Identificación de fosfato de inositol o proteínas que interactúan con fosfoinositida por cromatografía de afinidad acoplada a Western Blot o espectrometría de masas

Resumen

Este protocolo se centra en la identificación de proteínas que se unen a fosfatos de inositol o fosfoinosítidos. Utiliza cromatografía de afinidad con fosfatos de inositol biotinylados o fosfoinositidos que se inmovilizan a través de estreptavidina a agarosa o cuentas magnéticas. Las proteínas de unión de fosfato de inositol o fosfoinositida se identifican por la hincha occidental o espectrometría de masas.

Resumen

Fosfatos de inositol y fosfoinosítidos regulan varios procesos celulares en eucariotas, incluyendo la expresión génica, tráfico de vesículas, transducción de señal, metabolismo, y el desarrollo. Estos metabolitos realizan esta actividad reguladora uniéndose a proteínas, cambiando así la conformación de proteínas, la actividad catalítica y/o las interacciones. El método descrito aquí utiliza cromatografía de afinidad acoplado a espectrometría de masas o hincha occidental para identificar proteínas que interactúan con fosfatos de inositol o fosfoinositidas. Fosfatos de inositol o fosfoinositidas se etiquetan químicamente con biotina, que luego se captura a través de la estreptavidina conjugada con agarosa o cuentas magnéticas. Las proteínas se aíslan por su afinidad de unión al metabolito, luego se eluyen e identifican mediante espectrometría de masas o hincha occidental. El método tiene un flujo de trabajo simple que es sensible, no radioactivo, libre de liposomas y personalizable, apoyando el análisis de la interacción de proteínas y metabolitos con precisión. Este enfoque se puede utilizar en métodos de espectrometría cuantitativa de masas sin etiquetas o en aminoácidos para identificar interacciones proteína-metabolito en muestras biológicas complejas o utilizando proteínas purificadas. Este protocolo está optimizado para el análisis de proteínas de Trypanosoma brucei,pero se puede adaptar a parásitos protozoarios relacionados, levaduras o células de mamíferos.

Introducción

Los fosfatos de inositol (IPs) y los fosfoinositidos (PI) desempeñan un papel central en la biologíadel eucariota a través de la regulación de los procesos celulares como el control de la expresión génica 1,^2,3, tráfico de vesículas ⁴, transducción de señal^5,6, metabolismo^7,8,9, y desarrollo^8,10. La función reguladora de estos metabolitos resul....

Protocolo

1. Análisis de proteínas de unión IP o PI mediante cromatografía de afinidad y hincha occidental

1. Crecimiento celular, lisis y cromatografía de afinidad
   1. Aumente las células de T. brucei hasta la fase de registro medio y supervise la viabilidad y densidad celular. Un total de 5.0 x 10⁷ celdas es suficiente para un ensayo de unión.
      1. Para las formas del torrente sanguíneo, las células de crecimiento en medios hinmultimedia-9 complementadas conun 10% de suero bovino fetal (FBS) a 37 oC y un 5% de CO 2. Mantenga la densidad celular entre 8.0 x 10⁵ a 1.6 x 10⁶ celdas/mL.
         NOTA: ....

Resultados

Análisis de la interacción RAP1 y PI(3,4,5)P3 por cromatografía de afinidad y hincha occidental
Este ejemplo ilustra la aplicación de este método para analizar la unión de PIs por RAP1 de T. brucei lysate o por proteína recombinante T. brucei RAP1. Los lysates de T. brucei formas del torrente sanguíneo que expresan rap1 con etiqueta de hemaglutinina (HA) se utilizaron en ensayos de unión. RAP1 es una proteína implicada en el control transcripcional de genes de glicoproteína .......

Discusión

La identificación de proteínas que se unen a iPs o PIs es fundamental para entender la función celular de estos metabolitos. La cromatografía de afinidad acoplada a la mancha occidental o a la espectrometría de masas ofrece la oportunidad de identificar proteínas que interactúan con IP o PI y, por lo tanto, obtener información sobre su función reguladora. IPs o PIs químicamente etiquetados [por ejemplo, Ins(1,4,5)P3 químicamente vinculados a la biotina] y reticulados a cuentas agarose a través de estreptavidina o captura.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Acetona	Sigma-Aldrich		650501 Cetona
Acetonitrilo	Sigma-Aldrich	271004	Solvente
Bicarbonato de amonio	Sigma-Aldrich	A6141	sales inorgánicas
Avanti J6-MI	Beckman Coulter	Avanti J6-MI	Centrífuga para grandes volúmenes (p. ej., 1L)
Botellas de centrífuga	Sigma-Aldrich	B1408	Frascos para la centrifugación de 1L de cultivo
Perlas de control	Echelon	P-B000-1ml	Reactivo de cromatografía de afinidad - control
D-(+)-Glucosa	Sigma-Aldrich	G8270	Azúcar, Añadido en PBS para mantener las células viables
Ditiothreitol (DTT)	Bio-Rad	1610610	Agente reductor
Dynabeads M-270 Estreptavidina	ThermoFisher Scientific	65305	Perlas de estreptavidina para unirse a ligandos de biotina
Cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA	Roche	11836170001	Inhibidores de la proteasa
Tampón de ejecución de electroforesis	Bio-Rad	1610732	25 mM Tris, 192 mM glicina, 0,1% SDS, pH 8,3
Tubos de centrífuga cónicos Falcon de 15 mL	430052 de Corning Life Sciences		Para centrifugar cultivos de 10 mL
Ácido fórmico	Sigma-Aldrich	Ácido	106526
Glicina	Sigma-Aldrich	G7126	aminoácido
HMI-9	ThermoFisher Scientific	ME110145P1	Medio de cultivo celular para formas
del torrente sanguíneo T. bruceiTinción de proteínas imperial	ThermoFisher Scientific	24615	Tinción de Coomassie para la detección de proteínas en SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 Beads	Echelon	Q-B0145-1ml	Reactivo de cromatografía de afinidad
Instantáneo  Sin grasas  Seco  Milk	Thomas Scientific		C837M64 Reactivo bloqueante para Western blot
Yodoacetamida	Sigma-Aldrich	I6125	Reactivo alquilante para proteínas o péptidos de cisteína
Lab  Rotador	Thomas Scientific	1159Z92	Para ensayos
de unión Tubos de microcentrífuga LoBind	ThermoFisher Scientific	13-698-793	Tubos de unión de proteínas bajas para espectrometría de masas
Nonidet  P-40 (Igepal CA-630)	Sigma-Aldrich	21-3277	Detergente
PBS, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	10010031	Tampón fisiológico
Sustrato de peroxidasa para quimioluminiscencia	ThermoFisher Scientific	32106	Sustrato para la detección de proteínas por Western blot
PhosSTOP Inhibidor de la fosfatasa Comprimidos de cóctel Roche		4906845001	Fosfatasa inhibidores
PI(3)P PIP Beads	Echelon	P-B003a-1ml	Reactivo de cromatografía de afinidad
PI(3,4)P2 PIP Beads	Echelon	P-B034a-1ml	Reactivo de cromatografía de afinidad
PI (3,4,5) P3 diC8	Echelon	P-3908-1mg	Reactivo de cromatografía de afinidad
PI(3,4,5)P3 PIP Beads	Echelon	P-B345a-1ml	Reactivo de cromatografía de afinidad
PI(3,5)P2 PIP Beads	Echelon	P-B035a-1ml	Reactivo de cromatografía de afinidad
PI(4)P PIP Beads	Echelon	P-B004a-1ml	Reactivo de cromatografía de afinidad
PI(4,5)P2 diC8	Echelon	P-4508-1mg	Reactivo de cromatografía de afinidad
PI(4,5)P2 PIP Beads	Echelon	P-B045a-1ml	Reactivo de cromatografía de afinidad
PI(5)P PIP Beads	Echelon	P-B005a-1ml	Reactivo de cromatografía de afinidad
Solución Ponceau S	Sigma-Aldrich	P7170	Tinción de proteínas (0,1% [p/v] en ácido acético al 5%)
Hexacianoferrato de potasio(III)	Sigma-Aldrich	702587	Sal de potasio
PtdIns PIP Beads	Echelon	P-B001-1ml	Reactivo de cromatografía de afinidad
Membrana de PVDF	Bio-Rad 1620177		para Western blot
Centrífuga refrigerada	Eppendorf	5910 R	Microcentrífuga para pequeños volúmenes (p. ej., 1,5 mL)
Dodecil sulfato de sodio	Sigma-Aldrich	862010	Detergente
Tiosulfato de sodio	Sigma-Aldrich	72049	Químico
Concentradores de vacío SpeedVac	ThermoFisher Scientific	SPD120-115 Concentración de	muestras (p. ej., para espectrometría de masas)
Matraces T175 para cultivo celular	ThermoFisher Scientific	159910	Para cultivar 50 mL T. brucei
Tripsina, Espectrometría de Masas Grado	Promega	V5280	Tripsina para la digestión de proteínas
Urea	Sigma-Aldrich	U5128	Reactivo desnaturalizante
Vortex	Fisher Scientific	02-215-418	Para reacciones de mezcla
tampón de transferencia Western blot	Bio-Rad	1610734	25 mM Tris, 192 mM de glicina, pH 8,3 con 20% de metanol
Whatman  Papel de 3 mm	Sigma-Aldrich	WHA3030861	Papel para transferencia Wester
2-mercaptoetanol (14,2 M)	Bio-Rad	1610710	Agente reductor
2x Tampón de muestra Laemmli	Bio-Rad	161-0737	Tampón de carga de proteínas
4– 20% Mini-PROTEAN  TGX Gel de 4561094 prefabricado de proteínas	Bio-Rad		para electroforesis de proteínas
4x Tampón de muestras Laemmli	Bio-Rad	161-0747	Tampón de carga de proteínas

Centrífuga de Medio de cultivo celular de