En Vesiculo Síntesis de Precursores de Membrana De péptido para crecimiento de la vesícula Autónoma

Resumen

Aquí se presentan protocolos para la creación de pequeñas vesículas unilamelares basadas en péptidos capaces de crecer. Para facilitar la producción vesiculo del péptido de membrana, estas vesículas están equipadas con un sistema de transcripción-traducción y el plásmido codificante de péptidos.

Resumen

La compartimentación de las reacciones bioquímicas es un aspecto central de las células sintéticas. Para este propósito, los compartimentos de reacción basados en péptidos sirven como una alternativa atractiva a los liposomas o vesículas a base de ácidos grasos. Externamente o dentro de las vesículas, los péptidos se pueden expresar fácilmente y simplificar la síntesis de precursores de membrana. Aquí se proporciona un protocolo para la creación de vesículas con diámetros de 200 nm basados en los polipéptidos anfifílicos similares a la elastina (ELP) utilizando la deshidratación-rehidratación de cuentas de vidrio. También se presentan los protocolos para la expresión y purificación de ELP bacteriana a través del ciclo de temperatura inversa, así como su funcionalización covalente con colorantes fluorescentes. Además, este informe describe un protocolo para permitir la transcripción del ARN aptamer dBroccoli dentro de las vesículas ELP como un ejemplo menos complejo para una reacción bioquímica. Por último, se proporciona un protocolo, que permite la expresión vesiculo de proteínas fluorescentes y el péptido de membrana, mientras que la síntesis de este último da lugar al crecimiento de la vesícula.

Introducción

La creación de sistemas celulares sintéticos vivos se aborda generalmente desde dos direcciones diferentes. En el método de arriba hacia abajo, el genoma de una bacteria se reduce a sus componentes esenciales, lo que en última instancia conduce a una célula mínima. En el enfoque ascendente, las células artificiales se ensamblan de novo a partir de componentes moleculares o subsistemas celulares, que necesitan integrarse funcionalmente en un sistema similar a una célula consistente.

En el enfoque de novo, la compartimentación de los componentes bioquímicos necesarios se logra generalmente utilizando membranas hechas de fosfolípidos o ácidos ....

Protocolo

1. Expresión de polipéptidos similares a la elastrina

1. Día 1: Preparación de un cultivo inicial y suministros para la expresión de péptidos
   1. Preparación y autoclave de matraces de cultivo de expresión (4 x 2,5 L) y 3 L de medio LB. Para 1 L de medio LB, añadir 25 g de polvo LB a 1 L de agua ultrapura.
   2. Preparar un cultivo de arranque con 100 ml de medio LB, 50 ml de solución de cloramphenicol filtrada estérilmente (filtro de 0,22 m) (25 mg/ml en EtOH) y 50 ml de solución de carbenicilina filtrada estérilmente (100 mg/ml en 50% De EtOH y 50% de agua ultrapura).
   3. Añadir una pequeña veta de un stock bacteriano prefab....

Resultados

Producción de vesículas
La Figura 1 muestra imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de vesículas preparadas con diferentes soluciones de hinchazón y el método de cuentas de vidrio (véase también Vogele et al.¹¹). Para la muestra de la Figura 1A,sólo PBS se utilizó como solución de hinchazón para probar la formación de vesículas y determinar su tamaño. Cuando TX-TL se utilizó como solución de hinchazón .......

Discusión

La rehidratación cinematográfica es un procedimiento común para la creación de pequeñas vesículas unilamellares. La principal fuente de fallo es el manejo incorrecto de los materiales utilizados en el procedimiento.

Inicialmente, los ELP son producidos por células de E. coli. El rendimiento después de la purificación de ELP puede variar significativamente dependiendo de la cuidadosa realización del protocolo durante s.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2xYT	MP biomedicals	3012-032
3-PGA	Sigma-Aldrich	P8877
5PRIME Tubo Phase Lock GelTM	VWR	733-2478
conjugado con alcinas Cy3	Sigma-Aldrich	777331
conjugadas con alcinas Cy5	Sigma-Aldrich	777358
ATP	Sigma-Aldrich	A8937
Benzamidina	Carl Roth	CN38.2
BL21 Rosetta 2 E. coli cepa	Novagen	71402
Bradford BSA Kit de ensayo de proteínas	Bio-rad	500-0201
cAMP	Sigma-Aldrich	A9501
Carbenicillina	Carl Roth	6344.2
Cloranfenicol	Sigma-Aldrich	C1919
Cloranfenicol	Carl Roth	3886.3
Cloroformo	Carl Roth	4432.1
CoA	Sigma-Aldrich	C4282
CTP	USB	14121
CuSO4	Carl Roth	P024.1
DFHBI	Lucerna Technologies	410
DMSO	Carl Roth	A994.1
DNasa I	NEB	M0303S
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
Etanol	Carl Roth	9065.2
Ácido folínico	Sigma-Aldrich	F7878
Perlas de vidrio, lavadas con ácido	Sigma-Aldrich	G1277
GTP	USB	16800
HEPES	Sigma-Aldrich	H6147
IPTG (β-isopropil tiogalactósido )	Sigma-Aldrich	I6758
KCl	Carl Roth	P017.1
K-glutamato	Sigma-Aldrich	G1149
LB Caldo	Carl Roth	X968.2
Lisozima	Sigma-Aldrich	L6876
Metanol	Carl Roth	82.2
MgCl2	Carl Roth	KK36.3
Mg-glutamato	Sigma-Aldrich	49605
Micro Bio-Spin Columnas de cromatografía	Bio-Rad	732-6204
NAD	Sigma-Aldrich	N6522
Enlazador de azida NHS (éster de oxisuccinimida de ácido y-azidobutírico)	Baseclick	BCL-033-5
PEG-8000	Carl Roth	263.2
Bandas de pH	Carl Roth	549.2
Fluoruro de fenilmetilsulfonilo	Carl Roth	6367.2
Solución salina tamponada con fosfato	VWR	76180-684
Ácido	fosfóricoSigma-Aldrich	W290017
Polietileneimina	Sigma-Aldrich	408727
Solución dibásica de fosfato de potasio	Sigma-Aldrich	P8584
Solución monobásica de fosfato de potasio	Sigma-Aldrich	P8709
Qiagen Miniprep Kit	Qiagen	27106
Tampón de reacción RNAPol	NEB	B9012
Inhibidor de la RNasa murino	NEB	M0314S
Toallitas RNaseZap	ThermoFisher	AM9788
rNTP	NEB	N0466S
Roti-fenol/cloroformo/alcohol isoamílico	Carlroth	A156.1
RTS Muestreador de aminoácidos	5 Prime	2401530
Slide-A-Lyzer Casetes de diálisis, 10k MWCO (kit)	Thermo-Scientific	66382
Cloruro de sodio	Carl Roth	9265.1
Hidróxido de sodio	Carl Roth	8655.1
Espermidina	Sigma-Aldrich	85558
Filtrado estéril (0.22 µ filtro m)	Carl Roth	XH76.1
T7 polimerasa	NEB	M0251S
TBTA (tris(benciltriazolilmetil)amina)	Sigma-Aldrich	678937
TCEP (clorhidrato de tris(2-carboxietil)-fosfina)	Sigma-Aldrich	C4706
Tris base	Fischer	BP1521
tRNA (de E. coli)	Roche Applied Ciencia	MRE600
UTP	USB	23160