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Tratamiento transitorio de células madre pluripotentes humanas con DMSO para promover la diferenciación

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DOI:

10.3791/59833

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17 de julio de 2019

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1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine, 2Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine

En este artículo

Resumen

La generación de tipos de células diferenciadas a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC) tiene una gran promesa terapéutica, pero sigue siendo un desafío. Los PSC a menudo exhiben una incapacidad inherente para diferenciar incluso cuando se estimulan con un conjunto adecuado de señales. Aquí se describe una herramienta sencilla para mejorar la diferenciación multilínea en una variedad de líneas PSC.

Resumen

A pesar del creciente uso de células madre pluripotentes (PSC), siguen existiendo desafíos para diferenciar eficientemente las células madre embrionarias e inducidas pluripotentes (ESC e iPSC) a través de varios linajes. Se han desarrollado numerosos protocolos de diferenciación, pero la variabilidad entre las líneas celulares y las bajas tasas de diferenciación transmiten desafíos en la implementación exitosa de estos protocolos. Aquí se describe un medio fácil y económico para mejorar la capacidad de diferenciación de los PSC. Se ha demostrado previamente que el tratamiento de células madre con una baja concentración de dimetilsulfóxido (DMSO) aumenta significativamente la propensión de una variedad de PSC a diferenciarse a diferentes tipos de células después de la diferenciación dirigida. Esta técnica ahora ha demostrado ser eficaz en diferentes especies (por ejemplo, ratón, primate y humano) en múltiples linajes, que van desde neuronas y esferoides corticales hasta células musculares lisas y hepatocitos. El pretratamiento DMSO mejora la diferenciación de la PSC mediante la regulación del ciclo celular y el cebado de las células madre para ser más sensible a las señales de diferenciación. Aquí se proporciona la metodología detallada para utilizar esta sencilla herramienta como un medio reproducible y ampliamente aplicable para diferenciar de manera más eficiente los PSC con cualquier linaje de elección.

Introducción

El uso de células madre pluripotentes ha dado lugar a numerosos avances en la investigación biomédica, incluidos los campos de la medicina regenerativa y las terapias basadas en células madre, el modelado de enfermedades y el cribado de fármacos. También ha llevado a la perspectiva general de una investigación más traducible y de medicina personalizada. El advenimiento de la tecnología inducida de células madre pluripotentes (iPSC) hace más de 20 años ha permitido a los investigadores desarrollar células madre pluripotentes a partir de tejidos somáticos y diferenciarlas en tipos de células funcionales para estudiar una variedad de patologías, cardiovasculares, neurológicas e inmunológicas. Aunque se han logrado avances significativos en la tecnología de diferenciación de células madre, todavía persisten los desafíos en la diferenciación efectiva de células madre embrionarias humanas (HESC) y los ISPs, lo que limita el uso generalizado de la tecnología de células madre en diferentes programas de investigación. La variabilidad inherente a través de diferentes líneas celulares y clones sigue planteando obstáculos para diferenciar las líneas de células madre a los linages deseados1. Además, la derivación de células funcionales maduras y diferenciadas terminalmente de los hPSC sigue siendo un proceso tedioso e ineficiente a través de muchos linajes. De hecho, las células diferenciadas de los hPSCa menudo no logran diferenciarse terminalmente en celdas funcionales 2. En el movimiento de terapias basadas en células madre para su uso en pacientes, existe la necesidad de mejorar y asegurar la eficacia de las células que se generan a partir de hPSCs.

Nuestro laboratorio ha establecido una herramienta rápida y económica para mejorar significativamente la eficiencia de diferenciar tanto los iPSC como los ESC en tipos de células maduras. Encontramos que el pretratamiento de hiPSC s y hESCs con el sulfóxido de dimetil reactivo comúnmente utilizado (DMSO) durante 24 h a 48 h antes de la diferenciación dirigida resulta en una mejora marcada en la capacidad de diferenciación de células madre. El tratamiento con DMSO aumenta la proporción de hiPSC y hESC en la fase G1 temprana del ciclo celular y activa la proteína retinoblastoma (Rb)3, un regulador crítico de la proliferación celular, supervivencia y diferenciación4. En trabajos más recientes, se ha encontrado que Rb y sus familiares son necesarios para los efectos pro-diferenciación de DMSO, de modo que la inactivación transitoria de Rb suprime los efectos de DMSO, mientras que la activación constitutiva de Rb de una manera transitoria mejora Efectos de DMSO5. Análogo al ciclo celular durante el desarrollo embrionario, el ciclo celular de esCs e iPSCs se caracteriza por una fase Abreviada G1 que promueve la auto-renovación6,7,8. Esta fase abreviada g1 permite una proliferación más irresa, pero limita el potencial de diferenciación4,9. Al promover el detención del crecimiento en G1 y activar los controles de punto de control en el ciclo celular de los HESC y los iPSC, el tratamiento DMSO prepara células para los cambios en el destino celular tras la diferenciación dirigida.

Hasta la fecha, se ha demostrado que el pretratamiento DMSO mejora la capacidad de diferenciación de lastres capas de gérmenes en más de 30 líneas de células HUMANAs de ESC e iPSC específicas para el control y la enfermedad 3,5, así como la diferenciación de células madre y otras líneas celulares a una variedad de otros tipos de células maduras en estudios posteriores10,11,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 (Cuadro 1). Además, se ha demostrado que el tratamiento con DMSO es eficaz para mejorar la diferenciación de las células primarias no humanas21,23 (por ejemplo, ratón, primate, conejo), lo que sugiere mecanismos compartidos entre especies. Por último, el pretratamiento DMSO también se ha extendido a la tecnología de edición de genes, con un estudio en particular que muestra que el pretratamiento de 24 horas DMSO de hESCs/iPSCs aumentó significativamente la capacidad de repeticiones palindrómicas cortas interespaciales agrupadas (CRISPR) /CRISPR-associated protein-9 (Cas9)-mediado eficiencia de edición del ADN no codificante sin incorporar mutaciones no intencionadas29. Aquí se proporciona una metodología detallada del pretratamiento DMSO de hESC s y iPSCs para aplicaciones en biología de células madre y diferenciación dirigida.

Protocolo

1. Mantenimiento de células madre

NOTA: El protocolo de mantenimiento celular descrito a continuación se aplica a las células madre pluipotentes (PSC) mantenidas en una monocapa adherente. Los medios, otros reactivos y placas de cultivo celular utilizadas antes del tratamiento con DMSO se pueden ajustar según sea necesario. Para todos los siguientes protocolos en este manuscrito, las celdas deben ser manejadas bajo un gabinete de seguridad biológica.

  1. Recubrir placas estériles, 6 pozos, tratadas con cultivo tisular con una matriz o sustrato pluripotente calificado para células madre preparados según las instrucciones del fabricante e incubar durante al menos 1 h en una incubadora de CO2 (5% CO2,atmósfera húmeda). Las placas recubiertas se pueden envolver en película y almacenar a 4 oC durante un máximo de una semana.
  2. Descongelar los PSC crioconservados en un baño de agua de 37 oC. Esterilice el vial con etanol antes de su introducción en el gabinete de seguridad biológica, luego transfiera inmediatamente las células pipeteando a un tubo cónico estéril que contiene 5-10 volúmenes de medios de células madre precalentados.
  3. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
  4. Aspirar el medio y resuspender suavemente el pellet celular en 1 ml de medios de células madre complementados con un inhibidor de 10 M ROCK, como Y-27632.
  5. Aspirar la matriz de cultivo de la placa y sembrar las células en la densidad deseada, típicamente 0.5-1 x 106 células por pozo en al menos 2 mL de medios de células madre por pozo.
    NOTA: La densidad de chapado puede variar entre diferentes líneas de celda y clones y debe optimizarse en consecuencia.
  6. Mantenga las células reemplazando con medios de células madre precalentados diariamente. Dividir las células en aproximadamente 70%-80% de confluencia o cuando las colonias celulares comienzan a hacer contacto.
  7. Para dividir las células, aspirar los medios y lavar las células una vez con PBS estéril. Incubar las células con 1 ml de una solución enzimática de disociación por pozo durante 5-10 minutos a 37 oC.
  8. Lavar y resuspender las células con medios de células madre precalentados y transferirlas a un tubo cónico estéril con 5-10 volúmenes de medios de células madre. Siga los pasos 1.3-1.7 para placar las celdas.

2. Pretratamiento DMSO

NOTA: Al enchapar las células para el pretratamiento DMSO antes de la diferenciación, la densidad de la célula de plafía inicial debe optimizarse teniendo en cuenta la tasa de crecimiento típica de la línea de células madre, así como el protocolo de diferenciación que se utiliza. Valide la pluripotencia utilizando marcadores convencionales, según sea necesario. Las células deben ser pasajes al menos 1x-2x después de la descongelación inicial antes de la diferenciación.

  1. Diferenciación de la cultura 2D
    1. Cuando las células alcancen una confluencia adecuada, prepare placas recubiertas, disocie las células y prepare una suspensión de una sola célula como se describió anteriormente.
    2. Cuente las células vivas usando un hemocitómetro o un contador de celdas automático, incluyendo el trypan azul u otro marcador de viabilidad.
    3. Placar las células en una placa de 6 pocillos recubiertos a 0.5-1 x 106 células por pozo en medios de células madre con el inhibidor ROCK de 10 M.
      NOTA: Para las líneas celulares probadas en nuestro laboratorio, estas densidades típicamente resultaron en 80%-90% células confluentes dentro del pretratamiento DMSO de 24 h.
    4. Dejar que las células se incuban durante 24 h a 37 oC en una incubadora de CO2 (5% CO2, atmósfera húmeda).
    5. Preparar 1%-2% DMSO en medios de células madre precalentados (p. ej., 100 ml de DMSO en 10 ml de medios de media, solución DMSO al 1%, o DMSO de 200 ml en 10 ml de medios de comunicación a 2% de solución DMSO).
    6. Después de 24 h de incubación, aspirar el medio de las células y reemplazarlo con solución DMSO.
    7. Dejar que las células se incuban durante 24 h a 48 h a 37 oC en una incubadora de CO2 (5% CO2,atmósfera húmeda) antes de la diferenciación.
      NOTA: Típicamente, un tratamiento de DMSO de 24 horas es suficiente en la mayoría de las líneas humanas de ESC e iPSC. Las líneas celulares con tasas de crecimiento muy lentas (tiempos de duplicación largos) pueden beneficiarse de la incubación de 48 h con DMSO. Para una incubación de 48 h con DMSO, los medios pueden ser reemplazados por medios de células madre frescas con 1%-2% DMSO después de las primeras 24 horas de tratamiento.
  2. Diferenciación de cultivo3D:
    1. Cuando las células alcanzan una confluencia apropiada, disocia y recoge las células en una suspensión celular como se describió anteriormente.
    2. Cuente las células vivas usando un hemocitómetro o un contador de células automático que incluya un marcador de viabilidad.
    3. Placa relinen las células en una placa de pozo sin recubrimiento de baja fijación 6 a 0,5-1 x 106 células por pocido en medios de células madre con inhibidor DE ROCK de 10 M.
      NOTA: Para las líneas celulares probadas en nuestro laboratorio, estas densidades típicamente resultaron en la formación de esfera sofocada 3D dentro de las 24 horas de las células de ajuste.
    4. Dejar que las células se incuban durante 24 h a 37 oC en una incubadora de CO2 (5% CO2, atmósfera húmeda).
    5. Preparar 1%-2% DMSO en medios de células madre precalentados (p. ej., 100 ml de DMSO en 10 ml de medios de media, solución DE DMSO al 1%, o 200 ml de DMSO en 10 ml de medios de comunicación a 2% de solución DMSO).
    6. Sustituya los medios siguiendo los procedimientos estándar (p. ej., incline la placa en un ángulo de 30o-45o para permitir que las esferas celulares se asienten en la parte inferior del pozo; transfiera las células a un tubo cónico estéril y permita que las esferas celulares se asienten en la parte inferior del tubo; n suspensión con una pipeta de 5 o 10 ml en un tubo cónico estéril y células centrífugas a 300 x g durante 5 min en RT).
    7. Aspirar el medio de las células y reemplazarlo con solución DMSO, pipeteando suavemente.
    8. Dejar que las células se incuban durante 24 h a 48 h a 37 oC en una incubadora de CO2 (5% CO2,atmósfera húmeda) antes de la diferenciación.
      NOTA: Típicamente, un tratamiento de DMSO de 24 horas es suficiente en la mayoría de las líneas humanas de ESC e iPSC. Las líneas celulares con tasas de crecimiento muy lentas (tiempos de duplicación largos) pueden beneficiarse de la incubación de 48 h con DMSO. Para una incubación de 48 h con DMSO, los medios pueden ser reemplazados por medios de células madre frescas con 1%-2% DMSO después de las primeras 24 horas de tratamiento.

3. Diferenciación a las capas germinales primarias

NOTA: A continuación se describen los métodos que se han demostrado anteriormente que son eficaces en nuestro laboratorio para PSC cultivados en monocapa en 6 placas de pozos. Cualquier protocolo de diferenciación de elección debe utilizarse después del tratamiento DMSO para promover la diferenciación en los linajes deseados. Retire la solución DMSO después de un tratamiento de 24-48 h y proceda con la diferenciación siguiendo los protocolos estándar.

  1. Diferenciación de endoderm (adaptado de Kroon et al.30)
    1. Células de pisión con DMSO como se describió anteriormente para cultivos 2D.
    2. Prepare las soluciones de stock de Wnt3a y Activin A.
    3. Preparar medios de diferenciación endodérmica del Día 1 añadiendo Wnt3a a una concentración final de 20 ng/ml y Activin A a una concentración final de 100 ng/ml al volumen apropiado de medios RPMI precalentados.
    4. Después del pretratamiento dmSO, aspirar los medios de las células y reemplazarlo con medios del Día 1 (por ejemplo, 2 ml por pozo de una placa de 6 pocillos).
    5. Dejar que las células se incuban durante 24 h a 37 oC en una incubadora de CO2 (5% CO2, atmósfera húmeda).
    6. Prepare los días 2 y 3 medios de diferenciación endodérmica añadiendo Activin A a una concentración final de 100 ng/ml al volumen apropiado de medios RPMI precalentados.
    7. Aspirar los medios de las células y reemplazarlo con medios del Día 2 (por ejemplo, 2 ml por pozo de una placa de 6 pocillos).
    8. Dejar que las células se incuban durante 24 h a 37 oC en una incubadora de CO2 (5% CO2, atmósfera húmeda).
    9. Aspirar los medios de las células y reemplazar con medios del Día 3 (por ejemplo, 2 ml por pozo de una placa de 6 pocillos).
  2. Diferenciación de Mesoderm (adaptado de Zhang et al.31)
    1. Pretratar las celdas con DMSO como se describió anteriormente para cultivos 2D.
    2. Prepare las soluciones de stock de Wnt3a y Activin A.
    3. Preparar medios de diferenciación mesodérmica añadiendo Wnt3a a una concentración final de 20 ng/ml y Activin A a una concentración final de 100 ng/ml al volumen apropiado de medios RPMI avanzados precalentados.
    4. Después del pretratamiento DMSO, aspirar los medios de las células y reemplazar con medios de diferenciación (por ejemplo, 2 ml por pozo de una placa de 6 pocillos).
    5. Dejar que las células se incuban durante 24 h a 37 oC en una incubadora de CO2 (5% CO2, atmósfera húmeda).
  3. Diferenciación de ectodermos (adaptado de Chambers et al.32)
    1. Pretratar las celdas con DMSO como se describió anteriormente para cultivos 2D.
    2. Prepare las soluciones de stock Noggin y SB431542.
    3. Preparar los medios base de diferenciación ectodérmica disolviendo el reemplazo sérico de nocaut (KOSR) a una concentración final del 10% en DMEM knockout.
      NOTA: Prepare suficientes medios base para 3-4 días de cambio de medios.
    4. Preparar los medios de diferenciación ectodérmica añadiendo Noggin a una concentración final de 500 ng/ml y SB431542 a una concentración final de 10 m al volumen adecuado de DMEM KOSR/knockout precalentado.
    5. Después del pretratamiento DMSO, aspirar los medios de las células y reemplazar con medios de diferenciación (por ejemplo, 2 ml por pozo de una placa de 6 pocillos).
    6. Dejar que las células se incuban durante 3-4 días a 37 oC en una incubadora de CO2 (5% CO2,atmósfera húmeda), reemplazando los medios diariamente por factores de diferenciación recién añadidos.

4. Diferenciación a los tipos de células progenitoras

A continuación se describen los métodos que se han demostrado anteriormente que son eficaces en nuestro laboratorio para PSC cultivados en cultivos 2D o 3D. Cualquier protocolo de diferenciación de elección debe utilizarse después del tratamiento DMSO para promover la diferenciación en los linajes deseados. Retire la solución DMSO después de un tratamiento de 24-48 h y proceda con la diferenciación siguiendo los protocolos estándar.

  1. Diferenciación de células progenitoras neuronales (adaptado de Tchieu et al.33)
    1. Preparar 6 placas de pozos mediante un recubrimiento con una matriz o sustrato de factor de crecimiento reducido altamente calificado como células madre pluripotentes, según las instrucciones del fabricante, durante al menos 1 h en una incubadora de CO2 (5% CO2,atmósfera húmeda). Las placas recubiertas se pueden envolver en película y almacenar a 4 oC durante un máximo de 1 semana.
    2. Placa PSC como se describió anteriormente en la densidad de 0.5-1 x 106 células por pozo en medios de células madre que contienen un inhibidor de ROCK.
    3. Células de pisión con DMSO como se describió anteriormente para cultivos 2D.
    4. Prepare pequeños inhibidores químicos LDN193189, SB431542 y soluciones de stock XAV939.
    5. Preparar días 1-3 medios de diferenciación de neuroectoderm complementando Essential 6 Media con 500 nM LDN193189, 10 M SB431542 y 2 M XAV939.
    6. Después del pretratamiento DMSO, aspirar los medios y reemplazar con días 1-3 medios de neuroectodermos (por ejemplo, 2 ml por pozo de una placa de 6 pocillos). Cambiar los medios a diario.
    7. Preparar días 4-12 medios de diferenciación de neuroectoderm complementando Essential 6 Media con 500 nM LDN193189 y 10 M SB431542.
    8. En el día 4 de diferenciación, aspirar los medios de comunicación y reemplazar con días 4-12 medios neurodectoderm. Cambie los medios todos los días.
    9. Después de 12 días de diferenciación, las células diferenciadas deben expresar marcadores apropiados de células progenitoras neuronales (NNP). Los PNJ se pueden mantener aún más en medios neuronales que contengan DMEM/F-12, 2% B-27, 1% N-2, y complementarse con factor de crecimiento de fibroblastobásico básico de 10 g/ml (bFGF). Pasaje de los PNJ cuando confluente usando una solución de desprendimiento de celdas, enchapando Los PNJ a 0.5-1 x 106 células por pozo.
  2. Diferenciación de células progenitoras de oligodendrocitos (adaptado de Douvaras y Fossati34)
    1. Placa los PSC como se describió anteriormente a una densidad de 1 x 105 por pozo en recubierto 6 placas de pozo en medios de células madre que contienen un inhibidor DE ROCK.
    2. Células de pisión con DMSO como se describió anteriormente para cultivos 2D.
    3. Prepare las soluciones de stock SB431542, LDN193189, ácido retinoico (RA) y agonista suavizado (SAG).
    4. Prepare los medios de diferenciación de los días 0-8 complementando DMEM/F-12 con 10 M SB431542, 250 nM LDN193189 y 100 nM RA.
    5. Después del pretratamiento DMSO, incubar células con medios de diferenciación durante 8 días, cambiando los medios diariamente con factores de diferenciación recién añadidos (por ejemplo, 2 ml por pozo de una placa de 6 pocillos).
    6. En el día 8, sustituya los medios por DMEM/F-12 que contengan 1 solución de aminoácidos no esenciales MEM (NEAA), 1X L-glutamina, 2-mercaptoetanol, penicilina/estreptomicina, y 1x N-2 suplementado 100 nM RA y 1 M SAG. Cambie los medios todos los días.
    7. Después de 12 días de diferenciación, las células diferenciadas deben expresar marcadores apropiados de células progenitoras de oligodendrocitos (OPO).
  3. Diferenciación de células progenitoras endocrinas (adaptado de Pagliuca et al.35)
    1. Secorren PSC a 6 x 105 células/ml en medios de células madre más inhibidor de 10 m ROCK en matraces spinner de 500 ml colocados en una placa de agitación de 9 posiciones establecida a una velocidad de rotación de 70 rpm en una incubadora de 37oC, 5% co2y 100% de humedad.
    2. Permita que los racimos se asienten en la parte inferior del matraz, aspire el medio y, a continuación, prerretíquese con un DMSO del 1%-2%.
    3. Prepare las soluciones de stock de Activin A, Chir99021, KGF, Sant1, ácido retinoico trans (RA), LDN193189, PdBU, XXI, Alk51, T3 y Betacelluin.
    4. Preparar medios base de diferenciación basados en la formulación en el Cuadro3.
    5. Después del pretratamiento DMSO, aspirar medios y reemplazar con medios S1 complementados con 100 ng/mL Activin A y 3 mM Chir99021 (por ejemplo, 500 mL por matraz). Dejar la incubación durante 24 h.
    6. En el día 2, reemplace los medios por medios S1 complementados con 100 ng/mL Activin A. Permitir la incubación durante 2 días.
    7. En el día 4, reemplace los medios por medios S2 complementados con KGF de 50 ng/ml. Permitir la incubación durante 3 días, cambiando los medios después de los primeros 2 días (Día 6).
    8. En el día 7, sustituya los medios por medios S3 complementados por 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1, 2 mM RA y 200 nM LDN193189. Dejar la incubación durante 24 h.
    9. En el día 8, sustituya los medios por medios S3 complementados por 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1, 2 mM RA, 200 nM LDN193189 y 500 nM PdBU. Dejar la incubación durante 24 h.
    10. En el día 9, sustituya los medios por medios S3 complementados por 50 ng/mL KGF, 0,25 mM Sant1 y 100 nM RA. Permitir la incubación durante 5 días, cambiando los medios cada 2 días (días 11 y 13).
    11. Los días 14 y 16, sustituya los medios por medios S5 complementados con 0,25 mM Sant1, 100 nM RA, 1 mM XXI, 10 mM Alk5i II, 1 mM T3 y 20 ng/ml de betacelulina (4 días de incubación total).
    12. Los días 18 y 20, sustituya los medios por medios S5 complementados con 25 nM RA, 1 mM XXI, 10 mM Alk5i II, 1 mM T3 y 20 ng/mL betacelulin.

5. Validación inmunocitoquímica de la diferenciación

NOTA: Los siguientes métodos describen un protocolo inmunocitoquímico general que se puede ajustar según sea necesario. Los anticuerpos primarios son aquellos que han sido validados previamente en nuestro laboratorio. También se pueden utilizar otras técnicas para la validación de la diferenciación (por ejemplo, citometría de flujo, qPCR, secuenciación de ARN, hincha occidental, ensayos funcionales, etc.).

  1. Células de inmunoetiquetado
    1. Para cultivos 3D en suspensión, racimos de células enteras de placas o racimos dispersos en suspensión de una sola célula en placas recubiertas durante 18-24 h antes de la fijación.
    2. Aspirar los medios de las células adherentes y lavar brevemente con PBS en RT en una coctelera.
    3. Para la fijación celular, aspirar PBS e incubar células con 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS durante 20 minutos en RT en la coctelera.
      PRECAUCION: Las existencias de PFA deben prepararse bajo una campana de humodebido a su toxicidad. No inhale ni use el equipo de protección personal adecuado.
    4. Retire el PFA y deseche en el contenedor de residuos químicos adecuado.
    5. Lave las células 3 veces con PBS durante al menos 5 minutos por lavado en RT en una coctelera.
    6. Para la permeabilización y el bloqueo celular, incubar células con suero de burro al 5% preparado en 0.3% triton-x 100/PBS durante 1 h en RT en una coctelera.
    7. Preparar la solución de anticuerpos primarios en la misma solución utilizada para la permeabilización/bloqueo.
    8. Incubar en solución primaria de anticuerpos durante la noche a 4 oC en la coctelera.
    9. Después de la incubación durante la noche, lave las células 3 veces con PBS durante al menos 5 minutos por lavado en RT en una coctelera.
    10. Preparar la solución secundaria de anticuerpos en la solución de permeabilización/bloqueo.
    11. Dejar incubar en solución secundaria de anticuerpos durante 1 h en RT en una coctelera.
    12. Aspirar la solución secundaria de anticuerpos y lavar las células 3 veces con PBS durante al menos 5 minutos por lavado en RT en una coctelera.
    13. Incubar celdas con DAPI u otro marcador preferido para el tiempo de incubación adecuado, y enjuagar en PBS.
  2. Cuantificación de imágenes
    1. Adquirir un mínimo de tres imágenes por condición en un microscopio fluorescente y/o con una plataforma de cribado de alto contenido.
    2. Cuantifique el porcentaje de células positivas para cada marcador contando el número total de células manchadas de anticuerpos y el número total de células (basados en la tinción de núcleos DAPI/Hoechst) utilizando un software de imagen imparcial (por ejemplo, ImageJ) o una plataforma de detección automatizada para Análisis.

Resultados

Morfología de los isPC tratados DMSO
Los iPSC humanos derivados de sujetos de control se cultivaban en una monocapa 2D adherente o en esferas celulares 3D en suspensión. Aproximadamente 24 h después del revestimiento inicial, las células fueron tratadas con 1% o 2% DMSO durante 24 h en el medio de mantenimiento. Las imágenes representativas de campo brillante después del tratamiento CON DMSO se muestran en la Figura1. De acuerdo con los informes anteriores de iPSC mantenidos en una monocapa3, el pretratamiento DMSO dio lugar a una disminución transitoria dependiente de la dosis en la tasa de crecimiento en comparación con las células tratadas no DMSO (Figura1A). Esta disminución de la proliferación se asocia con un aumento en el contacto de célula a célula, que es especialmente pronunciado en el 2% células tratadas DMSO que muestran una mayor formación de colonias celulares más altamente agrupadas. En otros tipos de células, se ha demostrado que el arresto G1 inducido por DMSO está asociado con una mayor expresión de proteínas implicadas en las interacciones células celulares que apoyan el detención de crecimiento inducido por inhibición de contacto36. En los iPSC mantenidos como esferas celulares 3D, el tratamiento DMSO aumentó de manera similar el número de esferas celulares (Figura1B). Además, el tratamiento DMSO también dio lugar a tamaños de esfera 3D menos variables, lo que se ha demostrado anteriormente que es indicativo de la capacidad de diferenciación mejorada de las células37. Es importante destacar que ni el 1% ni el 2% de LA DMS dieron lugar a toxicidad celular, medida por recuentos de viabilidad (n a 3; cultivo 2D % vivo - control: 80 a 1,3; 1% DMSO: 82 a 3,7, 2%: 81 a 2,7; cultivo 3D de vida a control: 81 a 4,3; 1 DMSO: 82 a 6,7, 2%: 82 a 2,7). En general, estos resultados son consistentes con la noción de que el tratamiento DMSO altera el ciclo celular y los patrones de crecimiento en las células madre cultivadas. Estos efectos sobre la inhibición del crecimiento son reversibles cuando el DMSO se elimina del medio, como se ha demostrado anteriormente3.

El tratamiento de DMSO mejora la diferenciación de las ESC con las capas germinales primarias
Los HESC HUES6 se sembraron en placas recubiertas durante 24 horas seguidas de un tratamiento con un 2% de DMSO durante 24 horas en el medio de mantenimiento. Las células se diferenciaron entonces en las tres capas germinales primarias siguiendo los paradigmas de tratamiento mostrados en la Figura 2A30,31,32. Las células diferenciadas se fijaron e inmunológicamente se teñiron para los marcadores prototípicos de cada capa germinal respectiva (SOX17 para endoderm, braquiury para mesodermo y SOX1 para ectodermo). Como se muestra en la Figura 2B,24 h de pretratamiento con 2% DMSO aumentó la proporción de células que expresan cada marcador de capa germinal respectivo. Esto es consistente con informes anteriores de nuestro laboratorio que muestran mayor inmunoreactividad, expresión génica, así como número absoluto de células diferenciadas hacia todas las capas germinales en células madre tratadas con DMSO3,5. HUES6 es una línea hESC con muy baja propensión a la diferenciación en todos los linajes1,sin embargo, el tratamiento DMSO mejora sustancialmente su capacidad para diferenciarse a través de todas las capas de gérmenes.

El tratamiento con DMSO mejora la diferenciación a los tipos de células progenitoras
Para investigar el efecto de DMSO en la diferenciación a los tipos de células progenitoras del SNC, los IPSC humanos se diferenciaron a células progenitoras neuronales (NPC) u células progenitoras de oligodendrocitos (OPC). Para generar NNP, las células fueron pretratadas con 2% DMSO durante 24 h en el medio de mantenimiento seguido de 12 días de diferenciación dirigida33 (Figura3A). Como se muestra en la Figura 3B,el pretratamiento de DMSO del 2% aumentó la expresión del marcador NPC PAX6 en comparación con el control. Utilizando otro protocolo validado previamente34 (Figura3C),los iPSC se diferenciaron durante 12 días en OPC. Al igual que los PNJ, los OPC derivados de los iPSC pretratados con un 2% de DMSO durante 24 h demostraron una proporción de células que expresaban los marcadores OPC 2 (Figura3D).

Un tratamiento inicial de DMSO persiste para mejorar la diferenciación en tipos de células maduras
Para investigar el efecto de DMSO en las últimas etapas de un protocolo de diferenciación, los hESC HUES8 fueron pretratados durante 24 h con un 2% de DMSO antes de la diferenciación a las células de 35. Se utilizaron HUES8, ya que se ha demostrado anteriormente que tienen una mayor propensión hacia el linaje endodérmico1,38. En la etapa de endodermo definido, las celdas diferenciadas expresan SOX17 y FOXA2, marcadores específicos de endoderm definitivos (DE). Con una mayor diferenciación en la etapade progenitores pancreáticos (PP 1), las células diferenciadas expresan PDX1 y FOXA2, marcadores característicos de las células progenitoras pancreáticas. En estas etapas de diferenciación de células pancreáticas, las eficiencias de inducción en DE y posteriormente al PP1 fueron elevadas tanto para los HESC tratados por DMSO como para los hESC tratados con DMSO diferenciados en cada una de estas etapas (Figura4B, etapas 1 y 3). A pesar de que se ha observado que la línea celular HUES8 ha aumentado la propensión a diferenciarse en el linaje endodérmico, ya que la diferenciación se induce aún más en los tipos de células más especializados en las etapas terminales, los HESC tratados por DMSO son mucho más probable que produzcan células endocrinas pancreáticas maduras. Las eficiencias de la generación de células progenitoras pancreáticas PDX1/NKX6.1+, Neurogenin 3+ células endocrinas y células NKX6.1/C-peptide+ SC-o fueron sustancialmente más altas en los HECC tratados con DMSO (Figura4B, etapas 4 y 5). Estos resultados están en línea con la diferenciación NPC y OPC que muestra que DMSO mejora el potencial de diferenciación a los tipos de células progenitoras y también demuestra que el efecto de DMSO es persistente en la generación de tipos de células más especializadas. Esto es consistente con el trabajo previo, donde hemos demostrado que el tratamiento inicial de DMSO de 24 h aumenta la diferenciación en tipos de células terminales a través de las capas germinales, incluyendo en células neuronales, así como la paliza de cardiomiocitos31,39 en líneas celulares con propensiónalta o pobre para la diferenciación 3.

El tratamiento inicial de DMSO mejora la función celular derivada del hESC después del trasplante in vivo
Anteriormente, hemos demostrado la eficacia del tratamiento con DMSO para mejorar la diferenciación de los hESC en célulasprogenitoras pancreáticas funcionales que más tarde muestran una notable mejora en la secreción de insulina in vivo 3. Utilizando protocolos publicados anteriormente3,30,40, HUES8 hESCs fueron tratados con 1% DMSO durante 24 h, diferenciados en células progenitoras pancreáticas, y trasplantados en ratones inmunodeficientes SCID-Beige para evaluar funcionalidad (por ejemplo, secreción de insulina en respuesta a un desafío de glucosa o estimulación de KCl) (Figura 5A). Mientras que las eficiencias de diferenciación en FOXA2+ (90%) y PDX1+ (75 %) los progenitores pancreáticos fueron comparables entre el control y los HESC tratados con DMSO (Figura5B)para la línea HUES8 hESC, las células diferenciadas de los HESC tras un tratamiento dmSO de 24 h 1% habían mejorado la capacidad de respuesta a la glucosa y kCl estimulación después del trasplante in vivo. Las mejoras en la funcionalidad fueron evidentes dentro de las 2 semanas posteriores al trasplante (Figura5C) y persistieron hasta al menos 16 semanas después del trasplante (Figura5D). En conjunto, estos resultados sugieren que el pretratamiento DMSO no sólo aumenta la eficiencia de diferenciación a las capas de gérmenes, células progenitoras y tipos de células más maduras, sino que también que persiste para mejorar la funcionalidad de las células diferenciadas in vivo.

Tipo de celda diferenciadaTipo de celda de inicio%DMSODuración del tratamiento DMSODuración del tratamiento DMSO
Células hepáticasEsc
Línea celular de Hepatoma
Esc
Esc
Células madre mesenquimales
iPSCs
Esc
Esc
Línea celular de Hepatoma
Esc		1.0
1.0
1.0
0.5
0.1-2.0
1.0
1.0
0.5
1.0
0,6		8 días
Varios días
7 días
10-14 días
7-21 días
7 días
4 días
5 días
2-21 días
de principio a fin		Basma et al., 2008
Kanebratt y Andersson, 2008
Hay et al., 2009
Duan et al., 2010
Alizadeh et al., 2014
Kondo et al., 2014
Szkolnicka et al., 2014
Czysz et al., 2015
Nikolaou et al., 2016
Vanhove et al., 2016
Capas de gérmenes primariosESCs e iPSCs
hESC
hESC		0.1-2.0
0.5
0.1-2.0		24 horas
24 horas
24 horas		Chetty et al., 2013
Chetty et al., 2015
Li et al., 2018
Células cardíacasESCs e iPSCs
Células P19
ESCs e iPSCs
Células madre mesenquimales fetales		0.1-2.0
1.0
1.0-2.0
0.8-1.0		24 horas
4 días
24-30 horas
24 horas		Chetty et al., 2013
Choi et al., 2014
van den Berg et al., 2016
Deng et al., 2017
Células pancreáticasESCs e iPSCs
hESC		0.1-2.0
0.5		24 horas
24 horas		Chetty et al., 2013
Chetty et al., 2015
Células musculares lisasCélulas P191.04 díasChoi et al., 2014
Células endotelialesCélulas P191.04 díasChoi et al., 2014
EnterocitosiPSCs0-1.64 díasOgaki et al., 2015
Epitelio intestinaliPSCs0-1.64 díasOgaki et al., 2015
Células neuronalesMarmoset iPSC0.05-2.024 horasQiu et al., 2015
NeutrófilosLínea celular de la leucemia1.256-8 díasTeimourian y Moghanloo, 2016
Miotubos esqueléticosiPSCs1.524 horasSwartz et al., 2016
Organoide corticalhiPSCs1.024 horasYoon et al., 2018

Tabla 1: Resumen del trabajo publicado anteriormente que demuestra los efectos beneficiosos del tratamiento DMSO en la diferenciación.

S1S2S3S5
MCDB131 (L)1111
Glucosa (g)0.440.440.443.6
NaHCO3 (g)2.461.231.231.754
FAF-BSA (g)20202020
ITS-X (mL)0.020.0255
Glutamax (ml)10101010
Vitamina C (mg)44444444
Heparina (mg)00010
P/S (ml)10101010

Tabla 2: Componentes de medios base de diferenciación celular progenitora endocrina.

figure-results-1
Figura 1 : El tratamiento DMSO altera el crecimiento de los hPSC. (A) Imágenes representativas de campo brillante de hiPSC chapados en una monocapa después de no recibir tratamiento (control) o tratamiento con 1% o 2% DMSO para 24 h. DMSO promueve una inhibición transitoria del crecimiento dependiente de la dosis de los ISC. (B) Imágenes representativas de campo brillante de hiPSC chapados en placas de baja fijación para permitir la formación de esferas 3D después de no recibir tratamiento (control) o tratamiento con 1% o 2% DMSO para el tratamiento de 24 h. DMSO da como resultado una formación de esfera 3D menos variable en comparación con el control. Barra de escala a 500 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2 : El tratamiento con DMSO mejora la diferenciación de los hPSC en las capas primarias de gérmenes. (A) Esquema de protocolos de diferenciación utilizados para generar las tres capas de gérmenes primarios. (B) Imágenes representativas de hESC SIS6 diferenciados inmunoetiquetados para SOX17 (endoderm), braquiury (mesoderm) y SOX1 (ectoderm). El pretratamiento con 2% de DMSO para 24 h aumentó la eficiencia de diferenciación en las tres capas germinales. Porcentajes de células diferenciadas en SOX17+ endodermal, Brachyury (Brachy)+ mesodermal o Células ectodérmicas SOX1+ tras la diferenciación dirigida en cada capa germinal de control y los HESC tratados con DMSO se observan con SEM de tres réplicas biológicas . Prueba t sin emparejar: endoderm p a 0.0003; mesoderm p a 0,047; ectoderm p a 0,015. Barra de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3 : El tratamiento con DMSO mejora la diferenciación a los tipos de células progenitoras neuronales. (A) Esquema del protocolo de diferenciación utilizado para generar células progenitoras neuronales (NPM). (B) Imágenes representativas de iPSC humanos diferenciadas en PNJ inmunoetiquetados para Pax6. 24 h de pretratamiento con 2% DMSO aumentó el número de células positivas PAX6. Los porcentajes de células que se diferencian en los PNJ de Pax6+ tras la diferenciación dirigida del control y los IPSC humanos tratados con DMSO se observan con SEM de tres réplicas biológicas. Prueba t sin emparejar: p a 0,0225. Barra de escala a 200 m. (C) Esquema del protocolo de diferenciación utilizado para generar células progenitoras de oligodendrocitos (OPO). (D) Imágenes representativas de iPSC humanos diferenciadas en OPC inmunoetiquetados para los marcadores OPC Olig2. 24 h de pretratamiento con 2% DMSO aumentó la expresión de ambos marcadores OPC en comparación con el control. Los porcentajes de células que se diferencian en Olig2+ OPCs después de la diferenciación dirigida del control y los IPSC humanos tratados con DMSO se observan con SEM de cuatro réplicas biológicas. Prueba t sin emparejar: p a 0,0466. Barra de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-4
Figura 4 : El tratamiento dmSO mejora el potencial de diferenciación terminal de los hPSC. (A) Esquema de una diferenciación dirigida de 20 días de los HESC HUES8 en células endocrinas pancreáticas diferenciadas terminalmente. (B) Inmunostanación para los marcadores indicados en cada etapa de diferenciación tras la diferenciación dirigida de células de control no tratadas y células pretratadas con 2% de DMSO durante 24 horas. El tratamiento inicial de DMSO persiste para aumentar la diferenciación en los tipos de células endocrinas terminales en las últimas etapas de diferenciación dirigida. Los porcentajes de células que se diferencian en los marcadores indicados en cada etapa de diferenciación tras la diferenciación dirigida del control y los hESC tratados con DMSO se observan con SEM de dos a cuatro réplicas biológicas. Barra de escala a 200 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-5
Figura 5 : El tratamiento inicial de DMSO de los hPSC mejora la capacidad de respuesta a la glucosa tras el trasplante de células progenitoras pancreáticas invivo. (A) Esquema de diferenciación dirigida (-15 días) de los HESC HUES8 en células progenitoras pancreáticas (PP2) sin tratamiento (control) o un tratamiento DMSO de 24 h 1% y posterior trasplante (5 millones de células) en inmunodeficiente Ratones SCID-Beige. (B) Porcentaje de células diferenciadas en células progenitoras pancreáticas PDX1+ y FOXA2+ tras la diferenciación in vitro dirigida del control y los HECC tratados con DMSO inmediatamente antes del trasplante (n.o 1). (C) Medidas ELISA medias de insulina humana del suero de ratones después de un desafío de glucosa bajo (2,5 mM) o alto (15 mM) o estimulación de cloruro de potasio (KCl) a (C) 2 semanas y (D) 16 semanas después del trasplante de pancreatic las células progenitoras se diferenciaron del control y los HESC tratados con DMSO (barras de error - SEM; n a 3 a las 2 semanas y 16 semanas para el control; n a 2 a las 2 semanas y 16 semanas para DMSO). ANOVA bidireccional: p a 0,0051 para el control frente a DMSO a las 2 semanas; p a 0,0116 para el control frente a DMSO a las 16 semanas. Los ratones estudiados en los diferentes puntos de tiempo son diferentes. Los resultados están adaptados de Chetty et al.3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

En resumen, este protocolo describe una herramienta simple y barata para mejorar la capacidad de diferenciación de las células madre pluripotentes (PSC) a todas las capas de gérmenes primarios, varios tipos de células progenitoras especializadas, e incluso tipos de células funcionales y maduras en y ajustes in vivo. Se ilustran protocolos de diferenciación específicos que se han reproducido eficazmente en nuestro laboratorio y en otros, pero cualquier protocolo de diferenciación de elección se puede utilizar después del tratamiento DMSO. Como se muestra en la Tabla 1, varios laboratorios también han demostrado una mejora de la diferenciación de PSC después del tratamiento de DMSO transitorio utilizando diferentes paradigmas para generar varios otros tipos de células terminales. Además, aunque los métodos aquí describen el uso de PSC humanas, el pretratamiento DMSO se puede utilizar en todas las especies y se ha demostrado que es eficaz en las PSC de ratón, conejo y primate.

Aunque se sabe que dosis más altas de DMSO son citotóxicas, las dosis bajas utilizadas en este método (1%-2%) durante un período transitorio resulta en una mínima muerte celular. Mientras que el número total de células inmediatamente después del tratamiento CONDMSO puede disminuir debido a la promoción de DMSO de la detención del ciclo celular en la fase G1 del ciclo celular, estudios previos muestran que las células son capaces de alcanzar el mismo nivel de confluencia que los cultivos de control después de la eliminación de DMSO3.

El porcentaje y la duración del pretratamiento DMSO deben optimizarse por línea celular. El tiempo de tratamiento debe ajustarse teniendo en cuenta el tiempo de ciclo/duplicación de las células. Por ejemplo, los PSC de ratón suelen tener tiempos de ciclismo mucho más cortos de aproximadamente 15 h; por lo tanto, el tratamiento DMSO para 15 h para estas células es suficiente. Algunos laboratorios también han encontrado que el tratamiento DMSO es beneficioso cuando se continúa durante el protocolo de diferenciación o a concentraciones más bajas (ver Tabla 1). Cabe señalar que algunas líneas de la PSC son más modificables para la diferenciación a linajes específicos. Por ejemplo, se ha demostrado que las células HUES6 son menos permisivas a la diferenciación y, por lo tanto, tuvieron una mejora marcada con el tratamiento dmSO (figura2). Alternativamente, las células HUES8 utilizadas en la Figura 4 y la Figura 5 han demostrado tener una mayor propensión hacia la diferenciación endodérmica; por lo tanto, se mostraron menos diferencias entre el control y la DMSO para la diferenciación en las etapas iniciales hacia el endodermo definitivo. No obstante, la mejora del pretratamiento DMSO se observa en etapas posteriores de diferenciación en esta línea celular (Figura4B). El tratamiento DMSO también es versátil en el sentido de que es eficaz en sistemas de cultivos celulares 2D y 3D, se puede utilizar con varios tipos de material de recubrimiento en placas de cultivo celular, y funciona en diferentes tipos de medios de mantenimiento que promueven el crecimiento y la expansión de (por ejemplo, mTeSR, E8, medios condicionados MEF, etc.).

En términos más generales, estos resultados sugieren que el estado inicial de las células madre pluripotentes tiene una fuerte influencia en la propensión a la diferenciación inicial, así como la diferenciación terminal en tipos de células funcionales. Hemos demostrado previamente que el tratamiento DMSO funciona a través de Rb en hPSCs3,5. Rb desempeña un papel importante en la promoción de la diferenciación terminal, la supervivencia celular y la estabilidad genética de las células41,42,43,44, y por lo tanto puede explicar los efectos persistentes sobre las células diferenciados de los hPSC tratados por DMSO. Dirigirse a estos primeros modos de regulación puede colocar los hPSC en una mejor trayectoria para la diferenciación y, en última instancia, mejorar su utilidad para la medicina regenerativa.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por becas de la Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford y una beca Siebel otorgada a S. C.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2-mercaptoetanolGibco21985023
6 pocillos Clear Flat Bottompocillos Placa
de 9 posiciones ChemglassCLS-4100
AccutaseGibco11105-01
Activin A R& D Systems338-AC
RPMI AvanzadoGibco12633012
Alk5i IIAxxoraALX-270-445
Ácido retinoico totalmente trans;Sigma-AldrichR2625
anti-BrachyuryR& D SystemsAF2085No se observó variabilidad en diferentes números de lote
anti-péptido CEstudios del desarrollo Banco de hibridomasGN-ID4No se observó variabilidad en diferentes números de lote
anti-FoxA2Millipore07-633No se observó variabilidad en diferentes números de lote
anti-Nkx2.2Universidad de Iowa, Banco de hibridomas del desarrollo74.5A5No se observó variabilidad en diferentes números de lote
anti-Nkx6.1Universidad de Iowa, Banco de Hibridomas del Desarrollo;  F55A12-sobrenadanteNo se observó variabilidad en diferentes números de lote
anti-Olig2EMD MilliporeMABN50No se observó variabilidad en diferentes números
de lote anti-Pax-6Biolegend901301No se observó variabilidad en diferentes números
de lote anti-Pdx1R& D SystemsAF2419No se observó variabilidad entre diferentes números de lote
anti-SOX1 R& D SystemsAF3369No se observó variabilidad en diferentes números de lote
anti-SOX17R& D SystemsAF1924No se observó variabilidad en diferentes números de lote
Suplemento B-27, menos vitamina AGibco12587010
Factor básico de crecimiento de fibroblastosGibcoPHG0264
BetacelulinaThermo Fisher Scientific 
Chir99021Vástago04-000-10
CMRL 1066Corning99-603-CV
Countess II FL Contador de celdas automatizadoThermo Fisher Scientific 
D-(+)-glucosaSigma G7528 
DAPIInvitrogen D1306
Matraces giratorios desechablesCorning, VWR89089-814
DMEM/F-12Gibco11320033
DMSO Sigma-AldrichD2650
Essential 6 MediosGibcoA1516501
FAF-BSAProliant 68700
FGF7PeproTech100-19
GeltrexGibcoA1413202
GlutaMAX Gibco35050061
Heparina Sigma H3149 
Insulina ultrasensible humana ELISAALPCO Diagnostics80-INSHUU-E01.1
ITS-XInvitrogen 
KGFPeprotechAF-100-19
Knockout DMEMGibco10829018
KnockOut Serum de repuestoGibco10828028
L-3,3′,5-Triyodotironina (T3)EMD Millipore642245
LDN193189Stemgent04-0074
Matrigel MatrixCorning354277
MCDB-131 Cellgro 15-100-CV 
MEM NEAAGibco 11140050
mTeSR 1StemCell Technologies5850
N2 SuplementoLife Technologies17502048
NaHCO3Sigma S3817 
Noggin Fc Chimera ProteínaR& D Systems3344-NG-050
PdBUEMD Millipore524390
Penicilina/Estreptomicina Tecnología de medios 30-002-CI
RPMIGibco11875-093
Sant1Sigma-AldrichS4572
SB431542Stemgent04-0010
Agonista Alisado, SAGEMD Millipore566660
StemPro AccutaseGibcoA1110501 
TrypLEGibco12604013
Microplacas de fijación ultra bajaCorning3471
Vitamina CSigma-AldrichA4544 
Wnt3aR& D Systems5036-WN
XAV 939Tocris3748
XXIEMD Millipore565790
Y-27632StemCell Technologies72302
TC tratado con múltiples de agitación de 353046 50932345AMQAF100051500056

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