Artículo de método

Examen de la dinámica nuclear de levadura de ficción mitotica y meiótica por microscopía de células vivas de fluorescencia

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DOI:

10.3791/59822

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24 de junio de 2019

 ,  ,  , 
1Program in Molecular and Computational Biology, University of Southern California, 2Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos imágenes de células vivas que es un método de microscopía no tóxico que permite a los investigadores estudiar el comportamiento de las proteínas y la dinámica nuclear en las células de levadura de fisión viva durante la mitosis y la meiosis.

Resumen

La imagen de células vivas es una técnica de microscopía utilizada para examinar la dinámica celular y proteica en células vivas. Este método de diagnóstico por imágenes no es tóxico, generalmente no interfiere con la fisiología celular y requiere un manejo experimental mínimo. Los bajos niveles de interferencia técnica permiten a los investigadores estudiar las células a través de múltiples ciclos de mitosis y observar la meiosis de principio a fin. Utilizando etiquetas fluorescentes como Green Fluorescent Protein (GFP) y Red Fluorescent Protein (RFP), los investigadores pueden analizar diferentes factores cuyas funciones son importantes para procesos como la transcripción, la replicación del ADN, la cohesión y la segregación. Junto con el análisis de datos utilizando Fiji (una versión gratuita y optimizada de ImageJ), las imágenes de células vivas ofrecen varias formas de evaluar el movimiento de proteínas, la localización, la estabilidad y el tiempo, así como la dinámica nuclear y la segregación de cromosomas. Sin embargo, como es el caso de otros métodos de microscopía, las imágenes de células vivas están limitadas por las propiedades intrínsecas de la luz, que ponen un límite a la potencia de resolución en aumentos altos, y también es sensible al fotoblanqueo o fototoxicidad a alta longitud de onda Frecuencias. Sin embargo, con cierto cuidado, los investigadores pueden eludir estas limitaciones físicas eligiendo cuidadosamente las condiciones, tensiones y marcadores fluorescentes adecuados para permitir la visualización adecuada de eventos mitéticos y meióticos.

Introducción

La microscopía de células vivas permite a los investigadores examinar la dinámica nuclear sin matar las células de levadura de festedez y elimina la necesidad de fijadores y manchas letales. Es posible observar la estabilidad, el movimiento, la localización y el tiempo de las proteínas etiquetadas fluorescentes que están involucradas en eventos importantes como la replicación cromosómica, la recombinación y la segregación, además de la membrana y la citoesquelética Movimientos. Al mantener la viabilidad celular y la detección de señal no tóxica, hay una mínima intrusión fisiológica. Cuando se realiza correctamente, este método de microscopía puede reducir los efectos de confunción que surgen de la manipulación técnica extendida o de la reactividad química falsa. Además, durante un experimento, los investigadores pueden hacer observaciones pertinentes de los estados nutricionales y de estrés de la levadura de fisión, la eficiencia proliferativa y el estado apoptotico que indican parámetros de imagen inapropiados o fisiología celular anormal1 ,2,3.

La mitosis y la meiosis se caracterizan por la división nuclear y celular. En la meiosis, contrariamente a la mitosis, el contenidogenético se reduce a la mitad a medida que las células madre dan lugar a células hijas 4. Dado que las imágenes de células vivas proporcionan una dimensión temporal además de la relación espacial, se pueden examinar un gran número de celdas en tiempo real. La microscopía de células vivas ha permitido a los investigadoresexaminar la dinámica de la división nuclear utilizando etiquetas fluorescentes para histonas 5, cohesinasubunidades 6, microtúbulos7, centromeres8, quinetocoros9, componentes de el cuerpo del polo de husillo (SPB)10, y los del complejo de pasajeros cromosómicos (CPC)11. Fuera del aparato de segregación cromosómica, las imágenes de células vivas también han capturado el comportamiento de las proteínas necesarias, pero no directamente implicadas en la segregación cromosómica. Se ha demostrado que la función de estas proteínas influye en la replicación, la recombinación cromosómica, el movimiento nuclear y la unión cromosómica a los microtúbulos12,13,14. Estas observaciones han contribuido a una mejor comprensión de los eventos celulares cuyos componentes funcionales no eran susceptibles de examen bioquímico o genético. Con los nuevos avances en la tecnología de microscopía, se reducirán limitaciones como la mala resolución, el fotoblanqueo, la fototoxicidad y la estabilidad del enfoque, facilitando así mejores observaciones en tiempo real de la dinámica nuclear mitótica y meiótica1, 2,3. La meiosis es particularmente difícil, ya que es una vía de diferenciación terminal que requiere una atención cercana a la sincronización.

El objetivo de este protocolo es presentar un método relativamente simple para examinar la dinámica nuclear de la levadura en tiempo real en la mitosis y la meiosis. Para lograr esto, es necesario utilizar células que no han estado expuestas al estrés ambiental, preparar almohadillas de agarosa que puedan soportar imágenes prolongadas y montar células en densidades que faciliten la visualización de la dinámica de una sola célula. Además, este protocolo hace uso de células que transportan proteínas etiquetadas fluorescentes que sirven como marcadores útiles para la cinética nuclear (Hht1-mRFP o Hht1-GFP), segregación cromosómica (Sad1-DsRed), dinámica de citoesqueleto (Atb2-mRFP), transcripción activación en G1/S (Tos4-GFP) y estabilidad de cohesión en la meiosis (Rec8-GFP). Este método también introduce marcadores nucleares ycitosólicos adicionales (Tabla I) que se pueden utilizar en diferentes combinaciones para abordar preguntas sobre procesos celulares específicos. Además, se ofrecen herramientas básicas de Fiji para ayudar a los investigadores a procesar imágenes de células vivas y analizar diferentes tipos de datos. La fuerza de este enfoque se deriva del uso de observaciones en tiempo real de la dinámica de proteínas, el tiempo y la estabilidad para describir los procesos que son integrales para la correcta ejecución de la mitosis y la meiosis.

Protocolo

1. Preparación de medios15,16

  1. Soluciones de stock
    1. Preparar una solución de 50x salina añadiendo 52,5 g de MgCl26H20, 0,735 g de CaCl22X20, 50 g de KCl y 2 g de Na2S04 en un frasco que contiene 1 L de agua destilada. Mezclar la solución a fondo y esterilizar por filtración. Colocar a 4 oC para un almacenamiento a largo plazo.
    2. Hacer una solución de 1.000x vitamina stock mezclando 1 g de ácido pantoténico, 10 g de ácido nicotínico, 10 g de inositol, y 10 mg de biotina en una botella que contiene 1 L de agua destilada. Mezclar bien la solución y esterilizar por filtración. Manténgase a 4 oC para un almacenamiento a largo plazo.
    3. Preparar una solución de stock mineral de 10.000x añadiendo 5 g de ácido bórico, 4 g de MnSO4, 4 g de ZnSO4x 7H2O, 2 g de FeCl26H2O, 1 g de KI, 0,4 g de ácido molibddico, 0,4 g de CuSO4x 5H20 , y 10 g de ácido cítrico en un frasco que contiene 1 L de agua destilada. Mezclar la solución a fondo y esterilizar por filtración. Colocar a 4 oC para un almacenamiento a largo plazo.
    4. Hacer soluciones individuales de stock de nutrientes mediante la adición de 7.5 g de adenina, leucina, histidina o lisina en una botella que contiene 1 L de agua destilada. Utilice sólo 3,75 g para hacer la solución de uracilo. Esterilice las soluciones mediante autoclave.
      NOTA: Con el tiempo, el uracilo se precipita fuera de la solución. Para volver a poner en la solución, calentar en el microondas a un 60% de potencia en incrementos de 10 s o colocar en un baño de agua de 55 oC durante 20 minutos. Gire la solución tibia hasta que desaparezcan todos los grumos de uracilo.
  2. Extracto de levadura más suplementos (Si)
    1. En un matraz de 2 L, añadir 1 L de agua destilada, 5 g de base de extracto de levadura, 30 g de glucosa, y 225 mg cada uno de adenina, uracilo, L-histidina, L-leucina, y L-lisina. Añadir 20 g de agar para hacer el medio sólido.
    2. Utilice una barra de agitación magnética para disolver completamente los ingredientes en la solución. El agar se derretirá después de que el medio se esteriliza por autoclave.
      NOTA: Para mayor comodidad, el polvo YES listo para usar también está disponible comercialmente.
  3. Medio mínimo de Edimburgo (EMM) y medio de glutamato pombe (PMG)
    1. En un matraz de 2 L, combine 1 L de agua destilada con 3 g de ftalato de hidrógeno potásicos, 2,2 g de Na2HPO4,5 g de NH4Cl, 20 g de glucosa, 20 ml de solución salada, 1 ml de solución de vitamina , y 0,1 ml de solución mineral. Reemplace NH4Cl por 2,2 g de sal monosódica de ácido L-glutámico para preparar La PMG. Para hacer el medio sólido, añadir 20 g de agar.
    2. Con una barra de agitación magnética, disuelva bien los ingredientes. El agar se derretirá después de que el medio se esteriliza por autoclave. Antes de su uso, agregue soluciones de caldo de nutrientes según sea necesario. Por cada 1 L de medio, añadir 15 ml cada uno de adenina, leucina, histidina, y lisina. Utilice 30 ml para el uracilo, ya que está menos concentrado que las otras soluciones nutritivas.
      NOTA: Para mayor comodidad, los polvos EMM y PMG listos para usar también están disponibles comercialmente.
  4. Extracto de malta (ME)
    1. Utilice un matraz de 2 L para mezclar 1 L de agua destilada con 30 g de extracto de malta y 225 mg cada uno de adenina, uracilo, histidina y leucina. Ajuste el pH a 5,5. Incluya 20 g de agar para hacer el medio sólido.
    2. Disolver componentes en la solución utilizando una barra de agitación magnética. El agar se derretirá después de que el medio se esteriliza por autoclave.
  5. Agar de esporulación con suplementos (SPAS)
    1. En un matraz de 2 L, añadir 1 L de agua destilada, 10 g de glucosa, 1 g de KH2PO4, 1 mL de acción de vitaminas, 45 mg cada uno de adenina, uracilo, histidina, leucina, e hidrocloruro de lisina. Añadir 20 g de agar para hacer el medio sólido.
    2. Utilice una barra de agitación magnética para combinar bien los ingredientes. El agar se derretirá después de que el medio se esteriliza por autoclave.

2. Cultura de la levadura de fisión15,16

  1. Utilice el medio sólido YES para despertar las cepas de levadura de fission de la preservación criogénica. Dependiendo de los requisitos de temperatura de cada cepa, incubar a 25 oC o 32 oC durante 3-5 días.
  2. Cuando las colonias sean visibles, prepare un cultivo líquido de arranque. Recoger células de colonias individuales e inocularlas en tubos de ensayo que contengan un medio líquido DeS de 3 ml. Crecer a la temperatura adecuada hasta la fase de registro medio o tardío.
    NOTA: Para una aireación adecuada, utilice tubos o matraces con volúmenes al menos 5 veces mayores que el volumen de cultivo líquido previsto. Las velocidades de agitación entre 150-220 rpm son habituales para el crecimiento rutinario del cultivo.
  3. Dispensar 250-500 l de cultivo de arranque en un matraz de 50 ml que contiene 9,5-9,75 ml de YES, EMM o PMG más suplementos adecuados. Permita que las células crezcan a la densidad deseada y compruebe bajo el microscopio la morfología celular adecuada y el estado nutricional.
    NOTA: Para almacenar las cepas despertadas durante un mes, selle las placas YES con cinta adhesiva de parafina y colóquelas a 4oC.

3. Preparación de muestras2

  1. Configuración de diapositivas de microscopio
    1. Añadir 2 g de agarosa en un vaso de precipitados de 500 ml que contenga 100 ml de suplementos mínimos medios más (mitosis) o SPAS líquidos (meiosis). Caliente la solución de agarosa en un horno microondas a un 60% de potencia en incrementos de 10 s o colóquela en un baño de agua de 55oC durante 10 minutos. Prepare la configuración de deslizamiento de agarosa (Figura1A)para asegurar una rápida preparación de la almohadilla y evitar que la agarosa fundida se solidifique prematuramente.
    2. Deje que la agarosa fundida se enfríe durante 1 min a temperatura ambiente y dispensar puntos de 50-100 ml en portaobjetos de microscopio utilizando puntas de pipeta de gran calibre. Antes de que la agarosa se enfríe, coloque una diapositiva del microscopio en la parte superior para generar una almohadilla de propagación de aproximadamente 1,5-2 cm de diámetro (Figura1B-C). El ancho de la almohadilla de agarosa es típicamente proporcional a la duración del tiempo de imagen. En otras palabras, las almohadillas más gruesas soportan períodos de diagnóstico por imágenes más largos.
    3. Utilice una mezcla de hidrocarburos como sellador para asegurar una cobertura adecuada de los portaobjetos con almohadillas gruesas de agarosa y para evitar la muerte celular por exposición a disolventes en los bordes de cobertura. Mezclar partes iguales (p/p) de vaselina, lanolina y parafina en un vaso de precipitados de 500 ml. Caliente los ingredientes en una placa caliente a 120 oC durante 5 min. A medida que los componentes se derriten, gire cuidadosamente la solución fundida para asegurar una mezcla adecuada.
  2. Configuración de muestra
    1. Para el examen de eventos mitóticos, cultivar células de cultivos iniciales en EMM líquido o PMG más suplementos a aproximadamente fase de registro medio (OD595 de 0.4). Centrifugar 1 ml de la suspensión celular a 1.375 x g durante 1 min, retirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en el medio mínimo más suplementos a un volumen final de 100 l.
    2. Para crear imágenes de eventos meióticos, crezca las células de los cultivos iniciales en el medio mínimo más suplementos a la fase de registro tardío (OD595 de 0.7-1.0). Combine volúmenes iguales de celdas de tipo de relación de posición opuestas (h- y h+) en una suspensión de celda de 1 ml. Células centrífugas a 1.375 x g durante 1 min y resuspender el pellet en ME líquido. Repita este paso tres veces para asegurar la eliminación eficiente de nutrientes.
    3. Después del último lavado ME, resuspenda las células en 1 ml de ME y agréguelas a un matraz de 50 ml que contenga 9 ml de ME. Incubar durante 12-16 h a 22-25 oC en una velocidad de rotación mínima (50-100 RPM). Abundante floculación celular, que resulta en muchos grumos redondos de levadura de festez e indica un apareamiento eficiente.
    4. Tomar 1 ml de muestra del cultivo de apareamiento y centrífuga a 1.375 x g durante 1 min. Eliminar el sobrenadante pero dejar 250 ml en el tubo para resuspender las células. Antes de colocar las células en las almohadillas de agarosa, el vórtice vigorosamente durante 5 s para interrumpir los grumos.
      NOTA: Los 250 ml de ME restantes utilizados para resuspender las células contienen factores de apareamiento que ayudan a las células a entrar en la meiosis.
    5. Coloque 20 s de una suspensión de células mitoticas o meióticas en una almohadilla de agarosa del 2%. Retire cualquier medio sobrante invirtiendo la diapositiva y poniéndola en la parte superior de una toalla de papel sin pelusas durante 2-3 s (Figura1D). Coloque el lado de la almohadilla deslizante hacia arriba y coloque suavemente un cubreobjetos de vidrio, asegurándose de no generar burbujas de aire (Figura1F).
      NOTA: Eliminar el exceso de medio con una toalla de papel es más eficiente en el tiempo que la absorción de gravedad, lo que es particularmente crítico en los experimentos de meiosis.
    6. Para crear una monocapa de celda, gire el encubierto en el sentido de las agujas del reloj con el dedo índice para uno (mitosis) o dos (meiosis) giros completos (Figura1F). Asegúrese de que la materia celular se dispersa a través de la almohadilla de agarosa permitiendo una mejor separación de células individuales o asci. Con la ayuda de un pequeño palo de madera, dispensar sellador fundido a lo largo de los bordes de la cubierta para sellar cada almohadilla de agarosa (Figura1G).
    7. Una vez que la almohadilla de agarosa esté sellada, colóquela en la etapa del microscopio y déjela equilibrar durante 10-15 minutos en las condiciones de imagen adecuadas (por ejemplo, temperatura) (Figura1H)para permitir que las burbujas de aire se disimulen y deje que se produzcan cambios de agarosa de última hora. Comience la toma de imágenes una vez que la diapositiva se equilibra de manera eficiente y no la elimine de la etapa hasta que finalice la recopilación de datos.
      NOTA: El control de la temperatura y la humedad está determinado por el sistema de microscopio empleado y los requisitos experimentales específicos. Si está presente, aplique el control de temperatura y humedad a todos los experimentos de imágenes. Si está ausente, los investigadores deben idear una manera de prevenir las fluctuaciones de temperatura, especialmente durante los experimentos de meiosis.

4. Imágenes de células vivas2 y procesamiento

  1. Utilice el objetivo 40x para encontrar los campos de visión adecuados para la imagen. Cambie al objetivo 60x para iniciar la adquisición de datos. Dependiendo del sistema de microscopio utilizado, el posterior reenfoque y seccionamiento de la muestra en cada momento se producirá manualmente o a través de un proceso automatizado por microscopio o software.
    NOTA: Las imágenes presentadas en este protocolo fueron recogidas utilizando un microscopio de deconvolución, fluorescencia equipado con conjuntos de filtros Sedat, RFP y GFP, etapa de nanomovimiento, lente objetivo 60x NA 1.4 y cámara CCD de 12 bits. Las persianas mecánicas incorporadas y las ruedas de filtro motorizadas permiten la exposición reducida a la excitación y el fotoblanqueo de las muestras.
  2. Utilice el software adecuado para adquirir y procesar imágenes. Para desconvenir imágenes, emplee las funciones de transferencia óptica proporcionadas por el fabricante.
    NOTA: Para obtener más información sobre el equipo y el software del microscopio utilizados en este protocolo, consulte la Tabla de materiales.
  3. Utilizar un microscopio de fluorescencia convencional para adquirir imágenes de células vivas asegurar que el microscopio recopile datos digitalmente, tenga objetivos 40x o 60x con aperturas numéricas (NA) superiores a 1.2, y sea capaz de realizar seccionamientos ópticos.
    NOTA: Sin estos requisitos, las imágenes mostrarán una resolución reducida, comprometiendo la calidad de las mediciones microscópicas y las observaciones cualitativas.
  4. Utilice programas plug-in gratuitos (por ejemplo, Fiji) para minimizar los errores de desenfoque sistemáticos derivados de la pérdida de contraste durante la adquisición de la imagen17,18,19,20 y para garantizar un análisis cuantitativo adecuado de la intensidad de la fluorescencia y de otros eventos temporales y dinámicos dentro de la célula.
    NOTA: Otros programas de desconvolución comercial disponibles se pueden encontrar en la Tabla de Materiales.
  5. Elija los conjuntos de filtros del microscopio que mejor coincidan con los fluoróforos bajo observación. Asegúrese de que los filtros de excitación y emisión tengan las pasadas de banda adecuadas que permitan la detección específica de proteínas fluorescentes. Por ejemplo, para detectar la señal CFP, es apropiado un paso de banda de excitación y emisión de 430/25 y 470/30, pero no para la fluorescencia RFP.
  6. Utilice un enfoque de configuración mínima efectiva (MESA) al tomar imágenes por imágenes de la levadura de fission en varios momentos. En otras palabras, evite el uso prolongado de longitudes de onda de excitación y emplee la menor potencia de excitación y el tiempo de exposición que generen datos de imagen aceptables, pero cuantificables y reproducibles.
  7. Para imágenes prolongadas durante la mitosis o la meiosis, limite el intervalo entre los puntos de tiempo de adquisición a 5-10 min. Aunque las almohadillas de agarosa del 2% pueden soportar sesiones de imágenes de 12 a 16 h, es probable que se desplace la célula debido a la evaporación de la agarosa. Por lo tanto, realizar experimentos completos de mitosis o meiosis en ventanas de 4-6 h o 8-10 h, respectivamente.
  8. Recopilar datos de imágenes para 4-8 h que consisten en al menos 24-48 puntos de tiempo de adquisición, respectivamente, una proteína de fluorescencia y una pila z por punto de tiempo y un canal fluorescente compuesto por 13 secciones con un espaciado de 0,5-m utilizando un objetivo de 60x. Esto requiere al menos 0,5-1 GB de espacio de almacenamiento en el disco duro. Así, además de eliminar el blanqueo de fotoblanqueos y el desplazamiento de celdas, crear un flujo de trabajo que considere las capacidades informáticas1,2,3.
    NOTA: Estos parámetros de adquisición se establecen y modifican normalmente en el software que controla las funciones del microscopio y que recopila y procesa imágenes.
  9. Para examinar los procesos nucleares específicos con más detalle, realice la adquisición de imágenes cada 5-10 s, siempre y cuando la emisión no disminuya sustancialmente después de la exposición frecuente. Realizar un análisis preliminar de la intensidad de la fluorescencia durante diferentes períodos de tiempo para determinar el punto después del cual la precisión de los datos recogidos ya no es fiable1,3.
  10. En el software de adquisición de imágenes y procesamiento de imágenes, utilice la proyección de intensidad máxima en las pilas z de la imagen para observar todas las estructuras con alta densidad de fluorescencia en un plano 2D independientemente de su ubicación vertical1,2, 3. Esto facilita un examen rápido de los procesos nucleares que se producen en diferentes vóxeles. Recopile una imagen de campo brillante de centro medio para generar una imagen de referencia de las celdas bajo observación.

5. ImageAnalysis20,21

NOTA: El análisis de imágenes en este protocolo se realiza utilizando Fiji. Para otros programas de análisis y complementos de Fiji, véase Tabla de materiales.

  1. Cargue una imagen desconvolved seleccionando la función Importador de bioformatos en el menú Plugins. En la ventana emergente Opciones de importación, seleccione Hyperstack, Modo de color predeterminadoy seleccione Escalado automático antes de pulsar el botón Aceptar.
  2. Asegúrese de que la ventana mostrada tenga el número correcto de canales de fluorescencia y marcos de tiempo desplazándose hacia los lados en las barras respectivas en la parte inferior. Guardar como un archivo Tiff, que no comprime los datos y evita la pérdida de información.
  3. Abra una imagen que contenga una barra de escala generada durante el procesamiento de datos por el software del microscopio. Determine la longitud de píxel de la barra de escala con la herramienta Línea recta para dibujar una línea paralela de tamaño similar y seleccione Medir en el menú Analizar. Agregue una barra de escala estableciendo la relación píxel a m de la imagen seleccionando Establecer escala en el menú Analizar.
    1. En la ventana emergente Establecer escala, introduzca la Distancia calculada en píxeles y la Distancia conocida en ám, establezca la relación de aspecto de píxeles en 1.0, coloque micrones como unidad de longitudy marque la casilla Global antes de hacer clic en el OK.
  4. Utilice la opción Definir medidas en el menú Analizar para elegir diferentes parámetros para cuantificar al seleccionar Medir. Para los fines de este protocolo, seleccione las siguientes métricas: Area, Perimeter, Mean gray value, Median, Min & max gray value, Integrated density, Stack positiony Display etiqueta.
  5. Dependiendo de la precisión de los datos recopilados, introduzca más de 1 para la opción Lugares decimales y marque la casilla Notación científica si es necesario. Después de aplicar el comando Medir, una ventana emergente Resultados mostrará los valores de cada parámetro pertinente. Guarde los resultados como un archivo .csv para su análisis futuro en un programa de estadísticas.
    NOTA: No es necesario separar una imagen en sus canales fluorescentes constituyentes para determinar la longitud, a menos que haya interferencia de señal entre los diferentes colores en cuyo caso siga el paso detallado a continuación.
  6. En caso de interferencia de señal, seleccione Color y La herramienta Canales en el menú Imagen y analice cada color por separado. Para medir la longitud de las estructuras no lineales, haga clic con el botón derecho en la herramienta Línea y utilice la opción Línea segmentada o Línea a mano alzada para trazar los objetos deseados.
    1. Para estructuras lineales o para determinar la distancia entre dos puntos, utilice la función Línea recta y seleccione Medir en el menú Analizar. Los valores de la longitud en el m se añadirán automáticamente a los parámetros previamente seleccionados en la opción Establecer medidas.
  7. Para medir los cambios en el tamaño de la señal yla intensidad de la fluorescencia, primero cree una biblioteca de región de interés (ROI), que aumenta la precisión de la cuantificación y facilita las mediciones rápidas a través de una pila de imágenes. Seleccione Color y la herramienta Canales en el menú Imagen.
  8. En la ventana emergente Canales, compruebe el canal de color para el que se medirá la intensidad o el área. Elija las funciones Ajustar y Umbral en el menú Imagen. Marque la casilla Fondo oscuro, seleccione el método Predeterminado (a menos que los datos recopilados requieran lo contrario) y seleccione Rojo para superponer las señales de interés.
    NOTA: La medición de la estabilidad, el movimiento y la localización de proteínas dependen estrechamente del umbral de color utilizado para crear bibliotecas de ROI. Es importante elegir el método de umbral correcto para el tipo de señal de marcador fluorescente que se visualizará17,18.
  9. Utilice la herramienta Varita para resaltar cada estructura de interés y pulse la letra T del teclado para agregar el ROI seleccionado a la ventana emergente del administrador de ROI. Repita este proceso para cada sector (marco de tiempo) en la pila de imágenes y almacene todos los ROI haciendo clic en el botón Más y seleccionando Guardar.
  10. Abra la carpeta de ROI comprimido para cargar el gestor de ROI y haga clic en cada identificador de ROI en el panel lateral izquierdo. Seleccione Medir en el menú Analizar y repita este comando en cada identificador de ROI para cuantificar los objetos de interés en todos los sectores de la pila de imágenes.
  11. Si el desplazamiento de celda no es un problema y el plano focal sigue siendo el mismo para todos los sectores de la pila, haga clic en Multi medida en el gestorde ROI. En la ventana emergente, seleccione Medir todos los sectores en lugar de Una fila por sector para iterar mediciones en toda la pila de imágenes. Guarde los resultados como un archivo csv y analice las mediciones en un programa de estadísticas.
  12. Para múltiples señales nucleares que comprenden la estructura de interés, presione la tecla Mayús mientras selecciona objetos con la herramienta Varita para crear un único ROI. Alternativamente, cree un ROI de tamaño constante con la herramienta Oval para abarcar todas las señales de interés.
    NOTA: Este enfoque ovalado puede ser necesario para medir y describir el comportamiento de la señal sobre un área donde la señal de fluorescencia cambia de tamaño e intensidad con el tiempo. La intensidad de la señal, en este caso, es la densidad media de la señal sobre un área determinada.
  13. Determinar cualitativamente la colocalización de dos señales fluorescentes por el cambio de color de la región de superposición de señal. Sin embargo, a medida que la zona de colocalización se estrecha, es más difícil distinguir la superposición de señal. En este caso, siga los pasos que se detallan a continuación.
  14. Usando la Herramienta Canales, como se describe en el paso 5.6, dibuje una línea recta sobre cada señal en cuestión y seleccione el comando Trazar perfil en el menú Analizar.
    1. Repita este paso para todos los colores en cuestión utilizando la misma línea dibujada.
    2. En la ventana emergente Gráfica de muestra que aparece después de cada paso de generación de perfiles, presione el botón Lista para llamar una ventana Valores de trazado y guarde las medidas para cada señal como un archivo csv.
    3. En un programa de estadísticas, cree un gráfico que trace el valor gris para cada señal con respecto a su ubicación correspondiente (en ám) a lo largo de la línea dibujada. La falta de superposición entre las gráficas de perfil de señal generalmente indica la falta de colocalización.
      NOTA: Utilice la herramienta Perfil de trazado en imágenes proyectadas para examinar la colocalización de señal. Esto sólo es confiable si tal superposición también se observa a través de la pila z de la imagen.
  15. Para supervisar el comportamiento dinámico de las proteínas fluorescentes a lo largo del tiempo, utilice la herramienta Multi Kymograph que se encuentra en el menú Analizar. La imagen resultante muestra el movimiento de la señal fluorescente a través de una serie de instantáneas condensadas en cada segmento de la pila z, que representa puntos de tiempo individuales.
    1. Utilice la herramienta Canales como se describe en el paso 5.6 para aislar el objeto de interés en el canal correcto. Asegúrese de que el objeto o estructura seleccionado no se desplaza considerablemente a través de la pila z. Coloque una línea recta o un rectángulo sobre el objeto, seleccione la herramienta Multi Kymograph en el menú Analizar e introduzca el ancho deseado de la línea que superpone el objeto.
  16. Cree paneles de imágenes que muestren dinámicas nucleares en una ventana de tiempo específica utilizando la Herramienta Canales como se describe en el paso 5.6 y seleccionando las herramientas Pilas y Crear montaje en el menú Imagen. En la ventana emergente Crear montaje, introduzca el número de columnas y filas deseadas, establezca un Factor de escala de 1.0, elija los sectores Primero y Último (marcos de tiempo) y cambie Ancho de borde a al menos 5 antes de pulsar OK. Es posible elegir qué imágenes de la pila mostrar cambiando Incrementos para adaptarse a la secuencia deseada.
    1. Para generar una película, cargue el hiperstack deseado, seleccione Guardar como archivo avi en el menú Archivo, elija ninguno para Compresióne introduzca una velocidad de fotogramas de 2-8 fps. Seleccione el comando Crear montaje mientras selecciona Compuesto en la herramienta Canales para fusionar o separar todos los colores que componen la imagen.
      NOTA: En este protocolo se proporcionan dos archivos avi (Movie 1-2). Utilícelos en Fiji para probar diferentes características resaltadas a lo largo del paso 5.
    2. Para mostrar una sola celda representativa, utilice Transformar y rotar en el menú Imagen e introduzca grados de rotación. Los números negativos giran los objetos a la izquierda, mientras que los valores positivos giran los objetos a la derecha. Una vez que la celda esté en la orientación adecuada, dibuje un rectángulo que abarque toda la celda a través de la pila z o durante los marcos de tiempo de interés y seleccione Recortar en el menú Imagen. Proceda como se menciona en los pasos 5.16 y 5.16.1 para generar un panel de imágenes o una película.
  17. Agregue una barra de escala al panel de imágenes o a la película seleccionando Herramientas y Escala en el menú Analizar. En la ventana emergente Barra de escala, escriba 5-15 para Ancho en micrones para celdas individuales o 100-250 para campos de vista completos, elija blanco o negro para Color y elija una ubicación adecuada para colocar la barra de escala.
    1. Para las películas, es útil mostrar la progresión del tiempo durante los eventos nucleares. Para mostrar el cambio de hora entre fotogramas, seleccione Imagen, haga clic en Pilas, utilice la herramienta Time Stamper, indique el fotograma de inicio en la serie temporal y seleccione una ubicación adecuada para la visualización de la hora.

Resultados

Ya sea que las imágenes de células vivas se utilicen para la mitosis o la meiosis, es crucial emplear células de levadura de festede sana antes de realizar cualquier tipo de observación. La calidad de los datos resultantes depende en gran medida del material de partida. Si las células mueren de hambre debido a la limitación de nutrientes o el crecimiento excesivo, mostrarán el exceso de vacuolas y la disminución del tamaño celular (Inanición, Figura 2A). Para los experimentos de mitosis, es mejor evitar el uso de células que muestran estrés celular (Starvation, Figura 2A). De lo contrario, los resultados experimentales serán inconsistentes e irreproducibles. Para eludir esta limitación, elija controles de tipo salvaje adecuados y familiarícese con los diversos fenotipos de mutantes de interés. Por ejemplo, las células mitoticas hambrientas durante 12 h dejan de replicar activamente el ADN. Dado que la expresión Tos4-GFP está asociada con la actividad de fase G1/S22,23, las células logarítmicas que llevan este marcador y una para la división nuclear (Sad1-DsRed10) muestran la expresión pan-nuclear Tos4-GFP, Sad1-DsRed foci separación y septación continua (sugiriendo replicación activa del ADN y división celular) (Log, Figura 2A),mientras que las células hambrientas no muestran tal actividad (Hambre, Figura 2A). Este resultado es consistente con los efectos de la limitación de nutrientes en la levadura de fismo, que disminuyela transcripción en G1, activa el punto de control del ciclo celular G1/S y promueve la entrada G0 5. Para los experimentos de meiosis, las células deben crecer a una alta densidad, pero sin llegar a la fase estacionaria. Después, las células de ambos tipos de relaciones de posición se mezclan e incuban juntas en medios de bajo nitrógeno. Si no se aparea, como es el caso cuando las células no están suficientemente hambrientas de nitrógeno, evitará que entren en la meiosis (Ineficiente, Figura 2B). La floculación robusta de la suspensión de la célula de acoplamiento aumenta la interacción de célula a célula y, por lo tanto, indica un acoplamiento exitoso y una inducción meiótica eficiente (Eficiente, Figura 2B).

Las almohadillas de gel de agarosa y la alteración físicade los grumos celulares garantizan una visualización adecuada de células o asci (Log , Figura 2A; Eficiente, Figura 2B). Las almohadillas deben proporcionar una plataforma rígida, pero húmeda, en la que las células se fijan simultáneamente en su lugar y protegidas de la desecación. Además, las almohadillas deben ser lo suficientemente gruesas como para soportar los cambios debidos a la evaporación y proporcionar una superficie nivelada que permita un enfoque adecuado durante la adquisición de la imagen (Figura1C). La rotación del cubreobjetos es necesaria para separar y esparcir las células dentro de los agregados de acoplamiento (Figura1F; Eficiente, Figura 2B). Sin este paso, se observan pocos asci pero numerosas células haploides porque asci queda atrapado dentro de capas inaccesibles de grumos de apareamiento de apareamiento, mientras que las células haploides son libres de rellenar todos los puntos monocapa disponibles (Figura2B). Incluso para experimentos mitóticos, donde el aglutinamiento celular es menos problemático, la rotación de la cubierta mueve las celdas alrededor del pad para crear una sola capa de celda con suficiente espacio entre las celdas para reducir los efectos de aglomeración y permitir la duplicación de celdas (Log, Figura 2A ).

Atb2 es un componente de la tubulina implicado en la segregación cromosómica en la mitosis por levadura de fission y la meiosis7,14. Cuando está etiquetado fluorescentemente, este componente del citoesqueleto permite examinar las etapas que caracterizan la separación nuclear en la mitosis. Durante la profase (0'-20', Figura 3A),la nucleación del husillo mitótico se produce en el lado nuclear de los cuerpos de los polos del husillo (BSP), según lo revelan las fibras Atb2-mRFP en un fondo pannuclear Htt1-GFP5. Durante la transición metafase-anafase (20'-40', Figura 3A) el husillo mitético se extiende hacia afuera y el núcleo se divide en dos. A medida que la célula entra en la telofase (60'-80', Figura 3A),Atb2-mRFP se expande bidireccionalmente hasta que los cromosomas están completamente separados. Después de este punto, las fibras Atb2-mRFP se reagrupan y se extienden a través de la superficie celular para recuperar su forma interfase en cada una de las células hijas resultantes. La citoquinesis (>120', Figura 3A) se produce sólo después de que un tabique se forma y divide la célula por fission. A raíz de los cambios en la intensidad de Hht1-GFP a lo largo de un ciclo mitético se revelan tres pasos importantes en la dinámica nuclear: metafase-anafase (intensidad media, compactación del ADN: 20'-40', Figura 3A-B),telofase (baja intensidad, separación del ADN: 60'-80', Figura 3A-B), y G1 (intensidad creciente, duplicación de ADN: 100'-120', Figura 3A-B). Del mismo modo, pero utilizando células que sólo llevan hht1-mRFP y empleando la herramienta multi-kymograph (ver paso 5.15) en Fiji, es posible observar la división mitótica desde la metafase hasta la telofase y evaluar los movimientos nucleares involucrados durante el cromático hermano adecuado segregación (Normal, Figura 3C). Los kymographs de segregación incorrecta muestran la actividad de la señal entre las dos vías nucleares principales, lo que indica una posible segregación errónea debido a la fragmentación cromosómica o a la separación cromátida inapropiada (Retraso, Figura 3C).

Como se mencionó anteriormente, en la levadura en ciernes y físiones, Tos4 se transcribe en G1 y funciona durante la replicación del ADN en la fase S22,23. Esto se puede observar en un kymograph donde la expresión Tos4-GFP aumenta en el núcleo después de Sad1-DsRed10 focos se mueven a direcciones opuestas (indicando división nuclear), pero antes de las formas del tabique, que precede a la citoquinesis (39', Figura 3D ; 36', Figura 3E). La fase de alta actividad Tos4-GFP comienza al final de la transición M-G1/S (45', Figura 3E)y termina en G2 (>60', Figura 3E),justo después de la división celular. Aunque se difunde en gran medida durante G1, la intensidad de la señal Tos4-GFP aumenta después de la anafase y a lo largo de la fase S y co-localiza con focos sad1-DsRed segregados (45'-60', Figura 3E). Este resultado revela el período de septación en la levadura de fissión cuando la duplicación del genoma ha comenzado en las células hijas (G1/S), pero la citoquinesis aún no se ha producido.

Hht1 es histona H3 en levadura de fismo y semodifica comúnmente con etiquetas fluorescentes para visualizar ADN nuclear 5,14. En la mitosis, a medida que las células pasan de la metafase a la telofase (20'-120', Figura 3A),se observan dos cambios distinguibles en la masa nuclear. El primer cambio implica una contracción del tamaño nuclear en metafase (20',Figura 3A),mientras que el segundo muestra la división del núcleo durante la anafase (40', Figura 3A). Además de compartir estos cambios con las células mitoticas, las células meióticas exhiben oscilación nuclear (es decir, cola de caballo) (-100' a -50', Figura 4A-B) durante la recombinación homóloga y una mayor reducción del tamaño del núcleo al final de la anafase II (70'-90', Figura 4A). Hht1-mRFP se utiliza para examinar fenotipos de segregación incorrecta, como el retraso o los cromosomas fragmentados (rezagado, figura 3C). También se emplea para observar y describir la dinámica nuclear en cada una de las fases de la meiosis (Figura4A-B). La masa nuclear es grande y fluctúa en tamaño durante gran parte de la cola de caballos (HT: -100' a -50', Figura 4A-B)). A medida que las células entran en la metafase (MT: -40' a 0', Figura 4A-B),el tamaño nuclear y la oscilación disminuyen, consistente con el aumento de la actividad de condensación en esta etapa. El inicio de la anafase I (MI: 10'-60', Figura 4A-B)y II (MII: 70'-90', Figura 4A-B)se asocia con una mayor reducción nuclear y la falta de movimiento nuclear, que se correlaciona bien con las dos divisiones nucleares que caracterizan meiosis I y II (MI y MII). Por lo tanto, la meiosis se asocia con fluctuaciones del tamaño nuclear cuando los cromosomas homólogos se alinean y se recombinan y con reducciones de tamaño nuclear después de dos rondas de separación cromosómica. Los alelos que cambian estas dinámicas nucleares probablemente se asocien con la regulación de la estabilidad del genoma en meiosis12,13.

Rec8 es la subunidad de la cohesina meiótica en la levadura de fismo. Se carga en la cromatina después de la replicación del ADN (mei-S) y mantiene los cromátidos hermanos atados entre sí hasta la anafase II. Después de la metafase I, Rec8 se elimina de los brazos cromosómicos por separasa y está protegido en el centromere por Sgo1-PP2A. Al final de la segregación de homólogos, Rec8 también se elimina en el centromere, permitiendo así la separación cromada hermana (Figura5A)6,24. Rec8-GFP junto con marcadores de segregación cromosómica como Sad1-DsRed o Hht1-mRFP permiten la visualización de la dinámica de cohesión durante la meiosis. La señal Rec8-GFP es pannuclear durante mei-S (<<-90', Figura 5A-B),profase I (-90' a -50', Figura 5A-B),y metafase I (-40' a 0', Figura 5A-B). Esta observación revela la asociación de Rec8-GFP a lo largo de los ejes cromosómicos que sigue a la duplicación de ADN. A medida que las células entran en la anafase I (10', Figura 5A-B),la intensidad Rec8-GFP disminuye a lo largo del núcleo, pero permanece fuerte en el centromere, donde forma un enfoque en cada masa nuclear (20'-70', Figura 5A-B). Este resultado es consistente con la degradación de Rec8-GFP a lo largo de los brazos cromosómicos, pero no en el centromere, que se deriva después de la segregación homóloga. Antes de la anafase II, el enfoque Rec8 desaparece, liberando cromátidos hermanospara la separación en MII (70'-80 ', Figura 5A-B). El marcador Rec8-GFP es, por lo tanto, útil para examinar las condiciones que interrumpen el establecimiento, la eliminación y la estabilidad general de la cohesión meiótica. Junto con un marcador de división nuclear como Hht1-mRFP5,13, Rec8-GFP se puede emplear para abordar cuestiones de cómo el tiempo de cohesión y la estabilidad antes y durante la meiosis afectan la segregación cromosómica adecuada12 ,13. Este protocolo no aborda las proteínas cuya dinámica se produce principalmente en el citosol. Sin embargo, la Tabla I muestra algunas proteínas citosólicas que se utilizan comúnmente para examinar los procesos de citoesqueleto y membrana necesarios para la endocitosis, la excitosis y la citoquinesis entre otros procesos.

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Figura 1: Preparación de almohadillas de agarosa para imágenes de células vivas. ( A ) Configuración de preparación deslizante montada con un soporte de punta de pipeta, cintadelaboratorio y portaobjetos de microscopio. Colocar diapositivas perpendiculares entre sí crea un bolsillo donde se forma la almohadilla de agarosa. La adición de piezas de cinta de laboratorio en los lados ajusta el ancho de la almohadilla de agarosa a las especificaciones requeridas. (B) La agarosa fundida se deja enfriar antes de ponerla en las diapositivas del microscopio para hacer almohadillas. En este paso, es necesario dispensar el volumen de agarosa lentamente para evitar la creación de burbujas de aire. (C) La corredera superior se coloca en el punto de agarosa dispensado para formar una almohadilla circular con una superficie recta, bordes uniformes y sin grietas de agarosa visibles. (D) Después de poner una muestra de suspensión celular en la almohadilla de agarosa, invierta la diapositiva y coloque sobre una toalla de papel sin pelusas para eliminar el medio líquido extra. (E) Coloque cuidadosamente un cubreobjetos en la almohadilla de agarosa, asegurándose de no atrapar ninguna burbuja de aire y comprobando que el plano de enfoque es plano para evitar el cambio de celda y los problemas de enfoque. (F) Lentamente y con precaución, gire el cubreobjetos en el sentido de las agujas del reloj para interrumpir los grumos de celda y para generar una monocapa de celda que permita la expansión de la celda y una mejor visualización de la célula. (G,H) Utilice una mezcla de hidrocarburos calentados para sellar almohadillas de agarosa y permitirles equilibrarse a la temperatura deseada antes de tomar imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Seleccionar las celdas correctas. (A) Los paneles superiores muestran células de levadura de fismo que se dejan morir de hambre en EMM más suplementos para 72 h y el panel inferior muestra las células que experimentan crecimiento logarítmico. En las células que se dejan morir de hambre, se pueden apreciar morfologías de células pequeñas. La flecha abierta roja muestra gránulos vacuolares que son característicos de la inanición. En los cultivos logarítmicos, abundan las células que muestran morfologías alargadas y septa (flecha roja), lo que indica la dinámica de ciclismo activa. Los paneles del lado derecho muestran celdas que expresan señales Tos4-GFP y Sad1-DsRed durante la inanición y la proliferación. La expresión Pan-nuclear Tos4-GFP y Sad1-DsRed señala que la localización a polos celulares opuestos se ve durante la proliferación activa, pero no en el hambre. (B) El panel superior muestra las celdas del mismo tipo de relación de posición (h+) que no se pueden relacionar de forma eficiente. La flecha abierta roja muestra un par de células vacuolares sometidas a karyogamy. Esto no es inusual en cultivos de células h+, donde el 10% de las células pueden cambiar el tipo de relación de posición a h-. El panel inferior muestra asci resultante de un acoplamiento eficiente. Los asci ci ci cigóticos toman múltiples formas, incluyendo el zig-zag (flecha roja) y las formas de celda de plátano (flecha abierta roja). Barra de escala de 5 m de longitud. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Dinámica nuclear mitotica. (A) Las proteínas Histone H3 (Hht1-GFP) y microtúbulos (Atb2-mRFP) se siguieron durante un ciclo de mitosis (120 min). Las señales individuales para Hht1-GFP y Atb2-mRFP se muestran en paneles en blanco y negro, mientras que la fusión BF las muestra en sus respectivos colores. (B) Cuantificación de la intensidad de Hht1-mGFP durante un ciclo mitético. El cambio en los niveles de Hht1 es indicativo de la división nuclear durante la mitosis y la duplicación de ADN en G1. (C) Kymographs que muestran segregación normal o anormal en la mitosis donde las trayectorias nucleares resultantes se bifurcan y conservan la integridad del ADN o se desvían y promueven la fragmentación cromosómica o la separación cromátida prematura, respectivamente. (D,E) Paneles de kymograph y micrografía que muestran la duración de M-to-G1/S revelado por la segregación de Sad1-DsRed y la aparición de señales nucleares Tos4-GFP. Tenga en cuenta los paneles centrales de E que se generaron utilizando el FIRE LUT en Fiji para crear un mapa térmico graduado de intensidad que facilita la identificación de puntos con alta expresión Tos4-GFP; en este caso, localizado al núcleo y superponiendo señales Sad1-DsRed, como se esperaba. Barra de escala de 5 m de longitud. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Dinámica nuclear meiótica. (A) Serie de paneles que muestran el movimiento, la compactación y la división del núcleo (Hht1-mRFP) durante la meiosis. La cola de caballos (HT) muestra amplias oscilaciones nucleares de lado a lado seguidas de Metafase (MT), donde el movimiento lateral nuclear disminuye y se detiene por completo justo antes de la anafase I. En la meiosis I (MI), la masa nuclear principal se divide en dos, mientras que en la meiosis II (MII) se generan cuatro núcleos durante el proceso de separación cromátida hermana. (B) Cuantificación del cambio de área nuclear (Hht1-mRFP) en profase, metafase, MI y MII. El área nuclear es dinámica durante las oscilaciones HT, se condensa en MT, y disminuye aún más en el tamaño durante MI y MII, donde se observa poco movimiento nuclear (Eje Nuclear Largo). La medición del eje nuclear más largo (Eje Nuclear Largo) se basa en la idea de que como un círculo se estira, deja de tener un diámetro constante y genera al menos dos ejes principales: largo y corto. Por lo tanto, al monitorear los cambios en el núcleo, los cambios en el eje largo o corto proporcionan indicaciones de movimiento nuclear. Barra de escala de 5 m de longitud. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Dinámica de cohesina meiótica. (A) Serie de grupos especiales que muestran cómo el cambio de señal Rec8-GFP se correlaciona con la dinámica nuclear meiótica. Durante HT y MT, la señal Rec8-GFP es pan-nuclear y sigue el movimiento nuclear (Hht1-mFRP). En MI, Rec8-GFP se disipa del núcleo, dejando sólo un par de focos, que es consistente con la eliminación de Rec8 de los brazos cromosómicos y el establecimiento de la protección Sgo1-PP2A en el centromere. A medida que la célula se acerca a MII, los focos Rec8-GFP comienzan a desaparecer y ya no se ven justo antes de la anafase II. (B) Cuantificación de la intensidad Rec8-GFP de HT a MII. Similar a lo que se ve en A, la señal GFP es alta a través de HT y MT, disminuye sustancialmente durante MI y desaparece por completo en MII. Este patrón corrobora la dinámica de la cohesina en los brazos cromosómicos y el centromere, donde mantiene los cromátidos hermanos atados hasta que están listos para ser separados en MII. Barra de escala de 5 m de longitud. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ProteínaFunciónComentariosetiquetaReferencias
Hht1Histone H3 participa en el empaquetado de ADNSe utiliza para examinar la dinámica cromosómicaHht1-mRFP5,14
Tos4La función Tos4 se produce durante la fase G1Empleado para estudiar el tiempo G1Tos4-GFP22,23
Rad21/ Rec8Subunidades de Cohesin involucradas en mantener los cromátidos hermanos juntos después de la replicaciónSe utiliza para analizar la estabilidad de cohesión durante la lógica (Rad21) y la segregación meiotica (Rec8)Rad21-GFP/Rec8-GFP6,24
Rad11La actividad de RPA ocurre durante la reparación mitotica del ADN, la recombinación meiótica y termina en metafaseEmpleado para estudiar la reparación del ADN en la mitosis y la dinámica de recombinación en la meiosisRad11-YFP5,13
Rad52La atividad rad52 tiene lugar durante la reparación mitotica del ADN y la recombinación meióticaEmpleado para estudiar la reparación del ADN en la mitosis y la dinámica de recombinación en la meiosisRad52-CFP5,13
Cnp1Histone H3 CENP-A localiza específicamente en el centromereSe utiliza para seguir la dinámica de segregación cromosómica en mitosis y meiosisCnp1-mCherry13
Swi6Proteína de homólogo HP1 implicada en la formación de heterocrocromatinaEmpleado para estudiar la movilización de heterocromatina en los centromere y telómerosSwi6-GFP13
Sad1Sad1 participa en la localización del cuerpo del polo de husillo en la envolvente nuclearEmpleado para analizar la segregación cromosómica en mitosis y meiosisSad1-mCherry10
CYTOSOL & MEMBRANE
Atb2Tubulina alfa 2 implicada en la organización del citoesqueleto de microtúbulosSe utiliza para examinar la segregación cromosómica en la mitosis y la meiosisAtb2-mRFP7,14
Ync13Regulador de exóctosis y endocitosis involucrado en el transporte mediado por vesículasEmpleado para estudiar la integridad de la pared celular durante la citoquinesisYnc13-mECitrine25
Rlc1Subunidad Myosin II implicada en la contracción del anillo contráctileSe utiliza para explorar la dinámica de la maduración del tabique y la contracciónRIc1-mCherry25
Ccr1NADPH-citocromo p450 reductasa que forma parte de la membrana externa ER, plasma y mitochrondrialEmpleado para examinar la dinámica asociada a la membrana, como la endocitosis, la excitosis y la citoquinesisCcr1N-GFP5
Gef1Rho guanyl-nucleótido factor de intercambio involucrado en el establecimiento y mantenimiento de la polaridad celularSe utiliza para examinar la dinámica global de polaridad celular dependiente del microtúbuloGef1-mCherry-GBP26
Fus1Formin involucrado en el ensamblaje de enfoque de fusión actina durante la citogamiaSe utiliza para estudiar la dinámica de fusión asociada con el apareamiento de levadura de fisiónFus1-sfGFP27
Mnn9Subunidad de manolsyltransferasa implicada en la glicosilación ligada a la proteína N en el aparato GolgiEmpleado para estudiar la maduración de la carga en el Golgi a medida que avanza de cis-Golgi a trans-GolgiMnn9-mCherry28
Num1Factor de anclaje cortical para la dinneina implicada en el acolamiento de caballosSe utiliza para examinar el anclaje de dinaína dependiente de las mitocondrias durante la oscilación nuclear en la profase I meióticaNum1-yEGFP29

Tabla 1: Marcadores de dinámica nuclear y citosólica.

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Película 1: Transición m-a-G1/S que muestra el cuerpo del polo del husillo (SPB; Sad1-DsRed) separación previa a la sepción y acumulación de señal nuclear Tos4-GFP. Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)

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Película 2: Finalización del ciclo mitético que muestra la extensión del microtúbulo (Atb2-mRFP) correlacionada con la división nuclear (Hht1-GFP). Por favor, haga clic aquí para ver este video. (Haga clic con el botón derecho para descargar.)

Discusión

Las imágenes de células vivas durante la mitosis y la meiosis ofrecen la oportunidad de examinar la dinámica nuclear sin interrumpir sustancialmente la fisiología de la levadura de fismo durante la adquisición de datos. Sin embargo, se debe tener precaución para garantizar que las células crezcan a las densidades deseadas libres de tensiones ambientales; y para la meiosis, que las células se imágen durante el tiempo de diferenciación terminal y no demasiado temprano o tarde. El exceso de habadeo celular, el hambre y las temperaturas de crecimiento inapropiadas son factores comunes que contribuyen a observaciones irreproducibles. Además, durante la construcción de la tensión, es crucial probar que las etiquetas fluorescentes no interfieren con las funciones de los genes diana ni afectan la aptitud celular general. Si no se inspeccionan de cerca los fenotipos de las cepas portadoras de marcadores fluorescentes, se pueden producir resultados inconsistentes e incomparables en genotipos similares.

Aunque las almohadillas de agarosa del microscopio son fáciles de montar, también pueden suponer un obstáculo para obtener valiosos datos de imágenes. Crear almohadillas de agarosa es tan simple como colocar tres diapositivas de microscopio paralelas entre sí, dispensar agarosa fundida en la diapositiva central y colocar una diapositiva que transversala la parte superior de las otras diapositivas. Es útil, sin embargo, montar un aparato de portaobjetos que permita modificaciones de anchura para fabricar almohadillas de agarosa resistentes y específicas de la situación. Un simple portaobjetos que proporciona flexibilidad de ancho de almohadilla consta de una plataforma (soporte de puntas de pipeta o banco), dos diapositivas de microscopio y cinta de laboratorio que actúa como mecanismo de ajuste de ancho de almohadilla (Figura1A). El grosor exacto de la almohadilla dependerá de los requisitos de tiempo de imagen, la marca de agarosa, la temperatura, el sellador de encubrimiento, la tasa de evaporación, etc. Por lo tanto, es importante calibrar el sistema de imágenes antes de la adquisición de datos para aumentar la reproducibilidad técnica y mejorar la calidad de las imágenes de células vivas1,2,3. La superficie de la almohadilla, la rigidez y la composición son esenciales durante la adquisición prolongada de la imagen. La agarosa tiene baja fluorescencia de fondo, se puede moldear fácilmente, y en la concentración adecuada, resiste la deformación estructural debido a la evaporación. Además, la combinación de medios de levadura de fission con agarosa no compromete la calidad de la imagen y permite la observación prolongada de múltiples ciclos de mitosis y meiosis. Además, es importante evitar cualquier burbuja de aire para la microscopía de lapso de tiempo. Dentro de las almohadillas de agarosa y dentro de la muestra, las bolsas de aire se expanden con el tiempo, causando el cambio de celda y alterando los planos focales. Siempre que las células se separen eficientemente por rotación de encubrimiento, los investigadores pueden seguir los procesos mitéticos a lo largo de varias generaciones y eventos meióticos desde la fusión nuclear hasta la esporulación. Hacer y elegir la almohadilla adecuada para los experimentos de imágenes requiere tiempo para dominar, pero una vez logrado, puede contribuir a observaciones de microscopio altamente informativas.

Como es el caso de otros métodos, la microscopía de células vivas no está libre de limitaciones técnicas. El uso de proteínas etiquetadas fluorescentes introduce límites a los experimentos que limitan el alcance de lo que se puede estudiar. El blanqueamiento fotográfico y la fototoxicidad son problemas típicos de la adquisición prolongada de imágenes. Pueden ser contrarrestados al no exponer las células a longitudes de onda cortas durante demasiado tiempo o con demasiada frecuencia. Para experimentos con GFP, CFP, YFP, mRFP y DsRed, proteínas fluorescentes típicas utilizadas en imágenes de células vivas de levadura de fission, es común emplear 5-15% de luz de excitación y 100-500 ms de tiempo de exposición para experimentos de rutina. Estos parámetros cambian, sin embargo, de acuerdo con los requisitos específicos del experimento del investigador. Además, las pilas z compuestas de 9-13 secciones con un espaciado de 0,5 m utilizando un objetivo de 60x es suficiente para resolver el grosor de una célula de levadura de fismo. Además, es importante confirmar que los marcadores fluorescentes no interrumpen la regulación o función adecuada de las proteínas diana ni generan fenotipos espurios. Por lo tanto, es aconsejable construir cepas que contengan diferentes etiquetas fluorescentes y de afinidad para el mismo gen objetivo para corroborar las observaciones por diferentes medios. Además, es responsabilidad de los investigadores asegurarse de que los parámetros experimentales se pueden reproducir a través de experimentos y que los datos recogidos son aptos para el análisis posterior1,3. Ninguna tecnología puede reemplazar la práctica probada de validar meticulosamente los sistemas experimentales mediante una observación cuidadosa y un examen riguroso de la linealidad en la detección de señales fluorescentes.

Por último, es crucial analizar los datos de microscopía en formatos que no modifiquen imágenes en bruto. Fiji proporciona excelentes herramientas de documentación para realizar un seguimiento de las mediciones de datos sin procesar y permite a los investigadores examinar diferentes parámetros celulares en una sola sesión. Estas características, así como su gran cantidad de tutoriales en línea y una amplia cobertura literaria, hacen de Fiji una herramienta importante para medir, analizar y presentar datos de imágenes de células en vivo que describen la dinámica nuclear de la levadura de fismo en la mitosis y la meiosis.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores quieren agradecer a Natalia La Fourcade y Mon LaFerte por hacer de la preparación de este manuscrito un esfuerzo más agradable. Gracias a los miembros del Laboratorio de Forsburg que contribuyeron a la finalización de este trabajo con su visión, ideas de experimentos y apoyo moral. Este proyecto fue apoyado por NIGMS R35 GM118109 a SLF.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Lente de objetivo apocromático Plan 60xOlympusAMEP4694
AdeninaSigmaA-8751
Agar7558BIB4917-10 kg
AgarosaSigmaA9539-500g
Rotador de bailarinas del vientreStovallPatente de EE. UU. # 4.702.610
BiotinaSigmaB-4501
Ácido bóricoSigmaB-6768-5kg
CaCl2· 2H20,SigmaC3306-500G
Ácido cítricoSigmaC-0759
Convolve 3D plug-in de softwareOptiNav, Inc.n/a
Cámara CCD CoolSnap HQRopern/a
CubreobjetosVWR16004-302
CuSO4· 5H20,ENDCX-2185-1
Microscopio de fluorescencia de deconvolución DeltaVisionGE Healthcare/Applied Precisionn/a
Difracción PSF 3D plug-in de softwareOptiNav, Inc.n/a
Edimburgo medio mínimo (EMM) NotrogenSunrise2023; 1kg
de FeCl2· 6H2OENDFX9259-04
GlucosaSigmaG-7021
Placa calefactoraBarnsteadThermo Lyne
HistidineSigmaH8125-100g
Software de deconvolución HuygensSVIn/a
Software de deconvolución ImarisBitplanen/a
IncubadoraShell lab#3015
InositolSigmaI-5125
Iterativo Deconvolve 3D plug-inde software OptiNav, Inc.n/a
KClMallinckvadt6858-04
LanolinaSigmaL7387-1kg
LeucinaSigmaL8912-100g
LisinaSigmaL5626-500g
Extracto de malta (ME)MP4103-032
MgCl2· 6H20AMRESCO0288-500G
MetaMorphMolecular Devicesn/a
Portaobjetos de microscopioVWR16004-422
MnSO4,Mallinckvadt6192-02
Ácido molibdicoSigmaM-0878
Na2S04 Mallinckvadt8024-03
Ácido nicotínico,SigmaN-4126
Ácido pantoténicoSigmaP-5161
Cera de parafinaFishers80119WX
Pombe glutamato medio (PMG)Sunrise2060-250
softWorx v3.3 software de procesamiento de imágenesGE Healthcaren/a
Esporulación Medio en polvoSunrise1821-500
Centrífuga con control de temperaturaBeckmanAllwgra 6KR xentrifuge
UracilAMRESCO0847-500g
VaselinaEqualineF79658
Extracto de levaduraEMD1.03753.0500
Extracto de levadura más suplementos (YES)Sunrise2011-1kg
ZnSO4· 7H2OJ.T.Baker4382-04

Referencias

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