Method Article

Interacciones con y la permeabilización de membrana de las mitocondrias cerebrales por Amiloide Fibrils

DOI:

10.3791/59883

⸱

September 28th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), Zanjan, 45137-66731, Iran

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí se proporciona un protocolo para investigar las interacciones entre la forma nativa, las fibrillas prefibrilares y las fibrillas amiloideas maduras de diferentes péptidos y proteínas con mitocondrias aisladas de diferentes tejidos y diversas áreas del cerebro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un creciente cuerpo de evidencia indica que la permeabilización de la membrana, incluyendo membranas internas como las mitocondrias, es una característica común y el mecanismo primario de toxicidad inducida por agregadoa amiloide en enfermedades neurodegenerativas. Sin embargo, la mayoría de los informes que describen los mecanismos de interrupción de la membrana se basan en sistemas de modelos de fosfolípidos, y los estudios dirigidos directamente a los eventos que ocurren a nivel de membranas biológicas son raros. Descrito aquí es un modelo para estudiar los mecanismos de toxicidad amiloide a nivel de membrana. Para el aislamiento mitocondrial, el medio de gradiente de densidad se utiliza para obtener preparaciones con una contaminación mínima de la mielina. Después de la confirmación de la integridad de la integridad de la membrana mitocondrial, se investiga la interacción de las fibrillas amiloide derivadas de la sinucleína, la insulina bovina y el lysozima blanca de huevo de hien (HEWL) con las mitocondrias cerebrales de rata, como modelo biológico in vitro. Los resultados demuestran que el tratamiento de las mitocondrias cerebrales con conjuntos fibrilares puede causar diferentes grados de permeabilización de la membrana y mejora del contenido de ROS. Esto indica interacciones dependientes de la estructura entre las fibrillas amiloideas y la membrana mitocondrial. Se sugiere que las propiedades biofísicas de las fibrillas amiloideas y su unión específica a las membranas mitocondriales pueden proporcionar explicaciones para algunas de estas observaciones.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los trastornos relacionados con el amiloide, conocidos como amiloidosis, constituyen un gran grupo de enfermedades definidas por la aparición de depósitos de proteínas insolubles en diferentes tejidos y órganos1,2. Entre ellos, los trastornos neurodegenerativos son las formas más frecuentes en las que aparecen agregados proteicos en el sistema nervioso central o periférico2. Aunque se ha propuesto que una serie de mecanismos participen en la toxicidad de los agregados amiloide3 , un creciente cuerpo de evidencia apunta a la alteración de la membrana celular y la permeabilización como el mecanismo primario de la patología amiloide4, 5. Además de la membrana plasmática, los orgánulos internos (es decir, las mitocondrias) también pueden verse afectados.

Curiosamente, la evidencia emergente sugiere que la disfunción mitocondrial juega un papel crítico en la patogénesis de los trastornos neurodegenerativos, incluyendo la enfermedad de Alzheimer y Parkinson6,7. De acuerdo con este número, numerosos informes han indicado la unión y acumulación de amiloides-péptido, sinucleína, Huntingtin, y proteínas MUTANTes SOD1 vinculadas a ELA a las mitocondrias8,9,10, 11. Se cree que el mecanismo de permeabilización de la membrana por agregados amiloide ocurre ya sea a través de la formación de canales discretos (poros) y/o a través de un mecanismo no específico similar al detergente5,12, 13. Cabe destacar que la mayoría de estas conclusiones se han basado en informes que involucran sistemas de modelos de fosfolípidos, y los estudios dirigidos directamente a los eventos que ocurren en las membranas biológicas son raros. Claramente, estas bicapas de lípidos artificiales no reflejan necesariamente las propiedades intrínsecas de las membranas biológicas, incluidas las de las mitocondrias, que son estructuras heterogéneas y están compuestas por una amplia variedad de fosfolípidos y proteínas.

En el presente estudio, las mitocondrias aisladas de cerebros de ratas se utilizan como modelo biológico in vitro para examinar los efectos destructivos de las fibrillas amiloideas derivadas de la sinucleína (como proteína amiloidógena), insulina bovina (como un péptido modelo que muestra homología estructural significativa con insulina humana implicada en la amiloidosis localizada por inyección), y lisozima blanca de huevo de gallina (HEWL; como una proteína modelo común para el estudio de la agregación amiloide). Las interacciones y posibles daños de las membranas mitocondriales inducidas por las fibrillas amiloides se investigan observando la liberación de malato mitocondrial deshidrogenasa (MDH) (ubicado en la matriz mitocondrial) y oxígeno reactivo mitocondria (ROS).

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Ciencias Médicas de la Universidad de Teherán. Se realizaron esfuerzos máximos para minimizar el sufrimiento y los efectos perjudiciales para las ratas afilando las cuchillas de guillotina y aplicando movimientos resueltas y rápidos de la hoja.

1. Homogeneización cerebral y aislamiento mitocondrial

NOTA: Todos los reactivos para el aislamiento mitocondrial se prepararon de acuerdo con Sims y Anderson14.

  1. Preparación de tampones para el aislamiento mitocondrial
    1. Preparar una solución Tris-HCl de 100 mM: pesar 0,605 g de Tris-HCl y disolverla en aproximadamente 40 ml de agua desionizada (DW) en un vaso de precipitados. Transfiera la solución a un matraz volumétrico de 50 ml y aumente el volumen final a 50 ml añadiendo DW.
    2. Preparar una solución EDTA de 10 mM: pesar 0,202 g de EDTA y disolverla en aproximadamente 40 ml de DW en un vaso de precipitados. Transfiera la solución a un matraz volumétrico de 50 ml y aumente el volumen final a 50 ml añadiendo DW.
      NOTA: Ambas soluciones se pueden almacenar a 4 oC durante al menos 4 semanas.
    3. Preparar una solución de stock Tris-HCl/EDTA/sucrose: añadir 30 mL de 100 mM Tris-HCl y 30 mL de 10 mM EDTA en un vaso de precipitados. Pesar 32,86 g de sacarosa y añadirla al vaso de precipitados mientras se agita con un agitador magnético. Cuando la sacarosa se disuelva, transfiera la solución a un matraz volumétrico de 100 ml y aumente el volumen final a 100 ml añadiendo DW.
      NOTA: Esta solución se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de 3 días.
    4. Preparar un tampón de aislamiento (IB): añadir 100 mL de stock Tris-HCl/EDTA/sucrose a aproximadamente 150 mL de DW. Ajuste el pH a 7.4 agregando 0.1 M HCl. Aumente el volumen final a 300 mL agregando DW.
    5. Prepare un medio de gradiente de densidad del 15% (v/v) con IB añadiendo 1,5 ml de medio de gradiente de densidad a 8,5 ml de IB frío.
    6. Preparar 10 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) solución: pesar 20 mg de BSA libre de ácidos grasos y disolveren en aproximadamente 1,5 ml dw en un vial de 2 ml. Aumente el volumen final a 2 ml añadiendo DW y guárdelo en hielo hasta su uso.
      NOTA: Recién preparar las soluciones de los pasos 1.1.4–1.1.6 el día del aislamiento mitocondrial y almacenarlas en hielo hasta su uso.
  2. Aislamiento del cerebro de rata
    NOTA: La decapitación y la eliminación cerebral de ratas macho (150-200 g) se realizaron según Sims y Anderson14.
    1. Poner un vaso de precipitados de 30 ml en un cubo de hielo y añadir 10 ml de IB frío al vaso de precipitados.
    2. Decapitar a la rata con una pequeña guillotina animal y eliminar el cerebro del cráneo dentro de 1 min de la decapitación para limitar el deterioro de las propiedades mitocondriales.
    3. Transfiera rápidamente el cerebro al vaso de precipitados que contiene IB frío.
  3. Homogeneización cerebral y preparación de las mitocondrias
    NOTA: Las fracciones mitocondriales se aislaron según el protocolo descrito por Sims y Anderson14,con algunas modificaciones como se describió anteriormente15. Es importante trabajar rápidamente y mantener todo en hielo durante todo el procedimiento.
    1. Lavar el tejido 2x con 30 ml de IB, transferir a un vaso de precipitados que contiene IB frío, y picar finamente el cerebro con tijeras.
    2. Añadir 10 volúmenes de IB preenfriado (alrededor de 10 ml de IB por cerebro de rata).
    3. Transfiera la suspensión tisular a un homogeneizador Dounce frío de 20 ml.
    4. Homogeneizar las piezas de tejido utilizando nueve golpes arriba y abajo con un pestillo motorizado.
      NOTA: Deje la mezcla sobre hielo durante aproximadamente 30 s después de cada conjunto de tres trazos de homogeneización para asegurarse de que el homogeneato permanezca frío.
    5. Transfiera el homogeneizado a un tubo centrífugo preenfriado de 10 ml y centrífuga a 1.300 x g y 4 oC durante 3 min.
    6. Decantel cuidadosamente el sobrenadante y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 10 ml pre-enfriado y centrífuga a 21.000x g a 4oC durante 10 min.
    7. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en una solución media de gradiente de densidad fría del 15% (5 ml para cada cerebro) revolviendo suavemente la mezcla con una pipeta.
    8. Centrífuga en un rotor de ángulo fijo a 30.700x g a 4 oC durante 5 min utilizando una aceleración lenta (45 s de 0 rpm a 500 rpm seguida de aceleración normal) y desaceleración (sin frenos). Esto debe producir dos bandas distintas de material(Figura 1A, izquierda).
    9. Usando una pipeta Pasteur, retire la banda afilada de material acumulado en la parte superior del degradado, que en su mayoría contiene mielina. A continuación, retire la solución de medio de gradiente de densidad que cubre el material (en la banda 2) tanto como sea posible sin perder ninguna de las fracciones mitocondriales enriquecidas en la banda 2.
      NOTA: La banda 2 contiene las mitocondrias sinápticas y no sinápticas.
    10. Agregue 8 ml de IB a la fracción mitocondrial mientras remueve suavemente la mezcla con una pipeta.
    11. Centrífuga a 16.700x g a 4oC durante 10 min y retire cuidadosamente el sobrenadante, dejando el pellet suelto inferior intacto.
    12. Agregue 1 ml de BSA libre de ácidos grasos de 10 mg/ml al tubo centrífugo mientras remueve suavemente la mezcla con la punta de una pipeta. Aumente el volumen final a 5 ml por cerebro añadiendo IB.
    13. Centrífuga a 6.900g a 4oC durante 10 min, que debe producir un pellet firme(Figura 1A,derecha).
    14. Decantar el sobrenadante y resuspender suavemente el pellet mitocondrial en IB, alífera en tubos de 0,5 ml, y almacenar en nitrógeno líquido hasta su uso.

2. Determinación de la concentración de proteínas

NOTA: La concentración de proteínas se mide utilizando el método de Lowry et al.16.

  1. Preparación de soluciones para el ensayo Lowry
    1. Preparar la solución A: pesar 0,4 g de NaOH y 2 g de Na2CO3 y disolver en 80 ml de DW, luego transferir la solución a un matraz volumétrico de 100 ml y aumentar el volumen a 100 ml añadiendo DW.
    2. Preparar la solución B: pesar 0,1 g de tartrato de sodio de potasio y 0,05 g de CuSO4 y disolver en 8 ml de DW, luego transferir la solución a un matraz volumétrico de 10 ml y aumentar el volumen a 10 ml añadiendo DW.
      NOTA: Las dos soluciones A y B pueden permanecer estables a 4 oC durante un máximo de 6 meses.
    3. Preparar la solución C: Añadir 0,5 ml de solución de folin a 7,5 ml de DW.
      NOTA: Prepare la solución C fresca y manténgala alejada de la luz hasta su uso.
    4. Preparar las normas de BSA con concentraciones finales de 0, 20, 40, 60, 80, 100 y 120 g/ml combinando 0, 20, 40, 60, 80, 100 y 120 l de 1 mg/ml de BSA, respectivamente, con suficiente DW para hacer 1000 l de solución.
  2. Medición de la concentración de proteínas
    NOTA: Para una mayor precisión, ejecute este paso en triplicado.
    1. Añadir 50 l de soluciones estándar y homogeneización mitocondrial a cada pocto de una placa de 96 pocillos, seguido de la adición de 45 s de solución A. A continuación, incubar la placa durante 10 minutos en un baño de agua caliente a 50 oC.
    2. Añadir 5 l de solución B e incubar la placa durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente (RT).
    3. Añadir 150 s l de solución C e incubar la placa durante 10 minutos en un baño de agua tibia a 50 oC.
    4. Cargue la placa en un lector de placas y registre los valores de absorción para estándares y suspensión mitocondrial a 650 nm. A continuación, utilizando una curva de calibración, calcule el contenido proteico de las mitocondrias.

3. Determinación de la integridad de la membrana mitocondrial

NOTA: La integridad de la membrana mitocondrial se confirma midiendo la actividad de malato deshidrogenasa (MDH) en mitocondrias aisladas antes y después de la interrupción de la membrana por Triton X-100.

  1. Diluir el homogeneato mitocondrial a 1 mg/ml con IB frío y colocarse en dos tubos de 1,5 ml (normalmente 195 ml de mitocondrias por tubo).
  2. Añadir 5 sl de 20% (v/v) Triton X-100 (diluido con DW) a un tubo (como un control positivo para la actividad máxima enzimática) y 5 l de DW a otro tubo (para el control) seguido de la mezcla con un agitador.
  3. Incubar los tubos durante 10 minutos en un baño de agua tibia a 30oC.
  4. Mitocondrias de pellets por centrifugación de tubos en un rotor de ángulo fijo a 16.000 x g y 4 oC durante 15 min.
  5. Recoja cuidadosamente los sobrenatantes resultantes para evaluar la actividad de MDH mitocondrial utilizando un ensayo espectrofotométrico estándar descrito en la siguiente sección.
  6. Calcule la integridad de la membrana mitocondrial de la siguiente manera:
    figure-protocol-1

4. Determinación de la actividad MDH

NOTA: La actividad de MDH se midió espectrofotométricamente según lo descrito por Sottocasa et al.17.

  1. Preparación de soluciones para el ensayo de actividad de MDH
    1. Preparar una solución Tris-HCl de 50 mM (pH a 7,5): preparar una solución de 7,9 mg/ml en DW con Tris-HCl y ajustar el pH a 7,5 a 25 oC con 1,0 M NaOH.
    2. Preparar una solución de oxaloacetato de 50 mM: preparar una solución de 6,6 mg/ml con oxaloacetato en Tris-HCl.
      NOTA: Esta solución no es estable una vez en solución y debe prepararse inmediatamente antes de su uso.
    3. Preparar una solución de 10 mM-NADH: preparar una solución de 7,81 mg/ml utilizando el uso de NADH en Tris-HCl.
  2. Determinación de la actividad MDH
    NOTA: Las concentraciones finales de ensayo en una mezcla de reacción de 1,0 ml son 50 mM Tris-HCl, 5 mM de oxaloacetato y 0,1 mM de NADH.
    1. Ajuste el espectrofotómetro a 25 oC y 340 nm. Pipetear 890 l Tris-HCl tampón, 100 ml de solución de oxaloacetato y 10 ml de solución de NADH a una cubeta en blanco y tampón Tris-HCl de 880 l, 100 ml de solución de oxaloacetato y 10 ml de solución de NADH en una cubeta demuestra.
    2. Incubar cubetas en el espectrofotómetro durante 3-4 min y hacer referencia contra el espacio en blanco.
    3. A continuación, añadir 10 l de homogeneato mitocondrial (1 mg/ml) a la cubeta de muestra, mezclar inmediatamente por inversión, y registrar disminuciones en la absorbancia debido a la oxidación de NADH a 340 nm durante 1 min.

5. In vitro-sinucleína, insulina bovina y formación de fibrila HEWL

  1. Preparación de proteínas
    1. - Sinucleína:
      NOTA: La expresión y purificación de la sinucleina recombinante se realiza como lo describe Hoyer et al.18 con algunas modificaciones, y la pureza de la sinucleína se confirma por SDS-PAGE.
      1. Dialyze purificado de la sinucleina durante la noche contra la solución salina tamponada de fosfato (PBS).
      2. Determinar la concentración de proteínas utilizando un coeficiente de extinción de 5600 M-1 cm-1 a 275 nm19.
      3. Proteína Aliquots en tubos de 1,5 ml y almacenar a -80 oC hasta su uso.
    2. Insulina bovina y HEWL:
      1. Proporcione insulina bovina y HEWL.
      2. Disolver cada proteína en tampón de glicina de 50 mM (pH a 1,6; ajustar el pH con HCl).
      3. Determinar la concentración de insulina bovina y HEWL utilizando un coeficiente de extinción de 1,0 y 2,63 para 1,0 mg/ml a 276 nm y 280 nm, respectivamente20,21.
  2. Inducción de fibrilación amiloide
    1. Preparación de soluciones para la fibrilación amiloide:
      1. Preparar tampón de tioflavina T (ThT): pesar 0,3 g de NaH2PO4 y disolverlo en 80 ml de DW, ajustar el pH a 6,5 y aumentar el volumen a 100 ml añadiendo DW.
      2. Preparar la solución de culata (5 mM): pesar 1,6 mg de ThT y disolverla en 1 ml de tampón de TT, pasar a través de un papel de filtro de 0,22 m y mantener alejado de la luz a 4 oC hasta su uso.
        NOTA: Esta solución se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de 4 semanas.
      3. Preparar la solución ThT (1 mM): añadir 200 ml de solución de stock de TT (5 mM) a 800 ml de tampón De ThT.
        NOTA: Esta solución se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de 1 semana.
    2. Formación de fibrilade amiloide in vitro:
      1. Añadir alícuotas (294 ml) de solución proteica (200 m) y 6 l de solución de TT (1 mM) a tubos de 1,5 ml seguidos de agitación.
      2. Incubar los tubos en un termomezclador a 37oC bajo agitación constante a 800 rpm durante 4 días.
      3. Tomar alícuotas (10 l) de muestras incubadas después de intervalos de tiempo regulares y añadir 490 l de tampón de ThT, mezclado a fondo e incubar durante 5 min a RT.
      4. Establezca las anchuras de la excitación y de la ranura de emisión en 5 nm y 10 nm, respectivamente, y mida la fluorescencia ThT mediante excitación a 440 nm y la emisión a 485 nm utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia.
    3. Formación de fibrilade insulina bovina in vitro:
      1. Añadir 637 ml de solución proteica (250 m) a un tubo de 1,5 ml. A continuación, añadir 13 sal de solución de ThT (1 mM) seguido de agitación.
      2. Añadir alícuotas (200 ml) de solución proteica (250 oM) que contengan 20 oM de thT a cada pocto de una placa de 96 pocillos de fondo transparente y sellar la placa con cinta de sellado cristalina.
      3. Cargue la placa en un lector de placas de fluorescencia e incubar a 57 oC sin agitación.
      4. Mida la fluorescencia ThT a intervalos de 30 min, con excitación a 440 nm y emisión a 485 nm, durante 12 h.
        NOTA: Agitar la placa durante 5 s antes de cada medición.
    4. Formación in vitro de fibrilación amiloide HEWL:
      1. Añadir alícuotas (200 ml) de solución proteica (1 mM) que contengan 20 oM de thT a cada pocto de una placa de 96 pocillos de fondo transparente y sellar la placa con cinta de sellado cristalina.
      2. Cargue la placa en un lector de placas de fluorescencia e incubar a 57 oC sin agitación.
      3. Mida la fluorescencia ThT a intervalos de 2 h, con excitación a 440 nm y emisión a 485 nm, durante 4 días.
        NOTA: Para las tres proteínas, la formación de fibrilar amiloide se confirma mediante microscopía de fuerza atómica(Figura 2B).

6. Tratamiento de las mitocondrias con fibrillas amiloideas, ensayo de liberación de MDH y medición ROS

  1. Incubación de mitocondrias aisladas con fibrillas amiloideas
    1. Encienda la centrífuga y el baño de agua tibia y ajuste a 4 oC y 30 oC, respectivamente.
    2. Usando IF, diluir el homogeneato mitocondrial a una concentración final de 1 mg/ml.
    3. Preparar dos series de tubos de 1,5 ml que contienen homogenetes mitocondriales (una serie para el ensayo de liberación de MDH y otra para la medición de ROS mitocondrial).
    4. Añadir alícuotas de fibrillas frescas o amiloideas de la sinucleina, la insulina bovina o HEWL (a concentraciones finales de 5 m, 10 m, 20 m y 25 m; utilizar PBS o tampón de glicina como control) para homogeneizar mitocondrial (volumen final de 200 ol) (véase la Tabla 1, Tabla 2 , y la Tabla 3) seguido de agitar suavemente la solución con una pipeta.
      NOTA: Para el ensayo de liberación de MDH, utilice Triton X-100 (a una concentración final de 0,5% [v/v]) como control positivo para la máxima liberación de enzimas.
    5. Incubar tubos que contengan suspensiones mitocondriales durante 30 minutos en baño de agua tibia a 30 oC.
    6. Mida la liberación mitocondrial de MDH y el contenido de ROS como se describe en las secciones 6.2 y 6.3.
  2. Ensayo de liberación de MDH mitocondrial
    1. Centrifugar los homogenetes mitocondrialines incubados a 16.000 x g durante 15 min, luego recoger cuidadosamente los sobrenadores resultantes para evaluar la actividad de MDH mitocondrial como se describe en la sección 4.
    2. Calcule la liberación de MDH como una fracción del efecto máximo (Triton X-100) de la siguiente manera:

figure-protocol-2

  1. Medición de ROS mitocondrial
    NOTA: El contenido de ROS mitocondrial se determina con el precursor fluorogénico sensible a la oxidación dihidrodiclorocarboxboxyfluoresceína diacetato (DCFDA)22.
    1. Preparar soluciones para la medición mitocondrial ROS. Preparar una solución dcFDA de 50 m disolviendo en metanol (preparar fresco) y una solución de succinato de 200 mM disolviéndose en DW.
    2. Pipetear 191 ml de homogeneato mitocondrial incubado a cada pocal de una placa de 96 pocillos y añadir 4 ml de DCFDA de 50 oM (concentración final de 1 m) y 5 ml de succinato de 200 mM (concentración final de 5 mM).
    3. Incubar la placa durante 30 minutos en un baño de agua tibia a 30oC mientras se agita suavemente.
    4. Cargue la placa en un lector de placas de fluorescencia y mida la intensidad de la fluorescencia, con excitación a 485 nm y emisión a 530 nm.

7. Análisis estadístico

  1. Realice todos los experimentos de al menos 2x o 3x con ensayos triplicados y realice pruebas estadísticas apropiadas. Aquí, los resultados se presentan como media - SD, y la prueba temparejada de un estudiante se utilizó para calcular la significación estadística. Los valores P inferiores a 0,01 y 0,05 se consideraron estadísticamente significativos (*p < 0,05; **p < 0,01).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo describe un modelo para estudiar las interacciones de la fibrilla amiloide con las mitocondrias cerebrales de rata como un modelo biológico in vitro. Para la preparación mitocondrial, se utilizó un medio de gradiente de densidad del 15% (v/v) para eliminar la mielina como contaminación importante del tejido cerebral14. Como se muestra en la Figura 1A,la centrifugación a 30.700 x g produjo dos bandas distintas de material, la mielina

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una gran cantidad de resultados experimentales apoya la hipótesis de que la citotoxicidad de los agregados fibrilares se asocia significativamente con su capacidad para interactuar y permeabilizar las membranas biológicas4,5. Sin embargo, la mayoría de los datos se basan en bicapas de lípidos artificiales que no reflejan necesariamente las propiedades intrínsecas de las membranas biológicas, que son estructuras heterogéneas con una amplia variedad de fosfolípidos...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación del Instituto de Estudios Avanzados en Ciencias Básicas (IASBS), Zanjan, Irán.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2′,7′-Diclorodihidrofluoresceína diacetato Sigma35845
Sulfato de amonioMerck1012171000
Negro Placa de 96 pocillosCorning
Black Placa de 96 pocillos de fondo transparenteCorning
SigmaI6634
Suero bovino Albúmina (BSA)SigmaA2153
BSA esencialmente libre de ácidos grasosSigmaA6003
CentrífugaSigma
Cinta de sellado transparenteCorning
CuSO4Sigma451657
Bolsa de diálisis (recortada 2 KDa)SigmaD2272
Homogeneizadorde onzasPotter Elvehjem
EDTASigmaE9884
Lector de placas de fluorescenciaBioTek
Espectrofotómetro de fluorescenciaCary Eclipse VARIAN
FolinMerckF9252
GlycineSigmaG7126
GuillotinaHecho en Irán
HClMerckH1758
Clara de huevo de gallina lisozima (HEWL)SigmaL6876
Na2CO3SigmaS7795
NaH2PO4SigmaS7907
NaOHMerckS8045
OxaloacetatoSigmaO4126
PercollGE Healthcare
Tampón de fosfato salino (PBS)SigmaCS0030
PMSFSigmaP7626
Tartrato de sodio y potasioSigma217255
Cubeta de cuarzoSigma
Espectrofotómetroanalytik jenaSPEKOL 2000 modelo
SuccinatoSigmaS2378
SacarosaMerck1076871000
ThermomixerEppendorph
Tioflavina TSigmaT3516
Tris-HClMerck1082191000
Triton X-100SigmaT9284
TriptonaQUELAB
Baño de aguaMemmert
Extracto de levaduraQUELAB
β-NADHSigmaN8129
Insulina bovina

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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