Análisis de la gait de bajo costo para el fenotipado conductual de modelos de ratón de enfermedad neuromuscular

Resumen

El análisis de huellas es una alternativa de bajo costo a los programas de análisis de marcha digitalizados para investigadores que cuantifican las anomalías del movimiento en ratones. Debido a su velocidad, simplicidad y potencial longitudinal, es ideal para la fenotipado conductual de modelos de ratón.

Resumen

La medición de la locomoción animal es una herramienta de comportamiento común utilizada para describir el fenotipo de una enfermedad, lesión o modelo de fármacos determinados. El método de bajo costo de análisis de marcha demostrado aquí es una medida simple pero efectiva de las anomalías de la marcha en los modelos murinos. Las huellas se analizan pintando los pies de un ratón con pintura lavable no tóxica y permitiendo que el sujeto camine a través de un túnel en una hoja de papel. El diseño del túnel de prueba aprovecha el comportamiento natural del ratón y su afinidad por pequeños lugares oscuros. La longitud de zancada, el ancho de zancada y la dispersión de los dedos de los dedos de cada ratón se miden fácilmente con una regla y un lápiz. Este es un método bien establecido y confiable, y genera varias métricas que son análogas a los sistemas digitales. Este enfoque es lo suficientemente sensible como para detectar cambios en la zancada al principio de la presentación de fenotipos, y debido a su enfoque no invasivo, permite realizar pruebas de grupos a lo largo de la vida útil o presentación fenotípica.

Introducción

La locomotora requiere una coordinación neurológica y musculoesquelética compleja, y los déficits en un solo aspecto de las vías motoras pueden producir anomalías observables de la marcha^1,2. El análisis de gait es una herramienta crítica para los investigadores que prueban modelos de ratón porque proporciona datos de comportamiento cuantificables sobre cómo una determinada enfermedad, lesión o fármaco afecta el movimiento de un animal³. Sin embargo, el análisis digitalizado de la marcha requiere la compra de una cinta de correr, una cámara y software asociado, que puede ser prohibitivamente caro para los investigadores. El análisis de gait se utiliza a menudo intermitentemente para rastrear los cambios longitudinales en la función motora, por lo tanto, puede ser difícil justificar el gasto si se utiliza esporádicamente⁴. Aunque los análisis digitalizados pueden proporcionar métricas de marcha más detalladas que el simple análisis de huellas, estas medidas más complejas no siempre son necesarias o relevantes para la caracterización de un fenotipo conductual^5.

Aquí presentamos un método de análisis manual de huellas de bajo costo como una alternativa rápida y sensible a los programas de análisis de marcha digitalizado^6,7. Se ha demostrado que el análisis manual de la huella detecta diferencias significativas en la marcha en una multitud de modelos de enfermedad murina^{4,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16,17}, y en al menos un caso, este método de bajo costo identificó cambios en la marcha que no fueron detectados por un programa común de análisis de marcha digitalizado¹². El costo total de los materiales es nominal, y se puede adaptar fácilmente a otros modelos de investigación de roedores.

Aunque hay muchas métricas de marcha diferentes a partir de las cuales se pueden extraer datos, el método que describimos se centra en tres métricas específicas: longitud de zancada, ancho de zancada (también llamado "ancho de pista") y dispersión de los dedos de los dedos. Es importante tener en cuenta que los parámetros que deben evaluarse deben determinarse modelo por modelo. Este método de análisis de marcha no está diseñado para medir la función cognitiva, y no se recomienda para estudios que requieren mediciones biomecánicas complejas de la marcha^16.

Presentamos datos de comportamiento de una cohorte de ratones pre y postsintomáticos que modelan la atrofia muscular espinal y bulbar ligada al X (SBMA), una enfermedad neuromuscular caracterizada por la degeneración de las neuronas motoras y la atrofia muscular. Estos ratones desarrollan déficits progresivos en la marcha que coinciden con la aparición de otros fenotipos específicos de la enfermedad. Esto demuestra la validez y especificidad de este método, y confirma que puede discriminar de forma fiable entre los animales afectados y los no afectados.

Los ratones experimentales en este estudio fueron 2.5 (presintomáticos) y 9-meses de edad (post-sintomático) bac fxAR121 ratones transgénicos sobre un fondo C57BL/6 (n_exptn.o 12). Este modelo fue generado en nuestro laboratorio y se ha caracterizadoplenamente como un potente modelo de ratón de SBMA 9. Se utilizaron camadas no transgénicas como controles (n_ctrln.o 8). SBMA es una enfermedad limitada por sexo que se manifiesta completamente en los hombres solamente, por lo que los ratones machos se utilizaron exclusivamente para este estudio. Durante las etapas de planificación, los investigadores deben tener en cuenta las consideraciones de sexo de los Institutos Nacionales de Salud como variable biológica para determinar el tamaño del grupo y la composición^18.

Protocolo

Todas las pruebas realizadas con ratones fueron revisadas y aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Duke. El personal responsable de las pruebas y la puntuación debe estar cegado al genotipo animal o a la condición experimental hasta que se haya completado el análisis de la marcha y la puntuación de los papeles para toda la cohorte.

1. Preparación del material de ensayo

1. Realice pruebas con un túnel construido a partir de 3 paneles de acrílico transparente precortados de 0,375 pulgadas de grosor. Montar el túnel mediante el encolado de paneles junto con un sellador que se une específicamente al acrílico y no emitirá olores cuando se seque.
   1. Para ratones C57BL/6 estándar, utilice las siguientes mediciones de túnel: 2,5 in. de ancho, 3 in. de alto y 13 in. de largo. Los ratones deben ser capaces de caminar cómodamente a través del túnel y tomar suficientes pasos (>4) para que la marcha se pueda medir.
2. Construir la cámara de meta con paneles de acrílico gris precortado 0.375 pulgadas de espesor, pegado junto con el mismo sellador que se utiliza en el túnel. Las medidas interiores de la cámara son de 4 in. de ancho, 4 in. de largo y 3 in. de alto. Haga coincidir la apertura de esta cámara con la apertura del túnel (2,5 in. ancho x 3,0 in. de alto). Debido a que los ratones naturalmente prefieren espacios oscurecidos a espacios bien iluminados, utilice material que sea opaco y de color oscuro.
3. Utilice papel para realizar un seguimiento de los pasos que sean gruesos y lisos (el papel de acuarela funciona bien). Corte tiras de papel individuales para que sean ligeramente más anchas y más largas que la anchura y la longitud del túnel. Si utiliza las dimensiones del túnel descritas aquí, corte los papeles a 15 in. de largo por 3,5 in. de ancho.
4. Utilice dos colores contrastantes (por ejemplo, verde y púrpura) de pintura a base de agua no lavable no tóxica. Asigne un color para las extremidades posteriores, el segundo para las extremidades anteriores. Los ratones lamen la pintura restante de sus pies después de la prueba, por lo que la pintura seleccionada debe ser completamente no tóxica.
5. Utilice dos pinceles redondos de barril, uno para cada color de pintura (0,5 cm de diámetro, punta de pincel cónica/puntiaguda).
6. Seleccione una regla con marcas de hasta milímetros, y una pinza con medidas de hasta 0,1 mm. Se recomienda escribir en los papeles de puntuación.
7. Opcional: Para animales con alta ansiedad o baja motivación, proporcionar un incentivo conductual en la cámara de la portería. Esto puede incluir pequeñas cantidades de semillas de girasol esterilizadas (colocadas en la jaula doméstica 2 días antes de la prueba para permitir la habituación). El día de las pruebas, coloque semillas de girasol dentro de la cámara de meta para animar a los ratones a caminar sin detenerse.

2. Recopilación de datos

1. Si las pruebas se realizan en una habitación separada, aclimate los ratones a la nueva habitación durante 30 minutos y luego comience los ensayos conductuales. Además, debido a que los ratones son naturalmente nocturnos, asegúrese de que todos los ratones estén completamente despiertos y alerta durante al menos 5 minutos antes de la prueba.
2. Prepare la configuración de la prueba colocando el túnel sobre el papel y marcando el papel con el ID del ratón y la fecha de prueba. Coloque la cámara de objetivos al final del túnel, conectando ambos extremos abiertos. Agregue semillas de girasol al final del túnel (dentro de la cámara de meta) para la motivación si es necesario.
3. Retire el ratón para ser probado de su jaula y agarrándolo firmemente por su estrucida, asegurándose de agarrar la cola para estabilizar el movimiento de sus extremidades traseras.
4. Pintar las patas delanteras para que toda la parte inferior de todos los dedos de los pies y el centro del pie estén completamente cubiertos de pintura. Repita esto con un color de pintura contrastante en sus patas traseras. Limpie cualquier pintura que el ratón obtenga en otras partes de su cuerpo con un paño limpio y húmedo para evitar manchas que puedan interferir con la recopilación de datos.
   NOTA: El manejo del ratón debe ser realizado por investigadores experimentados para minimizar el estrés animal.
5. Coloque el ratón al comienzo del túnel y deje que camine hasta la cámara de meta, y luego recupere el ratón, limpie suavemente sus pies con un paño humedecido por agua y devuélvalo a su jaula de origen.
6. Deje que el papel con huellas se seque completamente antes de puntuar. Limpie el área de ensayo y el túnel con etanol o una solución de limpieza equivalente entre cada animal.

3. Criterios de puntuación

1. Utilice pasos espaciados de forma coherente con huellas claras y no manchadas para la puntuación. La Figura 1B es un buen ejemplo de una secuencia de huella que se puede puntuar. Para generar suficientes datos de puntuación, debe haber al menos 2 pasos consecutivos de cada pie, pero se recomiendan 4-6 pasos por pie. No incluya la primera y la última huella en el papel, ya que es poco probable que representen la marcha normal porque el ratón está cambiando su velocidad de marcha.
2. Utilice la longitud de zancada, el ancho de zancada y la dispersión del dedo del dedo del dedo del tiempo como tres medidas diferentes de la marcha que se pueden analizar utilizando este método.
   NOTA: La longitud y la anchura del zancada requieren impresiones secuenciales claras en las que la región del antepié está bien definida en la pintura. El pliego de pies no requiere impresiones secuenciales para la puntuación, solo las impresiones claras del primer y último dedo del pie en un solo pie. Sin embargo, si una huella determinada no se incluye en las mediciones de la longitud o anchura de la zancada, no se puede puntuar para la dispersión del dedo del dedo del dedo del dedo del pelo. Las tres medidas se evalúan en centímetros.
   1. Defina la longitud de zancada como la distancia entre dos huellas secuenciales creadas por el mismo pie (es decir, una zancada) (Figura1A, 1B).
      1. Con un lápiz, dibuje un círculo de 2-4 mm alrededor de la región del pie frontal de ambas huellas de las extremidades delanteras (identificadas por el color asignado arriba) en una sola zancada y dibuje una línea entre ellas usando una regla.
      2. Registre la distancia entre dos impresiones desde el centro de cada círculo (es decir, el centro de cada almohadilla de pie) como Right-Fore 1 (RF1) o Left-Fore 1 (LF1).
      3. Repita el proceso para todos los pasos que se pueden puntuar (RF2, LF2, RF3, LF3 y así sucesivamente).
      4. Repita el procedimiento para las huellas de las extremidades posteriores derecha e izquierda.
      5. Promedio de todas las distancias de zancada registradas individuales para cada extremidad. Para el análisis estadístico, los miembros individuales de la cohorte se pueden promediar juntos.
   2. Definir la anchura de zancada como la medida de la distancia entre las extremidades delanteras izquierda y derecha o las extremidades posteriores (Figura1A, 1B).
      1. Para evaluar esta distancia, dibuje y mida una línea de la región del antepié circular de una extremidad posterior que se interseca perpendicularmente con la línea para la longitud de zancada en la extremidad posterior contralateral.
      2. Repita esto para todas las impresiones de las extremidades posteriores que se pueden puntuar y, a continuación, promedialas las mediciones. El método de cálculo para el ancho de zancada es el mismo para las extremidades delanteras y traseras.
   3. Defina la dispersión del dedo del pie como la distancia entre el primer y el último dedo del pie en una sola huella de la extremidad delantera o trasera (Figura1A, 1B).
      1. Utilice pinzas para medir la distancia entre la punta de la primera impresión del dedo del pie y la punta de la última impresión del dedo del pie.
      2. Repita el procedimiento para todas las impresiones de las extremidades posteriores que se pueden puntuar y promediar las mediciones. El método de cálculo para la dispersión del dedo del pie es el mismo para las extremidades delanteras y traseras.
3. Si el papel no se puede puntuar, deje que el animal descanse durante 10 minutos antes de intentarlo de nuevo.

Resultados

Con un número suficiente de animales, este procedimiento es capaz de detectar diferencias de marcha entre los genotipos del ratón, dentro de la misma tensión a lo largo del tiempo. La Figura 1B muestra rastros representativos de imágenes de huella recogidas en nuestro laboratorio, utilizando un modelo de ratón de atrofia muscular espinal y bulbar ligada al X (SBMA), un trastorno neurodegenerativo que afecta a las neuronas motoras inferiores y al músculo esquelético. Hemos informado previamen...

Discusión

Utilizando el método de análisis de marcha de bajo costo descrito anteriormente, mostramos una identificación exitosa de varios parámetros de la disfunción de la marcha a edades post-sintomáticas en el modelo de ratón BAC fxAR121 de SBMA. Las disminuciones en la longitud de zancada son consistentescon estudios anteriores de SBMA de modelos de ratón y pacientes humanos 9. También demostramos por primera vez que hay diferencias significativas en la propagación del dedo del pie en las extremidades po...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pinza	n/a	n/a	debe tener marcas de hasta 0,1 mm
Pegamento artesanal	E6000	n/a
Pintura de huellas (pintura al temple)	Artmind	n/a	debe ser no tóxico
Pinceles de barril redondo	Symply Simmons	n/a	0,5 cm de diámetro
Regla	n/a	n/a	debe tener marcas de hasta milímetros
Papel de incisión (blocs de acuarela)	Canson	n/a	cortado a medida
Cámara de túnel y portería	Interstate Plastics	n/a	cortado a medida