Aquí se presenta un protocolo para realizar el desomo genético con tiempo y espacio restringido en las médulas espinales de axolotl inyectando el complejo CAS9-gRNA en el canal central de la médula espinal seguido de electroporación.
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Artículo de método
Desmontaje genético directo de las células madre neurales de la médula espinal de Axolotl a través de la electroporación de los complejos de proteína-gRNA CAS9
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Resumen
Resumen
El axolotl tiene la capacidad única de regenerar completamente su médula espinal. Esto se debe en gran parte a las células ependimales que permanecen como células madre neurales (NSC) a lo largo de la vida, que proliferan para reformar el tubo ependimal y diferenciarse en neuronas perdidas después de una lesión de la médula espinal. Descifrar cómo estos NSC retienen la pluripotencia después del desarrollo y proliferan sobre la lesión de la médula espinal para reformar la estructura exacta antes de la lesión puede proporcionar información valiosa sobre cómo las médulas espinales de los mamíferos pueden regenerarse, así como posibles opciones de tratamiento. La realización de de knock-outs genéticos en subconjuntos específicos de NSC dentro de un período de tiempo restringido permitirá el estudio de los mecanismos moleculares detrás de estos procesos regenerativos, sin ser confundido por efectos perturbadores de desarrollo. Aquí se describe un método para realizar el knock-out genético en los NSC de la médula espinal axolotl utilizando el sistema CRISPR-Cas9. Al inyectar el complejo CAS9-gRNA en el canal central de la médula espinal seguido de electroporación, los genes diana se eliminan en los NSC dentro de regiones específicas de la médula espinal en el momento deseado, lo que permite estudios moleculares de los SEN de la médula espinal durante Regeneración.
Introducción
La médula espinal de la mayoría de los vertebrados es incapaz de regenerarse después de una lesión, lo que conduce a una discapacidad permanente. Varias salamandras, como el axolotl, son notables excepciones. El axolotl puede regenerar completamente una médula espinal estructuralmente idéntica y restaurar completamente la función de la médula espinal. Gran parte de la capacidad regenerativa de la médula espinal axololol se debe a las células ependímicas. Estas células recubren el canal central, y a diferencia de las de los mamíferos, las células axolomales ependílicos permanecen como células madre neurales (NSC) de desarrollo postembrionario. Después de una lesión de ....
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Protocolo
Todos los experimentos con animales deben llevarse a cabo de conformidad con las reglamentaciones locales y nacionales sobre experimentación con animales y con la aprobación de la junta de revisión institucional pertinente.
1. Preparación de la mezcla CAS9-gRNA RNP
- Diseñar y sintetizar gRNAs.
NOTA: Consulte otras publicaciones para diseñar y sintetizar ARNm, incluida una exclusivamente relativa a axolotls15,20,21,22. - Obtenga la proteína CAS9-NLS preparándola internamente o comprándola comerc....
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Resultados
La inyección y electroporación del complejo CAS9-gRNA contra Sox2 en el canal central de la médula espinal axolol condujo a una pérdida masiva de inmunoreactividad SOX2 en la mayoría de los NSC de la médula espinal, con EL RNA contra la tirosinasa (Tyr) como control (Figura 2 A). B3-tubulina (manchado con TUJ1) es un marcador para las neuronas y no se expresó en NSCs, y las células SOX2- TUJ1- que rodeaban el canal central se consideraron células que albergaban elim.......
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Discusión
El protocolo descrito permite el desoparamiento de genes restringidos en el tiempo y el espacio en los SCN en la médula espinal del axolotl. El protocolo actual permite la segmentación específica de los SCN en un momento y una ubicación definidos con alta penetrancia. Evita posibles efectos no deseados que se originan en el knock-out de genes en los SCN en otras regiones como el cerebro que se producen cuando se utiliza el sistema Cre-LoxP. También evita los efectos del desarrollo que se originan en un knock-out persiste.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran conflictos de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a la Profesora Elly M. Tanaka por su apoyo continuo y a largo plazo. Este trabajo fue apoyado por una Beca de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC) (317716), Becas de Inicio de Investigación de la Universidad Normal del Sur de China (S82111 y 8S0109), y una Beca de la Fundación de Ciencia postdoctoral de China (2018M633067).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agarosa | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Benzocaína | Sigma-Aldrich | E1501-100G | |
| Benzocaína 0.03 % (wt/vol) | Mezclar 500 ml de 10&veces; TBS, 500 ml de Holtfreter' al 400% (peso/vol) S y 30 ml de solución madre de benzocaína al 10% (peso/vol). Llene el volumen a 10 L con dH2O. La solución se puede almacenar a temperatura ambiente hasta por 6 meses. | ||
| Benzocaína 10 % (peso/vol) | Mezclar 50 g de benzocaína en 500 ml de etanol al 100 % (vol/vol). La solución se puede almacenar a temperatura ambiente hasta por 12 meses. | ||
| Capilares de vidrio de borosilicato de 1,2 mm de diámetro exterior, 0,94 mm de diámetro interno | Instrumento de tartamudez | BF120-94-8 | |
| CaCl2· 2H2O | tampón Merck | ||
| CAS9, 10x | Mix 200 mM HEPES y 1,5 M KCl en agua libre de RNasa. Ajusta el pH a 7,5. Filtrar esterilizar, alícuota y almacenar en &menos; 20 ° C hasta por 24 meses | ||
| proteína CAS9-NLS | PNA Bio | CP03 | |
| Placas de cultivo celular, 10cm | Falcon | 351029 | |
| Dumont #5 - Pinzas finas | Fine Scientific Instruments | 11254-20 | |
| Electroporador | Nepa Gene | NEPA21 | |
| BEX Generador de Pulsos CUY21EDIT II | |||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fast Green FCF Solución, 5x | Disuelva 12.5 mg de polvo Fast Green FCF en 10 mL de 1&veces; Pbs. | ||
| Extractor de micropipetas aplanadas/marrones | Instrumento de tartamudez | P-97 | |
| Holtfreter' S solución 400% (peso/vol) | Disolver 11.125 g de MgSO4· 7H2O, 5,36 g de CaCl2· 2H2O, 158,4 g de NaCl y 2,875 g de KCl en 10 L de dH2O. La solución se puede almacenar a temperatura ambiente hasta por 6 meses. | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| MgSO4· 7H2O | Merck | 105886 | |
| Microcargador Puntas de pipeta | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulador | Narishige | MN-153 | |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| PicoPump | neumático World Precision Instruments | SYS-PV830 | |
| Pinza de anillo | Fine Scientific Instruments | 11103-09 | |
| Microscopio estereoscópico | Olympus | SZX10 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Solución salina tamponada Tris, 10x | Disuelva 24,2 g de base Tris y 90 g de NaCl en 990 ml de dH2O. Ajuste el pH a 8.0 agregando 10 ml de HCl al 37% (vol/vol). La solución se puede almacenar a temperatura ambiente hasta por 6 meses. | ||
| Pinzas con electrodo de placa de platino redondo 2 de espacio variable, 10 mm de diámetro | Nepa Gene |
Referencias
- O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).
- Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M.
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Reimpresiones y permisos
