El método de localización de inmunofluorescencia in vivo (IVIL) se puede utilizar para examinar la biodistribución in vivo de anticuerpos y conjugados de anticuerpos con fines oncológicos en organismos vivos utilizando una combinación de segmentación tumoral in vivo e inmunostainización ex vivo Métodos.
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Artículo de método
Localización de Inmunofluorescencia In Vivo para la Evaluación de la Biodistribución de Anticuerpos Terapéuticos y Diagnóstico en la Investigación del Cáncer
En este artículo
Resumen
Resumen
Los anticuerpos monoclonales (mAbs) son herramientas importantes en la detección, diagnóstico y tratamiento del cáncer. Se utilizan para desentrañar el papel de las proteínas en la tumorigenesis, se pueden dirigir a biomarcadores de cáncer que permiten la detección y caracterización de tumores, y se pueden utilizar para la terapia contra el cáncer como mAbs o conjugados de anticuerpos-drogas para activar las células efectoras inmunes, para inhibir señaldelas, o matar directamente las células que llevan el antígeno específico. A pesar de los avances clínicos en el desarrollo y producción de mAbs novedosos y altamente específicos, las aplicaciones diagnósticas y terapéuticas pueden verse afectadas por la complejidad y heterogeneidad del microambiente tumoral. Por lo tanto, para el desarrollo de terapias y diagnósticos eficientes basados en anticuerpos, es crucial evaluar la biodistribución y la interacción del conjugado basado en anticuerpos con el microambiente tumoral vivo. Aquí, describimos In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL) como un nuevo enfoque para estudiar las interacciones de la terapéutica basada en anticuerpos y el diagnóstico en las condiciones fisiológicas y patológicas in vivo. En esta técnica, se inyecta invivo un anticuerpo terapéutico o diagnóstico específico para antígenos in vivo y localizado ex vivo con un anticuerpo secundario en tumores aislados. Por lo tanto, IVIL refleja la biodistribución in vivo de fármacos a base de anticuerpos y agentes dirigidos. Se describen dos aplicaciones de IVIL que evalúan la biodistribución y la accesibilidad de agentes de contraste basados en anticuerpos para la toma de imágenes moleculares del cáncer de mama. Este protocolo permitirá a los futuros usuarios adaptar el método IVIL para sus propias aplicaciones de investigación basadas en anticuerpos.
Introducción
Los anticuerpos monoclonales (mAb) son grandes glicoproteínas (aproximadamente 150 kDa) de la superfamilia inmunoglobulina que son secretadas por células B y tienen una función primaria en el sistema inmunitario para identificar e inhibir la función biológica de, o marcar para patógenos bacterianos o virales, y puede reconocer la expresión anormal de proteínas en las células cancerosas1. Los anticuerpos pueden tener una afinidad extremadamente alta con sus epítopos específicos hasta las concentraciones femtomolares, lo que los convierte en herramientas altamente prometedoras en biomedicina2. Con el desarrollo de la tecno....
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Protocolo
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Panel Administrativo Institucional sobre Cuidado de Animales de Laboratorio (APLAC) de la Universidad de Stanford.
1. Modelo de ratón transgénico de desarrollo de cáncer de mama
- Observe ratones del modelo de cáncer deseado para el crecimiento del tumor adecuado a través de la palpación o la medición de la pinza antes de proceder.
NOTA: Aquí se utilizó el modelo murino transgénico del desarrollo del cáncer de mama (FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT). Estos animales desarrollan espontáneamente carcinomas mamarios invasivos entre las 6 y 12 semanas de edad en cada gl....
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Resultados
El método IVIL se utilizó aquí para examinar la biodistribución in vivo y la interacción tisular de B7-H3-ICG e Iso-ICG, permitiendo que los agentes, después de la inyección intravenosa en un animal vivo, interactúen con el tejido diana durante 96 h, y luego una vez que los tejidos cosechados, para actuar como los anticuerpos primarios durante la inmunomancha ex vivo. El método IVIL también se comparó con la tinción estándar ex vivo IF de los tejidos para el marcador B7-H3. Las glándulas .......
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Discusión
Este método tiene varios pasos críticos y requiere posibles modificaciones para garantizar una implementación correcta. En primer lugar, la dosis y el momento de la inyección intravenosa conjugada con anticuerpos/anticuerpos deben adaptarse a la aplicación específica. Generalmente, se deben utilizar dosis que sean consistentes con la forma en que el conjugado de anticuerpos se utilizará típicamente, es decir, dosis coincidentes del anticuerpo terapéutico o agente de contraste basado en anticuerpos. Además, se debe consid.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Andrew Olson (Stanford Neuroscience Microscopy Service) por las discusiones y el uso del equipo. Agradecemos al Dr. Juergen K. Willmann por su tutoría. Este estudio fue apoyado por la subvención NIH R21EB022214 (KEW), NIH R25CA118681 (KEW) y NIH K99EB023279 (KEW). El Servicio de Microscopía de Neurociencia de Stanford fue apoyado por NIH NS069375.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Animal fuerte | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | El Laboratorio Jackson | 002374 | Hembras, 4-6 semanas de edad |
| Animal Handling Supplies | |||
| 27G | Catéter VisualSonics | Por favor llame para hacer un pedido | Kit |
| de canulación de acceso a venas de cola Vevo MicroMarkerToallitas con alcohol | Fisher Scientific | 22-246073 | |
| Esponjas de gasa (4" x 4" 16 capas) | Cardinal Health | 2913 | |
| Lámpara de calor | Morganville Scientific | HL0100 | |
| Isoflurano | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
| Ungüento Oftálmico | Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Cinta Quirúrgica | 3M | 1530-1 | |
| Tissue Collection | |||
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
| Temperatura óptima de corte (OCT) Medio | Pinza Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Pinza Quirúrgica London | Fine Science Tools | 11080-02 | |
| Tijeras quirúrgicas | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor-488 cabra anti-ratas IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 cabra anti-conejo IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 cabra anti-humano IgG | Life Technologies | A11014 | |
| IgG humana Control | de isotipo Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| Anticuerpo humanizado anti-netrina-1 | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| Conejo anti-Ratón CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 |
| Clon Rata anti-Ratón CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clón |
| Reactivos | |||
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Clavo transparente Polaco | Cualquier farmacia local | ||
| Verde de indocianina - NHS | Intrace Medical | ICG-NHS éster | |
| Medio de montaje | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
| Suero de cabra normal | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
| Paraformaldehído (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Fosfato estéril solución salina tamponada (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Supplies | |||
| Adhesion Correderas de vidrio | VWR | 48311-703 | |
| Columnas de desalinización Fisher | Scientific | 45-000-148 | |
| Correderas de cubierta de vidrio | Fisher Scientific | 12-544G | |
| Pluma de barrera hidrofóbica | Ted Pella | 22311 | |
| Tubos de microcentrífuga | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| bandeja de tinción de portaobjetos | VWR | 87000-136 | |
| Software | |||
| FIJI | LOCI, UW-Madison. | Versión 4.0 | https://fiji.sc/ |
Referencias
- Forthal, D. N. Functions of Antibodies. Microbiology Spectrum. 2 (4), 1-17 (2014).
- Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity.
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Reimpresiones y permisos
