Debido a la superposición espectral de las longitudes de onda de excitación y emisión de nadáya y fura-2 análogos, la interferencia de señal de ambos productos químicos en las células vivas es inevitable durante la medición cuantitativa de [Ca2+]. Por lo tanto, se desarrolló un nuevo método de corrección en línea de interferencia de señal NADH para medir [Ca2+].
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Artículo de método
Un novedoso método de corrección de la nicotinamida adenina dinucleótido para la medición intracelular Ca2+ con Fura-2-Analog en células vivas
En este artículo
Resumen
Resumen
Para medir [Ca2+] cuantitativamente, se utilizan con frecuencia análogos fura-2, que son fluorosondas ratiométricas. Sin embargo, el uso de tinte está intrínsecamente limitado en células vivas debido a la interferencia de autofluorescencia, principalmente de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH). Más específicamente, este es un obstáculo importante cuando se mide la mitocondrial [Ca2+] cuantitativamente usando análogos fura-2 porque la mayoría de NADH está en las mitocondrias. Si la concentración de tinte fluorescente es la misma, una cierta intensidad de excitación debe producir la misma intensidad de emisión. Por lo tanto, la relación de intensidad de emisión de dos longitudes de onda de excitación diferentes debe ser constante. Sobre la base de este principio, se desarrolló un nuevo método de corrección en línea de interferencia de señal NADH para medir [Ca2+], y se puede obtener la intensidad real de la señal de NADH y fura-2. Además, se desarrolló una nueva ecuación para calcular [Ca2+] con excitación o excitación isosbestica a 400 nm. Con este método, los cambios en la mitocondrial [Ca2+] podrían medirse con éxito. Además, con un conjunto diferente de longitudes de onda de excitación y emisión, se podrían medir simultáneamente múltiples parámetros, incluyendo NADH, [Ca2+] y pH o potencial de membrana mitocondrial(m). Las mitocondriales [Ca2+] ym o pH se midieron utilizando fura-2-FF y éster etílico de tetrametilrhodamina (TMRE) o carboxia-seminaphtorhodafluor-1 (carboxy-SNARF-1).
Introducción
El papel significativo de Ca2+ intracelular es ampliamente conocido1. La cuantificación de [Ca2+] es esencial para entender los procesos de las funciones fisiológicas celulares. Los análogos Fura-2 son bastante útiles porque están excitados en el rango UV (<400 nm), y el método ratiometric se puede aplicar para la medición cuantitativa. Por lo tanto, otros parámetros fisiológicos como pH, potencial de membrana, etc., se pueden medir con otros colorantes fluorescentes. El rango de concentración de Ca2+ mitocondrial ([Ca2+]m) fue al parecer 0,08 x 20 m2,3,4,5. Entre los análogos fura-2, fura-2-FF es apropiado para medir este rango de [Ca2+]. Sin embargo, las células vivas contienen desafortunadamente NADH/NADPH para sus procesos metabólicos, y NADH genera interferencia de señal debido a la excitación superpuesta y espectros de emisión con el análogo fura-2. Esta interferencia limita en gran medida el uso de análogos fura-2. Específicamente, si el análogo se aplica para medir la mitocondrial [Ca2+],esta interferencia es el mayor obstáculo porque la mayor cantidad de NADH está en las mitocondrias. Esto se complica aún más por los cambios de NADH relacionados con el potencial de la membrana mitocondrial(m) y el cambio dem afecta [Ca2+]m6,7,8 , 9. Además, para estudiar la dinámica [Ca2+]m, es esencial conocer el estado de otros parámetros mitocondriales, como NADH,my pH.
Las emisiones a 450 nm y 500 nm con excitaciones a 353 nm, 361 nm y 400 nm contienen las señales de NADH y fura-2-FF, y las ecuaciones son las siguientes. Aquí, 353 nm y 361 nm son los puntos isosbesticos de fura-2-FF para emisiones a 450 nm y a 500 nm, respectivamente.
F361,450 - F361,450,NADH + F361,450,Fura Ecuación 1
F353,500 - F353,500,NADH + F353,500,Fura Ecuación 2
F400,500 - F400,500,NADH + F400,500,Fura Ecuación 3
donde Fx,y es la intensidad de emisión medida a y-nm por excitación x-nm, Fx,y,NADH representa la intensidad de emisión pura dependiente de NADH, y Fx,y,Fura representa la intensidad de emisión pura dependiente de fura-2-FF. Bajo la misma concentración del tinte fluorescente, una cierta intensidad de excitación debe producir la misma intensidad de emisión. Por lo tanto, la relación de intensidad de emisión de dos longitudes de onda de excitación diferentes debe ser constante. Ca2+ y fura-2 no afectaron las características de fluorescencia de NADH; por lo tanto, la relación de la emisión a 450 nm y a 500 nm de NADH era constante en cualquier longitud de onda de excitación. La misma regla se puede utilizar para fura-2-FF sobre la base de la suposición de que NADH o [Ca2+] no afecta a los espectros de emisión y excitación de fura-2-FF. Sin embargo, Ca2+ causó un cambio espectral de la emisión fura-2-FF. Por lo tanto, para eliminar el efecto de Ca2 +, excitación isosbestica, que es independiente de Ca2 +, necesita ser utilizado. Cada longitud de onda de emisión (es decir, 450 nm y 500 nm) tiene un punto isosbestico diferente, y a partir de nuestra configuración experimental, se eligieron 353 nm a 500 nm y 361 nm a 450 nm. A partir de estos, las siguientes ecuaciones son válidas10.
Rf a F361,450,Fura/F353,500,Fura Ecuación 4
RN1 a F400,500,NADH/F361,450,NADH Ecuación 5
RN2 a F353,500,NADH/F361,450,NADH Ecuación 6
Con estas constantes, las siguientes ecuaciones de (Ecuación 1) (Ecuación 2) y (Ecuación 3) son válidas.
F361,450 á F361,450,NADH + Rf á F353,500,Fura Ecuación 7
F353,450 á RN2 a F361,450, NADH + F353,500,Fura Ecuación 8
F400,500 á RN1 a F361,450, NADH + F400,500, Fura Ecuación 9
A partir de estas ecuaciones, si se conocen Rf, RN1y RN2, las señales puras de NADH y fura-2 se pueden obtener de la siguiente manera.
F361,450,NADH á (F361,450 - Rf á F353,500)/(1 - Rf - RN2) Ecuación 10
F353,500,Fura á (RN2 a F361,450 a F353,500)/(Rf - RN2 - 1) Ecuación 11
F400,500,Fura á F400,500 á RN1 a F361,450, NADH Ecuación 12
RFura f353,500,Fura/F400,500,Fura Ecuación 13
La forma Ca2+-bound de fura-2-FF era prácticamente no fluorescente en la longitud de onda de excitación de 400 nm. En función de esta propiedad, se puede derivar la siguiente nueva ecuación de calibración.
[Ca2+] á Kd á (F400,500,max/F353,500,max) ? (RFura - Rmin) Ecuación 14
donde Kd es una constante de disociación, F400,500,max y F353,500,max son los valores máximos de las señales emitidas a 500 nm con excitaciones a 400 nm y 353 nm, respectivamente, y Rmin es el mínimo RFura en Ca2 +-condición libre. Dado que se utilizaron las excitaciones isosbesticas, la ecuación se puede simplificar de la siguiente manera.
[Ca2+] á Kd á (1 / Rmin) á (RFura ? Rmin) Ecuación 15
Por lo tanto, sólo se requieren valoresmínimos Kd y R para calcular [Ca2+].
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Protocolo
Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el comité institucional local de cuidado y uso de animales.
1. Preparación de la solución
- Preparar miocitos cardíacos únicos recién aislados11.
NOTA: Cada laboratorio puede tener una solución de almacenamiento de células diferente. Aquí, los miocitos se almacenan en medio de cultivo (DMEM). - Preparar 100 mL de Solución libre de Ca2+(Tabla 1).
- Preparar 50 ml de medio de cultivo en un vaso de precipitados de 50 ml. Aliquot 5 mL y ponerlo en un baño de agua a 37oC. Mantenga la solución restante a temperatura ambiente.
- Prepare 50 ml de la solución de saponina añadiendo 5 mg de saponina a 50 ml de solución libre de Ca2+.
NOTA: La saponina se utiliza para permeabilizar los miocitos cardíacos, para eliminar los compartimentos citosólicos y para visualizar únicamente la fluorescencia mitocondrial. - Preparar 16 l de 1 mM de fura-2-FF-AM disuelto en dimetil sulfóxido (DMSO).
NOTA: Hacer 1 mM de solución de stock de fura-2-FF-AM disuelto en DMSO y alícuota 16 L en un tubo de 2 ml. Guárdelos a -20oC hasta su uso. - Preparar 50 mL de solución libre de NADH Ca2+(Tabla 1) y 50 mL de solución saturada sin NADH Ca2+(Tabla 1) cuando se midan los puntos isosbesticos. Ajuste el pH a 7.0 con KOH.
NOTA: La solución libre de NADH Ca2+(Tabla 1) contiene FCCP de 10 m y ADP de 100 m sin sustratos mitocondriales para minimizar la NADH en las mitocondrias. - Preparar 50 ml de solución libre de Ca2+,50 ml de solución de malato, 50 ml de solución de piruvato, 50 ml de solución de malato-piruvato y 50 ml de solución de rotenona para las mediciones del factor de corrección NADH (Tabla 1).
2. Procedimiento de carga de fluorosonda en las mitocondrias
- Preparar la solución de carga de tinte añadiendo 2 ml del medio de cultivo a 16 ml de 1 mM fura-2-FF-AM.
NOTA: El tinte fluorescente es frágil bajo la luz. Prepare la solución justo antes de su uso. Mantenga la solución que contiene el tinte fluorescente en un lugar oscuro. La concentración final de fura-2-FF-AM es de 8 m. Si se utilizó carboxy-SNARF-1, prepare la solución de carga de colorante con carboxy-SNARF-1-AM de 2 M. - Tome 2 ml de las células aisladas y colóquelas en un tubo de ensayo de 5 ml en posición vertical.
- Espere 15 minutos para que los miocitos se hundan hasta el fondo y retire el sobrenadante.
NOTA: El sobrenadante puede contener residuos celulares. No centrifugar el tubo para evitar daños celulares. - Añadir 2 ml de la solución de carga de colorantes.
- Incubar la solución de carga de colorante con células durante 60 min a 4oC.
- A continuación, coloque el tubo de ensayo en un baño de agua de 37 oC durante 30 minutos en posición vertical.
- Retire el sobrenadante y agregue 4 ml del medio de cultivo precalentado de 37 oC. Incubar las células durante 60 minutos en un baño de agua de 37 oC.
- Finalmente, retire el sobrenadante, agregue 4 ml de medio de cultivo a temperatura ambiente y mantenga el tubo a temperatura ambiente.
3. Introducción del sistema de medición multiparamétrica
NOTA: La Figura 1 muestra un diagrama de todo el sistema.
- Para una fuente de luz de excitación, utilice un monocromático rápido (policromator II) que pueda cambiar la luz dentro de 3 ms.
- Utilice una lente de inmersión en aceite (40x, NA 1.3) con un microscopio invertido para aumentar la intensidad de la señal.
- Utilice un filtro de infrarrojo cercano y una cámara de dispositivo acoplado a carga (CCD) para supervisar el campo del objeto sin interferencias de señal fluorescente.
- Capture la imagen del campo de objeto para obtener el área.
- Ajuste el campo de objeto en la pantalla del monitor con un diafragma de campo solo para mostrar la celda para reducir el fondo.
- Utilice cuatro tubos fotomultiplicadores con cada filtro de paso de banda (450, 500, 590 y 640 nm) para detectar longitudes de onda de emisión con el método de recuento de fotones. Utilice los espejos dicoicos apropiados para dividir y redirigir la luz de emisión.
NOTA: La luz de excitación es muy fuerte en comparación con la luz de emisión. Por lo tanto, elija el filtro de paso de banda con las características de bloqueo más altas para reducir el fondo. Un sistema de recuento de fotones comprende una combinación de PMT, unidades de contador de fotones y un contador de alta velocidad. Para controlar el sistema y muestrear los datos, se utilizó un software de conducción personalizado. Es necesario encontrar una manera de aplicar este método con otros sistemas.
4. Métodos de corrección de NADH con un sistema de medición multiparamétrico
- Identificación de los puntos isosbesticos de Fura-2-FF in situ.
NOTA: Muchos informes han declarado que las características fluorescentes se cambian en las células. Por lo tanto, realice todos los procedimientos para obtener los parámetros para corregir la interferencia in situ.- Monte la celda cargada de tinte en el microscopio y espere 3 minutos para hundir las células hasta la parte inferior.
NOTA: Ajuste los números de celda para ver alrededor de una celda por un campo objetivo con lente objetivo 40x. - Perfundie la solución libre de NADH Ca2+-free a 37oC.
- Después de apuntar a la celda, mida el fondo libre de celdas y el área de celda como se muestra en la sección 4.1. Calcule el fondo de la celda a partir del área de celda.
NOTA: Ambas señales de fondo deben corregirse en cada experimento. - Perfundie la solución de saponina durante 60 s y vuelva a la solución libre de NADH Ca2+.
- Mida las señales emitidas por Fura-2-FF a 450 nm y 500 nm simultáneamente mediante la exploración de excitación de 350 nm a 365 nm con el paso de 0,1 nm.
- Perfundie la solución saturada Ca2+libre de NADH y repita el paso 4.2.5.
- Restar las señales en la solución Ca2+saturada de las señales en las condiciones libres de Ca2+.
- Repita los procedimientos de 4.2.2 a 4.2.7 con otros miocitos cardíacos individuales.
NOTA: Si la intensidad de la señal se debilita, repita desde 4.2.1. Repita el procedimiento para, al menos, 5 celdas diferentes. - A partir de todas las señales obtenidas, calcule las desviaciones estándar de la emisión en cada excitación y elija la longitud de onda de excitación que muestre el valor mínimo de desviación estándar (SD) como un punto isosbestico.
NOTA: Las cifras representativas se muestran en la Figura 2.
- Monte la celda cargada de tinte en el microscopio y espere 3 minutos para hundir las células hasta la parte inferior.
- La detección de señal de fondo y los métodos de corrección con el área celular
NOTA: Hay dos tipos de fondos. Uno proviene de las células y el otro proviene de la reflexión en el deslizamiento de la cubierta (el fondo libre de celdas). Ambos fondos deben corregirse en cada experimento.- Monte las células sin tinte en el baño en el microscopio y espere 3 minutos para hundir las células hasta el fondo. Perfuse NADH-free Ca2+- solución gratuita durante unos 5 minutos.
NOTA: Toda la velocidad de perfusión de la solución es de 2-3 ml/min a 37 oC.
NOTA: Ajuste los números de celda para ver alrededor de una celda por un campo objetivo con lente objetivo 40x. - Establezca el campo de objeto para cubrir la celda de destino.
- Después de mover la celda fuera del campo, mida las señales de fondo de la ventana sin celda y establézcalas como desplazamientos.
NOTA: La señal significa que la señal de luz debe detectarse en el sistema de recuento de fotones. - Devuelva la celda a la posición inicial y mida las señales de fondo de la celda y el área de la celda.
NOTA: Aunque la luz de excitación se filtra con el filtro de paso de banda, todavía contiene una gran cantidad de luz filtrada. Esta luz se dispersa al golpear las células y causa una señal de fondo considerable porque el sistema de recuento de fotones es altamente sensible. Hay que corregirlo.
NOTA: El área de la celda se puede calcular con una imagen de celda capturada y un software de imágenes disponible. La unidad del área de celda puede ser cualquier unidad, incluido el número de píxeles. Sólo la estandarización es necesaria. - Repita de 4.1.1 a 4.1.4 10 veces para obtener la relación entre el área celular y las señales de fondo de la celda.
NOTA: Más adelante, las señales de fondo de celda se pueden calcular a partir del área de celda a partir de la relación. Dado que la bombilla de excitación se convierte en envejecimiento, este procedimiento debe repetirse, al menos, cada mes.
- Monte las células sin tinte en el baño en el microscopio y espere 3 minutos para hundir las células hasta el fondo. Perfuse NADH-free Ca2+- solución gratuita durante unos 5 minutos.
- Medición de factores R
- Calcular Rf con la ecuación 4 a partir de las señales obtenidas en la sección 4.2.
- Monte las células sin tinte en el microscopio y perfundie la solución libre de Ca2+.
- Mida las señales como F361, 450, NADH,F400, 500, NADH,F361, 450, NADHy F353, 500,NADH.
- Perfundie la solución de malato y repita 4.3.3. y medir las señales.
- Perfundie la solución de piruvato y repita 4.3.3. y medir las señales.
- Perfundie la solución de malato-piruvato y repita 4.3.3. y medir las señales.
- Perfundie la solución de rotenona y repita 4.3.3. y medir las señales.
NOTA: En la Figura 3se muestra el ejemplo de la señal NADH registrada en piruvato de 5 mM, malato de 5 mM más 5 mM de piruvato y adición de rotenona de 10 m. - Calcular cada pendiente de F361, 450, NADH vs F400, 500, NADH y F361, 450, NADH vs F353, 500, NADH. Como se muestra en la Figura 3. Cada pendiente indica RN1 y RN2.
5. Selección de la excitación y la luz de emisión para TMRE o carboxy-SNARF-1
- Si se utilizó TMRE para medir el potencial mitocondrial, utilice la longitud de onda de excitación de 530 nm y la longitud de onda de emisión de 590 nm.
- Si se utilizó carboxy-SNARF-1 para medir el potencial mitocondrial, utilice además la longitud de onda de excitación de 540 nm y las longitudes de onda de emisión de 590 nm y 640 nm12.
6. Selección del valor Kd de fura-2-FF
- El cambio de pH puede afectar a los valores Kd para la unión Ca2+ en fura-2-FF10. Utilice el valor Kd de 5,28 a pH 7,5 para las mitocondrias.
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Resultados
Cambios mitocondriales Ca2+ debido a la corrección10
La Figura 4 muestra los cambios en [Ca2+]m antes y después de la corrección. Los resultados mostraron claramente los cambios sustanciales en [Ca2+]m. La concentración mitocondrial de calcio en reposo sin Citólico Ca2+ ([Ca2+]c) fue de 1,03 a 0,13 m (media a S.E., n a 32), y el máximo [Ca2+]m a 1-M [Ca2+]
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Discusión
El método de corrección de interferencia se desarrolló con éxito para medir las señales de NADH y fura-2 analógicos. La medición exacta de las señales es esencial para la corrección exacta. Sin embargo, la naturaleza inherente del dispositivo fluorescente produce una señal de fondo no relacionada con la de NADH de fura-2. El filtro de paso de banda de la más alta calidad sólo puede pasar hasta 10x 8 de las longitudes de onda no deseadas de la luz. Sin embargo, la señal fluorescente de una sola célula es muy pe...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado parcialmente por el Programa de Investigación de Ciencia Básica a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de Educación (2018R1A6A3A0111832), por el Ministerio de Ciencia, TIC y Planificación Futura (NRF-2016M3C1A6936606) y por el Ministerio de Comercio, Industria y Energía (10068076).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2 mL Eppendorf Tube | Axygen | MCT-200-C | 2 mL |
| Tubo convertidor AD/DA | Instrutech | ITC-18 | Equipo |
| ADP, Adenosina 5′-difosfato sal monopotásica dihidratada | Sigma-aldrich | A5285 | Productos químicos |
| Filtro de paso de banda | Ealing Electro-Optics, Inc | 35-3920 | Equipo, 640± |
| Filtro de paso <> banda fuerte | Omega Optical | 690-9823 | Equipo, 590 ± |
| Filtro de paso > banda fuerte < 15nm< / fuerte> | Omega Optical | 500DF20-9916 | Equipo, 500± Filtro |
| de paso > banda fuerte < 20nm | Chroma Technology Corp. | 60685 | Equipo, 450± |
| Solución > cloruro de calcio de 30 nm< < / fuerte> | Sigma-aldrich | 21114 | Productos químicos |
| carboxi-SNARF-1(AM) | Invitrogen | C1272 | Productos químicos |
| Dispositivo de carga acoplada (CCD) cámara | Philips | FTM1800NH/HGI | Equipo |
| espejo dicroico | Chroma Technology Corp. | 86009 | Equipo, Espejo dicroico multibanda, Reflexión : < 400 nm, 490 y más; 10, 560± 10, transmisión: 460± 15, 510± 20, >580nm |
| fuerte | Chroma Technology Corp. | 567DCXRU | Equipo, Reflexión : < 560 nm, Transmisión: > 580 nm |
| < fuerte> | Chroma Technology Corp. | 480dclp | Equipo, Reflexión : < 470 nm, Transmisión: > 490 nm |
| Chroma Technology Corp. | 20728 | Equipo, Espejo dicroico multibanda, Reflexión : < 405 nm, 470 y más; 30, transmisión: 430 nm ~ 520 nm, > 640 nm | |
| dimetilsulfóxido (DMSO)< / fuerte> | Sigma-aldrich | 154938 | productos químicos |
| DMEM, Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio | Sigma-aldrich | D5030 | Productos químicos |
| EGTA, Ácido egtácico, Ácido etileno-bis(oxietilennitrilo)tetraacético, Glicol éter diamina ácido tetraacético | Sigma-aldrich | E4378 | Productos químicos |
| FCCP, Mesoxalonitrilo 4-trifluorometoxifenilhidrazona | Sigma-aldrich | 21857 | Productos químicos |
| campo fuerte | Nikon | 86506 | Equipo |
| Fura-2-FF(AM) | TEFLABS | 137 | productos químicos |
| Tubo verde | DWM | tubo | |
| de ensayoHEPES, Ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico, N-(2-hidroxietil)piperazina-N′-(ácido 2-etanosulfónico)) | Sigma-aldrich | H3375 | Productos químicos |
| Contra< alta velocidad/fuerte> | National Instruments | NI-6022 | Equipo |
| Espejo caliente | Chroma Technology Corp. | 21002 | Equipo, 50:50 |
| Microscopio invertido | Nikon | TE-300 | Equipo |
| Malato | Sigma-aldrich | 27606 | Productos químicos |
| Filtro de infrarrojo cercano | Chroma Technology Corp. | D750/100X | , 750± |
| Lente de inmersión en aceite > 100nm< | Nikon | MRF01400 | 40x, NA 1.3; Equipo |
| Unidad de contador de fotones | Hamamatsu | C3866 | Equipo |
| Tubo multiplicador de fotones | Hamamatsu | R2949 | Equipo |
| Policromía II | Till Fotónica | SA3/MG04 | Equipo |
| Cloruro de potasio | Merck | 1.04936 | Productos químicos |
| Solución de hidróxido de potasio | Sigma-aldrich | P4494 | Productos químicos |
| Piruvato | Sigma-aldrich | 107360 | Productos químicos |
| Rotenona | Sigma-aldrich | R8875 | Productos químicos |
| Saponina | Sigma-aldrich | S4521 | Productos químicos |
| TMRE, tetrametilrodamina, éster etílico | moleculares | T669 | Productos químicos |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
