Método Ex Vivo para evaluar la motilidad espontánea del tracto reproductivo de ratón y un algoritmo de seguimiento de movimiento del útero basado en MATLAB para el análisis de datos

Resumen

Las contracciones uterinas son importantes para el bienestar de las hembras. Sin embargo, el aumento patológicamente de la contractilidad puede resultar en dismenorrea, especialmente en las hembras más jóvenes. Aquí, describimos una preparación ex vivo simple que permite una evaluación rápida de la eficacia de los relajantes musculares lisos que se pueden utilizar para el tratamiento de la dismenorrea.

Resumen

La dismenorrea, o calambres dolorosos, es el síntoma más común asociado con la menstruación en las mujeres y su gravedad puede obstaculizar la vida cotidiana de las mujeres. Aquí, presentamos un método fácil y barato que sería instrumental para probar nuevos fármacos disminuyendo la contractilidad uterina. Este método utiliza la capacidad única de todo el tracto reproductivo del ratón para exhibir motilidad espontánea cuando se mantiene ex vivo en una placa Petri que contiene tampón Krebs oxigenado. Esta motilidad espontánea se asemeja a la actividad miometrial similar a una onda del útero humano, conocida como ondas endometriales. Para demostrar la eficacia del método, empleamos un conocido medicamento relajante uterino, la epinefrina. Demostramos que la motilidad espontánea de todo el tracto reproductivo del ratón puede ser inhibida de forma rápida y reversible por 1 m de epinefrina en este modelo de plato Petri. Documentar los cambios de la motilidad uterina se puede hacer fácilmente usando un teléfono inteligente ordinario o una sofisticada cámara digital. Desarrollamos un algoritmo basado en MATLAB que permite el seguimiento del movimiento para cuantificar los cambios espontáneos de motilidad uterina midiendo la velocidad de los movimientos del cuerno uterino. Una ventaja importante de este enfoque ex vivo es que el tracto reproductivo permanece intacto durante todo el experimento, preservando todas las interacciones celulares intrauterinas intrínsecas. La principal limitación de este enfoque es que hasta el 10-20% de los úteros puede no presentar motilidad espontánea. Hasta ahora, este es el primer método cuantitativo ex vivo para evaluar la motilidad uterina espontánea en un modelo de plato Petri.

Introducción

Como un órgano femenino importante, el útero es crucial para la reproducción y esencial para la nutrición del feto¹. El útero consta de tres capas: perimetrio, miometrio y endometrio. El miometrio es la principal capa contráctea del útero y desempeña un papel clave en el parto del feto. El endometrio es la capa más interna que recubre la cavidad uterina y es esencial para la implantación de embriones. En las mujeres no embarazadas en edad reproductiva, la capa endometrial se desprende mensualmente al comienzo del ciclo menstrual. El miometrio ayuda en este proceso de desprendimiento manteniendo las contracciones miometriales espontáneas necesarias para eliminar el tejido endometrial necrótico del útero¹.

Desafortunadamente, aumento de la contractilidad miometrial puede resultar en efectos secundarios negativos como dismenorrea, o calambres menstruales dolorosos. Esto se ve especialmente en las mujeres jóvenes y las mujeres nulosa2². Sin embargo, la dismenorrea es diferente para cada mujer y depende de la fuerza de sus contracciones miometriales; contracciones más fuertes se asocian a menudo con la sensación de calambres graves³. La contractilidad miometrial se puede visualizar mediante ultrasonido uterino y a menudo se reconoce como ondas endometriales. Se cree que la liberación mejorada de prostaglandinas durante la menstruación⁴ en un útero sometido a desprendimiento de endometrio contribuye a aumentar la hipercontractilidad miometrial, lo que resulta en isquemia e hipoxia del músculo uterino y, por lo tanto, aumenta dolor³.

La dismenorrea grave puede obstaculizar la actividad diaria de algunas mujeres y entre el 3 y el 33% de las mujeres tienen dolormuy intenso, lo que podría causar que una mujer esté en cama durante 1 a 3 días cada ciclo menstrual 5. La dismenorrea es la principal causa de morbilidad ginecológica en mujeres en edad reproductiva independientemente de su edad, nacionalidad y situación económica⁵. La prevalencia estimada de dismenorrea es alta y variable, oscilando entre el 45% y el 93% en mujeres en edad reproductiva^5.  El dolor asociado a la dismenorrea tiene un efecto en la vida diaria de las mujeres y puede resultar en un bajo rendimiento académico en adolescentes, menor calidad del sueño, restricción de las actividades diarias, y cambios de humor⁵.

Muchas mujeres que experimentan dismenorrea grave recurren a medicamentos de venta libre para aliviar su dolor. Estos medicamentos de venta libre contienen inhibidores de la ciclooxigenasa (COX) que previenen la formación de prostaglandinas⁶. Sin embargo, los inhibidores de la COX están asociados con eventos cardiovasculares adversos, y alrededor del 18% de las mujeres con dismenorrea no responden a estos inhibidores⁷. Por lo tanto, hay una necesidad de nuevos medicamentos para reducir los calambres menstruales. Dado que la contraetimididad del útero contribuye a la patogénesis de la dismenorrea, una posible estrategia puede ser el uso de relajantes uterinos.

Es beneficioso cuantificar los efectos de los medicamentos relajantes potenciales en un modelo de contracciones espontáneas de ondas miometriales de origen natural. Sin embargo, hasta ahora, no se ha descrito ningún método ex vivo eficiente para probar fármacos relajantes musculares en el útero intacto. Actualmente, las mediciones de tensión isométrica se utilizan para evaluar los efectos del fármaco relajante. Durante estas mediciones, una tira muscular uterina se mantiene a una longitud constante bajo precarga en un baño de tejido, mientras que la fuerza de las contracciones del músculo uterino se registra antes y después de la estimulación de la oxitocina en presencia o ausencia de un medicamento relajante. Aunque este enfoque es muy útil, requiere equipos costosos. Además, las contracciones isométricas no se asemejan a las contracciones espontáneas similares a las ondas miometriales que se producen naturalmente en el útero intacto. De manera única, las ondas miometriales uterinas en roedores se pueden visualizar como motilidad del cuerno uterino cuando todo el tracto reproductivo (ovarios, oviductos, útero y vagina) se mantiene en una solución tampón. Aquí, presentamos un método ex vivo para monitorear la motilidad espontánea del útero intacto del ratón colocado en una placa Petri que contiene tampón Krebs oxigenado. También describimos un algoritmo de cuantificación de motilidad utilizando el rastreador de movimiento MATLAB. Este enfoque novedoso proporciona una alternativa fácil y menos costosa para probar el potencial relajante de remedios naturales y compuestos sintéticos.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Medicina de la Universidad de Indiana (Indianapolis, IN). En el estudio se utilizaron ratones hembra sexualmente maduros F2-129S-C57BL/6 de 2-5 meses de edad.

PRECAUCION: Garantice la seguridad usando una capa de laboratorio, una máscara y guantes cuando trabaje con animales y materiales biopeligrosos.

1. Preparación de la solución

1. Preparar el tampón Krebs, que contiene: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1,2 mM NaH₂PO₄, 0,56 mM MgCl₂, 25 mM NaHCO₃y 5 mM de glucosa, pH 7,4. Oxigenar continuamente el tampón Krebs con una mezcla de gases comprimidos que contienen 5% de CO₂ y 95% De₂ mientras mantiene la temperatura de tampón a 37 oC utilizando un baño de agua circulante.
2. Preparar la salina tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS), quecontiene: 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH₂PO_4,136,89 mM NaCl y 8,1 mM Na₂HPO_4,pH 7,4.

2. Preparación animal

1. Anestetizar ratones con inhalación de isoflurano (3%) con barrido de gas residual. Asegurar una anestesia adecuada mediante la evaluación de los reflejos de abstinencia. Pellizcar el dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo trasero para afirmar que no se provocan movimientos, lo que indica la pérdida de respuestas reflejo. Después de que se logra la anestesia profunda, eutanasia al animal por decapitación.
   NOTA: El isoflurano puede causar dilatación muscular suave. Por lo tanto, la preparación del tracto reproductivo debe lavarse e incubarse ampliamente en el tampón Krebs durante al menos 15-30 minutos antes de comenzar los experimentos ex vivo. El isoflurano puede causar irritación y malestar cuando está en contacto con la piel, así que proceda con precaución.
2. Coloque el cuerpo en un bote de pesaje grande forrado con una toalla de papel.
   NOTA: El personal de laboratorio femenino embarazada no debe participar en experimentos con isoflurano porque puede disminuir el peso fetal, disminuir la osificación esquelética fetal y aumentar el riesgo de aborto espontáneo^8,9. La inhalación de CO2 se puede utilizar como sustituto de los ratones de eutanasia.

3. Determinación de la etapa de ciclo de Estrous

1. Con pequeños fórceps, levante el clítoris para acceder al ostium vaginal e inserte lentamente una punta de micropipeta que contenga 10 ml de DPBS en la vagina.
   1. Asegúrese de que la punta del micropipeta se inserta a través del ostium en un ángulo de 10 - 30o para evitar puntuar la pared vaginal. El líquido todavía debe ser visible en la punta después de la inserción. Si el líquido no es visible, la punta se insertó demasiado lejos en la vagina, y el área paracervical de la vagina podría haber sido perforada.
   2. Tire ligeramente hacia abajo en los músculos vaginales del ostium con la punta de la micropipette para permitir que el aire salga de la vagina.
2. Enjuague lentamente la cavidad vaginal pipeteando hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces con 10 s de DPBS y coloque la suspensión de la célula dibujada en un portaobjetos de vidrio.
3. Utilice un microscopio de contraste de fase invertido para determinar la etapa del ciclo estroso a través del análisis citológico. El procedimiento se realiza como se describe en otros lugares^10,11. Asegúrese de que la suspensión celular no se seque antes de que se pueda realizar el análisis citológico. La suspensión puede diluirse con DPBS fresco, si es necesario.

4. Desdisección del tracto reproductivo del ratón

1. Organizar el ratón en una posición supina y extender sus extremidades para exponer la región abdominopelvic.
2. Rocíe con 70% de etanol para humedecer y desinfectar la zona abdominopelvic.
3. Con fórceps, levante cuidadosamente la piel que se encuentra superior al clítoris. Hacer pequeñas incisiones transversales en los aspectos laterales de la zona abdominal inferior, hasta las extremidades superiores para exponer el peritoneo (Figura1A). Durante este proceso, se formará una solapa externa. A medida que las pequeñas incisiones se hacen continuamente, la solapa aumentará de tamaño.
4. Cortar cuidadosamente a través del peritoneo para exponer el tracto gastrointestinal (Figura 1B). Es importante tener en cuenta que los cuernos uterinos a menudo se pueden ubicar directamente debajo del peritoneo, así que haga incisiones con precaución y no toque los cuernos, ya que esto puede afectar la motilidad uterina.
5. Usando fórceps, retire la fascia y el tejido adiposo que cubre el tracto gastrointestinal. Eliminar los siguientes segmentos del tracto gastrointestinal de la cavidad abdominal: el duodeno, el yeyuno, el íleon, el cecum, el colon ascendente y transversal (Figura1C).
6. Para localizar los órganos reproductivos, primero identifique la vejiga urinaria (Figura1C, "4"), que puede tener una apariencia desinflada debido al vaciado después de la eutanasia. La vagina estará justo debajo de la vejiga urinaria.
7. Localice la sínfisis púbica en la confluencia de los huesos púbicos (caudalmente a la vejiga).
8. Usando tijeras, retire la sínfisis púbica haciendo cuidadosamente incisiones en sus lados laterales a través del tejido fibrocartilaginoso interpúbico para obtener acceso y proporcionar una ruta para la extracción de la vagina (Figura 1D).
9. Corte a través del perineo situado entre el ano y la parte inferior de la vulva.
10. Con fórceps, levante la vagina e exchorele lentamente el recto.
11. Identificar dos cuernos uterinos que se bifurcan en un tenedor, rostrally a la vagina. Localice un oviducto y ovario enrevesado al final de cada cuerno, que puede estar oculto bajo los segmentos restantes del tracto gastrointestinal. Use tijeras disecantes pequeñas para eliminar los ligamentos que se conecten y apoyen los cuernos, oviductos y ovarios dentro de la cavidad abdominal.
12. Retire el tracto reproductivo, que incluye la vagina, el útero, los oviductos y los ovarios, de la cavidad abdominal.
13. Transfiera el tracto reproductivo aislado (Figura1E)a una placa Petri de 100 mm llena de 10 ml de DPBS. No comprima los cuernos uterinos para evitar dañar el miometrio.
14. Utilice fórceps y tijeras quirúrgicas para eliminar cualquier tejido conectivo y adiposo que rodea los cuernos uterinos y la vagina, así como cualquier pelaje en la región púbica que pueda dificultar la calidad de la imagen. Retire el ligamento ancho para permitir la motilidad de los cuernos uterinos.
15. Lavar el tracto reproductivo aislado con DPBS fresco dos veces y transferirlo a una placa Petri de 35 mm llena de 3 ml de solución de Krebs oxigenado.

5. Imágenes de tejidos

1. Coloque la placa Petri que contiene el tracto reproductivo en un tampón Krebs oxigenado sobre una superficie negra. Mantenga el plato a temperatura ambiente.
   NOTA: Es posible utilizar una almohadilla de calentamiento por infrarrojos para mantener el tejido a 37 oC.
2. Permita que comiencen 15-30 min para que comiencen las contracciones espontáneas. Registre la motilidad uterina espontánea durante 10 minutos desde un plano axial utilizando cualquier tipo de equipo de vídeo digital.
3. Transfiera la preparación a una placa Petri que contenga el tampón Krebs oxigenado complementado con un compuesto de prueba. Registre la motilidad uterina espontánea durante unos 10 minutos desde un plano axial utilizando cualquier tipo de equipo de vídeo digital.
4. Lavar todo el tracto reproductivo en una placa Petri de 100 mm con 10 ml de DPBS para evaluar la reversibilidad del tratamiento.
5. Transfiera la preparación a un plato de Petri con el tampón Krebs recién oxigenado. Registre la motilidad uterina espontánea durante unos 10 minutos desde un plano axial utilizando cualquier tipo de equipo de vídeo digital.
6. Transfiera la preparación a otra placa Petri de 35 mm llena de tampones Krebs oxigenados complementado con el vehículo para el compuesto de prueba para asegurarse de que no haya cambios inducidos mecánicamente en la motilidad uterina espontánea. Este es un control importante.
7. Transfiera el material de archivo de vídeo a un disco duro de ordenador.

6. Análisis de datos

1. Haga clips utilizando cualquier software de edición de vídeo a partir del material de archivo de vídeo original que contenga los episodios de control, tratamiento y lavado.
2. Utilice el software MATLAB y el script proporcionado (consulte el material suplementario en línea) para cuantificar la motilidad uterina espontánea.
   NOTA: El complemento Computer Vision Toolbox para MATLAB debe estar instalado para que el script sea completamente funcional.
   1. Abra el script de MATLAB, vaya a la pestaña Editor y haga clic en Ejecutar.
   2. Seleccione el primer archivo de vídeo y haga clic en Abrir.
   3. Introduzca una etiqueta para el archivo de vídeo en el cuadro de diálogo emergente y haga clic en Aceptar.
   4. Introduzca el intervalo de tiempo (s) necesario para calcular la velocidad del movimiento de la bocina (distancia euclidiana / s).
   5. Utilice el cursor del ratón para seleccionar dos puntos en el primer fotograma del vídeo. Una ventana emergente le pedirá que confirme que los puntos seleccionados deben utilizarse para el seguimiento. Haga clic en Iniciar para iniciar el proceso de seguimiento en tiempo real que se mostrará en la ventana emergente. También puede hacer clic en Volver a seleccionar puntos para volver a seleccionar los dos puntos.
   6. Supervise la precisión del proceso de seguimiento en la ventana emergente.
   7. Observe una gráfica de dispersión de velocidad frente a dispersión de tiempo y gráfico de dispersión de distancia frente a dispersión de tiempo en una nueva ventana emergente. Guarde las dos figuras seleccionando Archivo ( File) Guardar como en la misma ventana para documentar los datos.
   8. Busque una carpeta denominada PointTrackerData, creada automáticamente por MATLAB, en el mismo directorio donde se encuentra el script de MATLAB. Identifique un archivo de Excel denominado label_Data que contenga puntos de datos recopilados del vídeo en dos pestañas de hoja de cálculo independientes.
      NOTA: Cualquier software de seguimiento de movimiento alternativo se puede utilizar para cuantificar la motilidad espontánea del útero.
3. Utilice un software adecuado (por ejemplo, Excel o SigmaPlot 13) para realizar el análisis estadístico.

Resultados

La Figura 1 muestra imágenes representativas tomadas durante todo el procedimiento de aislamiento del tracto reproductivo que se describe en este protocolo. Para evitar contaminar el tampón con piel, lo que disminuiría la calidad del vídeo, humedecimos el cuerpo del ratón con 70% de etanol. El punto de referencia principal para la sección de disección del protocolo es encontrar la vejiga urinaria. El útero y la vagina se ubicarán de forma inferior a la vejiga urinaria.

Discusión

Aquí, describimos un método para evaluar la contractilidad espontánea de todo el tracto reproductivo de los roedores, que incluye los ovarios, oviductos, cuernos uterinos y la vagina. Utilizamos un método similar para demostrar el efecto relajante de la fenilefrina en la motilidad uterina espontánea¹³, sin embargo, en el pasado no pudimos proporcionar análisis cuantitativos de los datos. En este trabajo, desarrollamos un algoritmo para el análisis cuantitativo de datos de motilidad utilizando el m...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Clorhidrato de epinefrina	Sigma-Aldrich	E4642
PBS	Fisher Sceintific de Dulbecco	17-512Q
Etanol 200 PRUEBA Laboratorios de	descontaminación	2701
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Glucosa	Sigma-Aldrich	G7528
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
CaCl2 · 2H2O	Sigma-Aldrich	C5080
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
MgCl2  · 6H2O	Sigma-Aldrich	M9272
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6297
Isoflurano, USP	Patterson Veterinary	07-893-2374
Disección pinza de astilla de precisión de punta extrafina	fisher sceintific	13-812-42
tijeras de iris finas endurecidas curvadas	Fine Science Tools	14091-09
disección microscopio estereoscópico modular de alto rendimiento	Leica	MZ6
Cámara microscópica digital en color de 5 megapíxeles con sistema de enfriamiento activo	Leica	DFC425 C
Microscopio Stereomaster Fuentes de luz de fibra óptica	Fisher Sceintific	12-562-21
Barco de pesaje	Fisher Sceintific
Convertidores Astound Bata quirúrgica estándar	Salud Cardinal	9515	Guantes pequeños, medianos o grandes
	McKesson Corporation	20-1080	pequeños, medianos o grandes; guantes quirúrgicos estériles de látex o nitrilo sin polvo
Placa	de Petri Corning Falcon	351029	100 mm
Placa de Petri	Corning Falcon	353001	35 mm
95% O2- 5% CO2 mezcla de gases	Praxair	MM OXCD5-K
Mascarillas de gancho para la oreja	Valumax International	5430E-PP
DSLR 24.2 MP Cámara	Canon	EOS Rebel T6i
MATLAB	MathWorks	N/A	versión 2019 o posterior