger la masa u órganos de interés.

Hasta donde sabemos, sólo hay unos pocos informes sobre el uso de FNA en pequeños animales de laboratorio, uno de 1949 correspondiente a la aspiración de la médula ósea con aguja de 22 G para estudiar la hematopoyesis18,y todos los demás en combinación con la citometría de flujo a cuantificar células inflamatorias asociadas a tumores o células endoteliales7,19,20. Nuestro trabajo muestra que esta técnica puede extenderse al diagnóstico y estudio de modelos de enfermedades infecciosas y puede combinar citología con técnicas como la inmunocitoquímica o la microscopía electrónica. Dos de las principales ventajas del método en animales experimentales son: 1) este procedimiento no es terminal, es decir, se puede realizar en ratones vivos; y (2) debido a su leve gravedad permite aspiraciones seriales en el mismo animal. Por lo tanto, se requieren menos ratones para cada estudio, y la correlación entre la progresión de la enfermedad clínica y la evolución de las características celulares y moleculares de una enfermedad y / o microorganismo se puede realizar fácilmente, lo que permite estudios longitudinales.

Tal vez el primer informe sobre el uso de FNA para el diagnóstico de enfermedades infecciosas es un estudio de Grieg y Gray en 1904 que informa de las aspiraciones de aguja de los ganglios linfáticos de los pacientes con enfermedad del sueño, que reveló tripanosomas móviles12. Si nuestros hallazgos en ratones de laboratorio encuentran traducción al ganado, es decir, que si el trypanosoma puede ser fácilmente muestreado por fNA de las estructuras reproductivas masculinas externas, uno puede esperar que esta técnica será útil para los veterinarios para el diagnóstico de animales tripanosomiasis en la granja, en el ganado.

Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este proyecto fue financiado por la Fundación para la Ciencia y una Tecnología (FCT)/ Ministério da Ciéncia, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) a través de Fundos do Or-amento de Estado (ref.: ID/BIM/50005/2019). LMF es Investigador a la Fundación para la Ciencia y la Tecnología (IF/01050/2014) y el laboratorio está financiado por ERC (FatTryp, ref.771714). La publicación de este trabajo también fue financiado por el proyecto UID/BIM/50005/2019 financiado por la Fundación para la Ciencia y una Tecnología (FCT)/ Ministério da Ciéncia, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) a través de Fundos do Or-amento de Estado. Agradecemos a Andreia Pinto del Laboratorio de Histología y Patología Comparada del iMM por la asistencia experta en Microscopía Electrónica, y a Sandra Trindade, Tiago Rebelo y Henrique Machado (iMM) por compartir tejidos de ratones infectados.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Atipamezol (ANTISEDÁN 10 mL)Bio 27418046Reversión de la anestesia
Cubreobjetos (24 x 60 n.º 1)VWR631-0664Frotis
DABDakoK3468Inmunocitoquímica
Entellan (500 mL)VWR1.07961.0500Medios de montaje
Diluyente de anticuerpos Envision Flex Dako8006Inmunocitoquímica
EnVision Flex conjugado con HRP (anti-conejo)DakoK4010Inmunocitoquímica
Envision Flex Wash Buffer DakoK8007Inmunocitoquímica Tinción
Giemsa Atom Scientific LtdRRSPSS-AFrotis
Portaobjetos de vidriera (Superfrost Plus)VWR631-9483Frotis
de Harris Hematoxilina Bio-óptica05-06004EInmunocitoquímica
Solución de peroxidasa de hidrógeno SigmaH1009-500MLInmunocitoquímica
Agujas hipodérmicas Microlance 3 (23 G)Henry Schein902-8001 Técnica deaspiración
Ketamina (IMALGENE 1.000-10 mL)Bio 27410928Anestesia
Medetomidina (DOMITOR 10 mL) Bio 27418335Anestesia
MetanolMerck1.06009.2511Fijador de frotis
Pluma Pap MerckZ377821-1EAInmunocitoquímica
Bloque de proteínas Libre de suero DakoX0909Jeringas de inmunocitoquímica
(5 mL, 10 mL)Henry Schein900-3311, 900-3304Técnica de aspiración
de

Referencias

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