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Análisis del contenido de gotas de lípidos en fesión y levaduras en ciernes mediante el procesamiento automatizado de imágenes

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DOI:

10.3791/59889

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17 de julio de 2019

 ,  ,  , 
1Faculty of Science, Charles University

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos una implementación de MATLAB de detección automatizada y descripción cuantitativa de gotas de lípidos en imágenes de microscopía de fluorescencia de fission y células de levadura en ciernes.

Resumen

El metabolismo de los lípidos y su regulación son de interés tanto para las ciencias básicas y aplicadas de la vida como para la biotecnología. En este sentido, varias especies de levadura se utilizan como modelos en la investigación metabólica de lípidos o para la producción de lípidos industriales. Las gotas lipídicas son cuerpos de almacenamiento altamente dinámicos y su contenido celular representa una lectura conveniente del estado metabólico lipídico. La microscopía de fluorescencia es un método de elección para el análisis cuantitativo de gotas de lípidos celulares, ya que se basa en equipos ampliamente disponibles y permite el análisis de gotas de lípidos individuales. Además, el análisis microscópico de imágenes se puede automatizar, lo que aumenta considerablemente el rendimiento general del análisis. Aquí, describimos un flujo de trabajo experimental y analítico para la detección automatizada y descripción cuantitativa de gotas de lípidos individuales en tres especies de levaduras de modelo diferentes: las levaduras de fission Schizosaccharomyces pombe y Schizosaccharomyces japonicus, y la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae. Las gotas de lípidos se visualizan con BODIPY 493/503, y el dextran fluorescente impermeable a la celda se agrega a los medios de cultivo para ayudar a identificar los límites celulares. Las células se someten a microscopía de epifluorescencia 3D en canales verdes y azules y las imágenes de la pila z resultantes se procesan automáticamente mediante una canalización matlab de MATLAB. El procedimiento genera datos cuantitativos enriquecidos sobre el contenido de gotas de lípidos celulares y las características individuales de las gotas de lípidos en un formato tabular adecuado para análisis posteriores en hojas de cálculo principales o paquetes estadísticos. Proporcionamos análisis de ejemplo del contenido de gotas de lípidos bajo diversas condiciones que afectan el metabolismo celular de los lípidos.

Introducción

Los lípidos desempeñan un papel crucial en la energía celular y el metabolismo del carbono, la síntesis de componentes de membrana y la producción de sustancias bioactivas. El metabolismo de los lípidos se ajusta según las condiciones ambientales, la disponibilidad de nutrientes y la fase1del ciclo celular. En los seres humanos, el metabolismo de los lípidos se ha conectado a enfermedades, como la obesidad, la diabetes tipo II y el cáncer2. En la industria, los lípidos producidos por microorganismos, como las levaduras, representan una fuente prometedora de combustibles diésel renovables3. Las células almacenan lípidos neutros en las llamadas gotas lipídicas (LD). Estos cuerpos evolutivamente conservados se componen de triacilgliceroles, ésteres de esteril, una monocapa fosfolípido externa y proteínas asociadas1. Los LM se originan en el retículo endoplasmático, ejercen dinámicas de ciclo celular o fase de crecimiento, y son importantes para la homeostasis lipídica celular1. El número de LD y la morfología se pueden utilizar como un proxy conveniente al analizar el metabolismo de los lípidos bajo diversas condiciones de crecimiento o al examinar un panel de mutantes. Dada su naturaleza dinámica, las técnicas capaces de analizar las propiedades de los DNl individuales son de particular interés en los estudios del metabolismo lipídico.

Varias especies de levadura se han utilizado para describir las vías metabólicas relacionadas con los lípidos y su regulación, o se utilizan en la biotecnología para producir compuestos o combustibles interesantes1. Además, para levaduras modelo, tales como la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae o la levadura de fismo distantemente relacionada Schizosaccharomyces pombe, se encuentran disponibles bibliotecas de cepas de eliminación en todo el genoma que se pueden utilizar para un alto rendimiento pantallas4,5. Recientemente la composición y dinámica de LD se han descrito en S. pombe6,7,8,9, y mutantes relacionados con el metabolismo lipídico se han aislado en el modelo emergente de levadura Schizosaccharomyces japonicus10.

Numerosas técnicas están disponibles para estudiar el contenido y la dinámica de LD. La mayoría emplea algún tipo de tinción de Lutsisconlos con colorantes lipofílicos como Nile Red o BODIPY 493/503. Este último muestra espectros de excitación y emisión más estrechos, y una mayor especificidad hacia los lípidos neutros (LD) en comparación con los fosfolípidos (membranas)11. Los métodos fluorimétricos y de citometría de flujo se han utilizado con éxito en varias especies de hongos para descubrir genes y condiciones de crecimiento que afectan al contenido de lípidos de almacenamiento12,13,14,15. Si bien estos métodos son adecuados para aplicaciones de alto rendimiento, no pueden medir el número y la morfología de los D Individuales en las células, lo que puede diferir drásticamente entre las condiciones de crecimiento y los genotipos. La dispersión coherente de Raman o la microscopía holográfica digital son métodos sin etiquetas que producen datos a nivel de LD, pero requieren equipos especializados y costosos16,17,18. La microscopía de fluorescencia, por otro lado, puede proporcionar datos detallados sobre el contenido de LD, al tiempo que utiliza instrumentos comúnmente disponibles y herramientas de software de análisis de imágenes. Existen varios flujos de trabajo de análisis que cuentan con varios grados de sofisticación y automatización en la detección de celdas/LD a partir de datos de imagen, y están optimizados para diferentes tipos de celdas, como células metazoanas con grandes LD19,20 , 21, o levaduras en ciernes17,22,23. Algunos de estos enfoques solo funcionan en 2D (por ejemplo, en imágenes de proyección máxima), lo que puede no describir de forma fiable el contenido de LD celular. Hasta nuestro conocimiento, no existen herramientas para la determinación del contenido de LD y la morfología a partir de datos microscópicos de levadura de fesión. El desarrollo de análisis automatizados y robustos a nivel de LD traería mayor sensibilidad y mayor potencia estadística, y proporcionaría información rica sobre el contenido de lípidos neutros, idealmente en múltiples especies de levaduras.

Hemos desarrollado un flujo de trabajo para el análisis de contenido LD a partir de imágenes de microscopía de fluorescencia 3D de células de levadura. Las celdas vivas se tiñen con BODIPY 493/503 y Cascade Blue dextran para visualizar los DD y determinar los límites de las celdas, respectivamente. Las células se inmovilizan en diapositivas de vidrio y se someten a imágenes de pila z utilizando un microscopio de epifluorescencia estándar. Las imágenes son procesadas por una canalización automatizada implementada en MATLAB, un paquete ampliamente utilizado (comercial) para análisis estadísticos. La canalización realiza el preprocesamiento de imágenes, la segmentación (células frente al fondo, la eliminación de celdas muertas) y la identificación de LD. Los datos enriquecidos a nivel de LD, como el tamaño de LD y la intensidad de la fluorescencia, se proporcionan en un formato tabular compatible con las principales herramientas de software de hoja de cálculo. El flujo de trabajo se utilizó con éxito para determinar el impacto de la disponibilidad de la fuente de nitrógeno en el metabolismo de los lípidos en S. pombe24. Ahora demostramos la funcionalidad del flujo de trabajo en S. pombe, S. japonicus y S. cerevisiae,utilizando condiciones de crecimiento o mutantes que afectan el contenido de LD celular.

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Protocolo

1. Preparación de soluciones y medios de comunicación

  1. Prepare la solución de tinción de lípidos.
    1. Para preparar la solución de tinción de lípidos en stock disolver 10 mg de BODIPY 493/503 en 10 ml de DMSO anhidro (concentración final 1 mg/ml). Disolver todo el contenido de un vial de 10 mg de BODIPY 493/503 para evitar la pérdida de material durante el pesaje.
      PRECAUCION: La DMSO puede pasar a través de la piel. Use el equipo de protección personal adecuado.
    2. Preparar la solución de tinción de lípidos de trabajo mezclando 100 l de la solución de material de 1 mg/ml DE BODIPY 493/503 y 900 ml de DMSO anhidro (concentración final 0,1 mg/ml).
    3. Aliquot el stock y las soluciones de trabajo, y almacenar a -20 oC.
      NOTA: Disolución BODIPY 493/503 es estable durante varios años a -20 oC. Sin embargo, la solución tiene que estar protegida de la humedad y la luz.
  2. Para preparar la solución de stock para la visualización de los límites celulares, disolver 25 mg de dextran Cascade Blue (vial entero) en 2,5 ml de agua desionizada (concentración final 10 mg/ml). Aliquot la solución de stock y almacenar a -20 oC protegido de la luz.
  3. Para preparar la solución de recubrimiento deslizante del microscopio, disolver 5 mg de lectina de soja en 5 ml de agua desionizada (concentración final 1 mg/ml). Aliquot la solución de lectina y almacenar a -80 oC.
    NOTA: La solución de lectina es estable durante varios años a -80 oC. Las aliquots actualmente en uso pueden almacenarse a -20 oC.
  4. Preparar los medios de cultivo.
    1. Para preparar 400 mL de complejo medio de cultivo SI para S. pombe y S. japonicus, disolver 2 g de extracto de levadura y 0,1 g de suplementos de SP (si es necesario para mutantes auxotrópicos) en 340 ml de agua desionizada en una botella de 500 ml y autoclave. Añadir 60 ml de 20% (p/v) de glucosa autoclave o esterilizada por filtro por separado en condiciones asépticas.
    2. Para preparar 400 mL de medio de cultivo EMM definido para S. pombe y S. japonicus, disolver 4,9 g de caldo EMM sin dextrosa en 360 ml de agua desionizada en una botella de 500 ml y autoclave. Añadir 40 ml de 20% (p/v) de glucosa autoclave o esterilizada por filtro por separado en condiciones asépticas.
      NOTA: Para consultar las directrices generales sobre el cultivo de S. pombe y S. japonicus, véase25 y26, respectivamente.
    3. Para preparar 300 mL de complejo medio de cultivo YPAD para Saccharomyces cerevisiae,disolver 3 g de extracto de levadura, 6 g de peptona y 30 mg de sulfato de adenina en 270 ml de agua desionizada en una botella de 500 ml y autoclave. Añadir 30 ml de 20% (p/v) de glucosa autoclave o esterilizada por filtro por separado en condiciones asépticas.
    4. Para preparar 300 ml de medio mínimo definido para S. cerevisiae, disolver 2 g de base de nitrógeno de levadura (sin aminoácidos) en 270 ml de agua desionizada en una botella de 500 ml y autoclave. Añadir 30 ml de 20% (p/v) de glucosa autoclave o esterilizada por filtro por separado en condiciones asépticas.
      NOTA: Para consultar las directrices generales sobre el cultivo de S. cerevisiae, véase27.

2. Cultivo celular

  1. Crecimiento de S. pombe o S. japonicus a fase exponencial o estacionaria temprana.
    1. Por la mañana, inocular 5 ml de medio YES con biomasa de levadura de festeja fresca. Incubar a 32oC con agitación (180 rpm) durante varias horas.
      NOTA: Para todos los cultivos, utilice frascos Erlenmeyer que tengan 10 veces el volumen de cultivo para garantizar una aireación adecuada. Algunos laboratorios prefieren cultivar levaduras de fissión a 30 oC, pero la temperatura de cultivo de 32 oC da como resultado tiempos de duplicación más cortos sin efectos perjudiciales para las células, reduciendo así el tiempo total necesario para realizar un experimento de25,28 .
    2. A última hora de la tarde del mismo día (después de al menos 6 horas de cultivo), diluir el cultivo con medio fresco de YES a un volumen de cultivo final de 10 ml para que alcance la densidad óptica deseada (OD) (o el número de células/ml) a la mañana siguiente, e incubar a 32oC con s rey (180 rpm). Es de ventaja conocer el tiempo de duplicación de cada cepa utilizada para determinar con precisión el factor de dilución (utilice la Ecuación 1).
      figure-protocol-1
      Donde elcultivo Ves el volumen de precultivo necesario para la dilución, Vfinal es el volumen total del nuevo cultivo (10 mL para cultivos estándar), ODfinal es la OD deseada para ser alcanzado el después de la mañana siguiente, lacorriente deOD es la DoD actualmente medida de la precultura, t es el momento del crecimiento celular hasta la cosecha, tlag es la duración de la fase de retraso (depende de las condiciones de laboratorio, se define empíricamente) y tDT es el tiempo de duplicación de la cepa.
      NOTA: Cuando se van a analizar las células de fase exponencial, no deje que los precultivos alcancen la fase estacionaria, ya que esto altera drásticamente la fisiología celular (incluido el contenido de LD) durante varias generaciones posteriores.
    3. En la mañana del día de la toma de imágenes, si el cultivo alcanzó un D.OD ligeramente más alto de lo requerido (en el caso de las células de fase exponencial), diluirlo con sies frescos y continuar la incubación durante al menos dos veces más de duplicación antes de la tinción de DDs. tinción (Sección 3).
  2. Crecimiento de S. cerevisiae a fase exponencial y estacionaria.
    1. Por la tarde, inocular 10 ml de medio YPAD con una pequeña cantidad de biomasa de levadura en ciernes frescae e incubar durante la noche a 30 oC con agitación (180 rpm).
    2. La mañana del día de la toma de imágenes, diluir el cultivo a 0,1 oD en 10 ml de medio YPAD y crecer hasta la DoD requerida (por ejemplo, OD 1 para la fase exponencial). Realice cualquier dilución de cultivo como se describe en el paso 2.1.2. Proceder a la tinción (Sección 3).

3. Tinción de gotas de lípidos

  1. Prepare un comprobante de cubierta del microscopio para cada muestra que se va a tomar una foto. Extienda 1 l de solución de recubrimiento deslizante en un resbalón de cubierta limpio utilizando el lado largo de una punta de pipeta colocada horizontalmente. Deje que la solución de recubrimiento se seque por completo y almacene los resbalones de la cubierta en un ambiente libre de polvo.
    NOTA: Los portaobjetos de vidrio y los cubreobjetos se pueden limpiar antes de su uso si es necesario. El procedimiento de limpieza consiste en lavar con detergente para lavar platos, enjuagar con agua, remojar durante la noche en ácido clorhídrico al 3% y lavar con agua destilada. Las diapositivas y los cubreobjetos limpios se almacenan en etanol puro hasta su uso.
  2. Mida el OD del cultivo celular o el número de celdas/ml, según sea necesario. Trate de alcanzar valores similares entre todas las cepas probadas para garantizar condiciones experimentales comparables.
  3. Pipetear 1 ml de cada cultivo celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Sólo para S. cerevisiae, agregue 5 sL de la solución de recubrimiento deslizante, vórtice brevemente e incubar a 30 oC con agitación durante 5 min.
  4. Añadir brevemente 1 l de la solución de tinción de lípidos a cada alícuota de cultivo y vórtice. A continuación, agregue brevemente 10 l de la solución de visualización de límites de celda y el vórtice.
    NOTA: No prepare soluciones premezcladas de ambas manchas, ya que esto conduce al enfriamiento por fluorescencia de BODIPY 493/503.
  5. Recoger las células por centrifugación (1.000 x g,3 min, RT) y eliminar casi todos los sobrenadantes (950 l). Resuspenda las células del sobrenadante restante.
  6. Pipetear 2 l de la suspensión de células densas sobre un resbalón de cubierta recubierto de lectina y colocarlo en un portaobjetos limpio del microscopio. Las celdas deben formar una monocapa. Proceder a la microscopía (Sección 4) lo más rápido posible para minimizar los artefactos en la toma de imágenes; proceso máximo de dos muestras a la vez.

4. Configuración del microscopio y las imágenes

  1. Optimice las condiciones de imagen.
    NOTA:     La configuración del microscopio requiere exposiciones prolongadas a fuentes de luz fuertes que podrían causar daños en la muestra y resultados de sesgo. Por lo tanto, configure las condiciones de creación de imágenes mediante una diapositiva de muestra dedicada que no se utilizará más para la cuantificación de LD.
    1. Concéntrese en las celdas utilizando contraste de fase o contraste de interferencia diferencial (DIC).
      NOTA: Las imágenes de contraste de fase o DIC se pueden tomar como referencia, pero no se utilizan durante el paso de análisis de imágenes automatizado.
    2. Establezca la configuración de la pila z para abarcar todo el volumen de la celda. La distancia vertical total depende del tamaño de la celda; el número de sectores ópticos depende de la apertura numérica del objetivo (función de dispersión de puntos en el eje z). Establezca el enfoque para que se mueva en relación con el plano focal central.
      NOTA: El número óptimo de rodajas a menudo es establecido por el software de control del microscopio y no necesita ser calculado manualmente. Las anchuras típicas de las células son de 3-5 m para S. pombe, 4-7 m para S. japonicus,y 3-7 m para S. cerevisiae.
    3. Para la imagen de los D, ajuste la intensidad de la luz y el tiempo de exposición en el canal verde (la excitación y el máximo de emisión de BODIPY son 493 y 503 nm, respectivamente).
      NOTA: BODIPY 493/503 es un fluorocromo muy brillante; sin embargo, puede blanquearse rápidamente con una intensidad lumínica demasiado fuerte. Además, los LU son móviles en células vivas, minimizando así el tiempo de exposición y capturando primero la pila z de canal verde completa (antes de cambiar al canal azul) para evitar artefactos borrosos. Además, tenga en cuenta el rango lineal de la cámara para la intensidad de la señal para evitar píxeles saturados.
    4. Para crear una imagen de los límites de las celdas, establezca la intensidad de la luz y el tiempo de exposición en el canal azul (la excitación y el máximo de emisión de la dextran Cascade Blue son 400 y 420 nm, respectivamente).
      NOTA: La intensidad de la señal en el canal azul es necesaria para la segmentación de la imagen, pero no se utiliza para la cuantificación LD en sí. Por lo tanto, los ajustes óptimos en este canal no son cruciales para el análisis.
    5. Si es posible, cree un flujo de trabajo experimental automatizado en el software de control del microscopio para facilitar la toma de imágenes de varias muestras en condiciones estandarizadas.
  2. Una vez optimizadas las condiciones de imagen, se utilizarán muestras de imágenes para la cuantificación. Concéntrese en las celdas e infórmelas en canales verdes y azules como se describe en el paso 4.1.
    NOTA: Todas las imágenes deben adquirirse utilizando la misma configuración para permitir la comparación entre muestras. Imagen de varios campos de visión por muestra para obtener datos sólidos y representativos.
  3. Guarde las imágenes de la pila z del canal azul y verde como archivos TIFF multicapa de 16 bits (es decir, dos archivos por campo de visión). Incluya las palabras "verde" o "azul" en los nombres de archivo correspondientes. Continúe con el análisis de imágenes (Sección 5).

5. Análisis de imagen

  1. Compruebe visualmente la calidad de las imágenes adquiridas.
    1. Abra imágenes microscópicas en ImageJ29,30 u otro software de análisis de imágenes adecuado.
    2. Elimine las pilas de imágenes que contengan un número considerable de celdas que se movieron durante la adquisición (y, por lo tanto, crearon artefactos de desenfoque).
    3. Elimine las pilas de imágenes que contengan partículas no celulares altamente fluorescentes en el canal azul (por ejemplo, suciedad en la diapositiva del microscopio o resbalón de la cubierta, impurezas en el medio de cultivo).
      NOTA: Los objetos no celulares muy brillantes en el canal azul pueden crear artefactos de detección de células o pueden interferir con la detección de celdas en sus proximidades.
    4. Elimine las pilas de imágenes que contengan una gran proporción de células muertas (es decir, células con mayor fluorescencia azul en comparación con las células vivas).
      NOTA: Mientras que la presencia de una pequeña proporción de células muertas en la muestra no suele ser un problema y estas células se descartan automáticamente durante el análisis, algunas células muertas o moribundas ocasionalmente pueden ser reconocidas como células vivas por el algoritmo de segmentación y por lo tanto sesgar los resultados reportados.
  2. Analice imágenes en el software MATLAB.
    1. Cree una carpeta principal y copie todos los scripts de MATLAB en esta ubicación.
    2. Cree una subcarpeta ("pombe", "cerevisiae" o "japonicus") y copie los archivos de imagen TIFF de entrada en esta ubicación.
    3. Inicie MATLAB, abra el script MAIN.m y ejecútelo. En el menú seleccione las especies de levadura a analizar e inicie el procesamiento de imágenes.
      NOTA: Algunos de los parámetros necesarios para la detección de celdas y LD están predefinidos para la especie en particular, otros se determinan automáticamente durante el procesamiento de imágenes. Los valores preestablecidos se determinaron empíricamente y dependen de varios factores, como la ampliación objetiva, el tipo de cámara y la sensibilidad, y la configuración de imágenes. Si es necesario, los usuarios pueden editar los archivos de script para cambiar los ajustes preestablecidos específicos del organismo para reflejar mejor su configuración experimental. Es decir, durante el reconocimiento de celdas los tamaños de objeto aceptables se indican mediante los parámetros "minArea" y "maxArea", y la fracción mínima del volumen relleno dentro de los límites del objeto se proporciona mediante el parámetro "Solidity". Para el reconocimiento de LD, el umbral de brillo se da por el parámetro "th" (su valor se ve afectado principalmente por la profundidad de bits de la imagen y la intensidad de la señal de fluorescencia), y el tamaño máximo aceptable LD lo da el parámetro "MaxArea".
    4. Inspeccione y procese los archivos de salida según sea necesario utilizando un editor de hojas de cálculo o un paquete estadístico; el flujo de trabajo genera archivos CSV separados por punto y coma y archivos TIFF segmentados con objetos de celda y LDs detectados.
      NOTA: El flujo de trabajo segmenta las imágenes en objetos de fondo y de celda, donde cada objeto de celda puede estar compuesto de varias celdas adyacentes. Por lo tanto, la salida en los archivos "xxxx_cells.csv" no representa datos de una sola celda y solo debe utilizarse para calcular métricas por unidad de volumen de celda.

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Resultados

Todo el procedimiento se resume en la Figura 1 para las levaduras de fisión (el flujo de trabajo de levadura en ciernes es análogo), y a continuación proporcionamos ejemplos de cómo el flujo de trabajo se puede utilizar para estudiar el contenido de LD en tres especies de levadura diferentes en diversas condiciones conocidas para afectar el contenido de LD celular. Cada ejemplo representa un único experimento biológico.

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Discusión

La comprensión del metabolismo lipídico y su regulación es importante tanto para la biología básica, como para las aplicaciones clínicas y biotecnológicas. El contenido de LD representa una lectura conveniente del estado del metabolismo de los lípidos de la célula, siendo la microscopía de fluorescencia uno de los principales métodos utilizados para la determinación del contenido de LD. El protocolo presentado permite la detección automatizada y la descripción cuantitativa de los D Individuales en tres especies de levadu...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por las becas de la Universidad Charles PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 y SVV 260310. Agradecemos a Ond-ej éebesta por la ayuda con la microscopía y el desarrollo de la canalización de análisis de imágenes. Agradecemos al laboratorio de ReGenEx por las cepas de S. cerevisiae, y al laboratorio de JapoNet y Hironori Niki para las cepas de S. japonicus. La cepa ppc1-88 fue proporcionada por The Yeast Genetic Resource Center Japan. La microscopía se realizó en el Laboratorio de Microscopía Confocal y fluorescencia cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional y el presupuesto estatal de la República Checa (Proyecto no. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 y CZ.2.16/3.1.00/21515).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cámara CCD monocromática de 12 bits Hamamatsu ORCA C4742-80-12AGHamamatsu o equivalente
Sal de hemisulfato de adenina, ≥ 99%MerckA9126-25G 
BODIPY 493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno)Thermo Fisher ScientificD3922para la tinción de lípidos neutros
D-(+) - Glucosa, ≥ 99.5%MerckG7021 
Dextrano, Azul en cascada, 10.000 MW, Aniónico, Lisina fijableThermo Fisher ScientificD1976para la tinción negativa de células
Dimetilsulfóxido, ≥ 99.5%MerckD4540o pureza superior, mantenga anhidro en tamices moleculares
Caldo EMM sin dextrosaPara medioPMD0405medio también se puede preparar a partir de componentes individuales
Fiji/ImageJ softwareNIH o equivalente; para la inspección visual de datos microscópicos
Cubreobjetos de alta precisión, 22 mm x 22 mm, n.º 1,5VWR630-2186utilizan cualquier cubreobjetos # 1,5
Image Processing Toolbox for MATLAB, versión 10.0Mathworks  
Lectina de Glycine max (soja)MerckL1395para la inmovilización celular en portaobjetos
Software MATLAB, versión 9.2Mathworks  
Portaobjetos de microscopio, 26 mm x 76 mm, 1 mm de espesorKnittel GlassL762601.2utilice cualquier portaobjetos de microscopio que se adapte a su platina de microscopio, limpie a fondo antes de cargar las células
Microscopio Olympus CellR con movimiento automático del objetivo del eje zOlympus o equivalente
Conjunto de filtros PentabandSemrockF66-985claro, los canales verde y azul son suficientes
Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4Mathworks  
Suplementos SPFormediumPSU0101 
Ordenador de oficina estándar capaz de ejecutar MATLAB   
Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, versión 11.1Mathworks  
Peptona universal M66 para microbiologíaMerck1070431000 
Objetivo UPLSAPO 60XOOlympus o equivalente
Extracto de levaduraFormediumYEA03 
Base nitrogenada de levadura sin aminoácidosFormediumCYN0405 
campo

Referencias

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